色谱技术课件

色谱技术

色谱技术（分配色谱）概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同（由于亲和力差异），经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），达到分离的目的。色谱分离方法的分类色谱分离方法很多，种类有四、五十种但常用于生物大分子分离的色谱方法，按机理分，有以下几种：吸附色谱分配色谱离子交换色谱凝胶色谱色谱系统的基本组成色谱分离的基本概念分配系数可由Langmuir方程得出Kd---分配系数q、c---溶质在固相和液相中的浓度保留时间（tR）和保留体积（VR）反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一阻滞因子Rt阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相Kd=0）的迁移率之比其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小洗脱体积色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异色谱柱的理论塔板数、塔板高度反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系理论塔板数的计算方法：N---理论塔板数tR---保留时间W1/2---半峰宽Wb---峰底宽度理论塔板高度：L---柱长吸附色谱原理:利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力(范德华力，包括色散力、诱导力、定向力以及氢键)的差异而实现分离关键要素：吸附剂和展开剂的选择吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺等，均含有不饱和的氧原子或氮原子以及能够形成氢键的基团，如-OH和-NH2吸附色谱常用的吸附剂：氧化铝硅胶活性炭纤维素聚酰胺硅藻土物理吸附基本规律

（2）被分离的物质与吸附剂、洗脱剂共同构成吸附过程中的三要素，彼此紧密相连。（1）物理吸附过程一般无选择性，但吸附强弱大体遵循“相似者易于吸附”的经验规律。硅胶、氧化铝因均为极性吸附剂,故有以下特点:

(1)对极性物质具有较强的亲和能力,极性强的溶质将被优先吸附。(2)溶剂极性越弱,则吸附剂对溶质将表现出较强的吸附能力。溶剂极性增强,则吸附剂对溶质的吸附能力即随之减弱。 (3)溶质即使被硅胶、氧化铝吸附,但一旦加入极性较强的溶剂时,又可被后者置换洗脱下来。活性炭因为是非极性吸附剂,故与硅胶、氧化铝相反,对非极性物质具有较强的亲和能力,在水中对溶质表现出强的吸附能力。溶剂极性降低,则活性炭对溶质的吸附能力也随之降低。故从活性炭上洗脱被吸附物质时,洗脱溶剂的洗脱能力将随溶剂极性的降低而增强。

极性及其强弱判断

极性强弱是支配物理吸附过程的主要因素。所谓极性乃是一种抽象概念,用以表示分子中电荷不对称(asymmetry)的程度，并大体上与偶极矩(dipolemoment)、极化度（polarizability）及介电常数（dielectricconstant）等概念相对应。

（1）官能团的极性按下列官能团的顺序增强：

—CH2—CH2—，—CH2=CH2—，—OCH3，—COOR，

>C=O，—CHO，—NH2，—OH，—COOH

（2）化合物的极性则由分子中所含官能团的种类、数目及排列方式等综合因素所决定。（3）、大体上溶剂极性的大小可以根据介电常数(ε)的大小来判断。介电常数越大，则极性越大。一般溶剂的介电常数按下列顺序增大：

环己烷（1.88），苯（2.29），无水乙醚（4.47），氯仿（5.20），乙酸乙酯（6.11），乙醇（26.0），甲醇（31.2），水（81.0）

吸附柱色谱法用于物质的分离

吸附色谱法中硅胶、氧化铝柱色谱在实际工作中用得最多。有关注意事项如下:

(1)硅胶、氧化铝吸附柱色谱过程中,吸附剂的用量一般为试样量的30~60倍。试样极性较小、难以分离者,吸附剂用量可适当提高至试样量的100~200倍。

据此可选用适当规格的色谱管,实验室中常用色谱管的规格如下所示，其高度与直径比约为(15:1)~(20:1)。

色谱管内径(cm):0.51.01.52.03.04.06.08.010

长度

(cm):10

1530

45607590120150(2)硅胶、氧化铝吸附柱色谱,应尽可能选用极性小的溶剂装柱和溶解试样,以利试样在吸附剂柱上形成狭窄的原始谱带。

(3)洗脱用溶剂的极性宜逐步增加,但跳跃不能太大。实践中多用混合溶剂,并通过巧妙调节比例以改变极性,达到梯度洗脱分离物质的目的。

(4)为避免发生化学吸附,酸性物质宜用硅胶、碱性物质则宜用氧化铝进行分离。

(5)如液-液分配色谱中所述,吸附柱色谱也可用加压方式进行,溶剂系统可通过

TLC进行筛选。

展开剂的选择展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力越大因此，可以根据实验结果调整展开剂的极性以获得最佳的分离的效果展开剂选择的原则：（1）对被分离组分应具有一定的解吸附能力，极性应比被分离物质的极性略小（2）展开剂应对被分离物质具有一定的溶解能力常用展开剂的洗脱能力及极性比较见书上242~243一般吸附色谱的操作程序根据要分离组分的性质（包括极性、分子量、分子结构）选择合适的固定相和流动相吸附操作：选择合适的操作条件（温度、pH值、流速），进行装柱、平衡、上样，测定穿透样品含量以调整操作参数洗脱：采用有机溶剂洗涤、调节pH值以及体系离子强度，最大限度地回收目标产物分配色谱原理：利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离的方法要素：固定相、载体、流动相载体：通常为惰性材料，能吸附固定相液体载体种类：硅胶硅藻土纤维素葡聚糖凝胶固定相：通常选取各组分溶解度大的溶剂作为固定相详见P247流动相可以是极性的（反相色谱法），也可以是非极性的（正相色谱）

*反相色谱固定相是非极性的,流动相是极性的HPLCHPLC色谱反相液相色谱反相液相色谱分离多肽和蛋白质使基于蛋白质的疏水性，因此通常采用非极性的烷基固定相作为填料，其表面化学性质和流动相的选择应最大限度地满足疏水的要求通常在流动相中加入离子对试剂（三氟乙酸）来增大蛋白质和多肽的疏水性载体：微粒多孔硅胶（粒径5μm~20μm）

HypersilSpherosilXOB075固定相：C18、C8烷基链，C8适于分离蛋白质

C18适于分离核酸苯基流动相的选择通常采用有机溶剂，乙腈、异丙醇、正丙醇和四氢呋喃离子交换色谱以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂作为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法常用的离子交换树脂葡聚糖凝胶型

DEAE-SephadexA-25，QAE-SephadexA-25，CM-SephadexC-25，SP-SephadexC-25纤维素系列离子交换剂

DEAE-SephacelCellex系列琼脂糖系列离子交换剂

Sepharose系列SepharoseCL-6B,Sepharose

Bio-GelA系列交联琼脂糖离子交换剂ExpandedBed分子筛凝胶色谱在样品通过一定孔径的凝胶固定相时，由于流经体积的不同，使不同相对分子量的组分得以分离优点： 操作简便 分离效果好，重复性高，回收率高 分离条件温和 应用广泛适用于生物大分子的初级分离，脱盐 分辨率低分子筛凝胶色谱原理出柱顺序：按分子由大到小顺序先后流出并得到分离。

常用的溶剂：①碱性水溶液（0.1mol/LNH4OH）含盐水溶液（0.5mol/LNaCl等）②醇及含水醇，如甲醇、甲醇—水③其他溶剂：如含水丙酮，甲醇-氯仿Desaltingproteinsproteinssalts凝胶色谱填料葡聚糖凝胶SephadexG-系列聚丙烯酰胺凝胶

Sephacryl系列琼脂糖凝胶Sepharose系列Superose系列疏水作用层析

根据疏水作用分离生物大分子MechanismofHIC亲和色谱（Affinitychromatography）载体活化、配基连接、吸附、洗脱Competitiveelution蛋白质分离常用的色谱方法免疫亲和层析 属于吸附色谱中的一种，利用抗原-抗体作用的高度专一性以及较强的吸附力，实现特殊蛋白质的分离免疫亲和层析介质的获得：（1）获得抗体（2）抗体连接到载体上疏水层析 在载体表面连接上疏水的直链碳链或其他疏水基团，如苯基，可以与蛋白质的某些疏水基团相互作用，从而实现多组分的分离。操作要点 蛋白质的局部变性 洗脱采用逐步降低盐浓度的方法进行离子交换色谱是最常用的蛋白质分离手段操作要点：由于蛋白质是两性电解质，在不同的pH值下，其解离程度是不同的，因此既可以采用阳离子交换，也可以用阴离子交换，可视具体情况而定由于蛋白质的极性基团很多，为了避免洗脱困难，通常采用弱阳或弱阴离子交换剂适当调节缓冲溶液的pH值，使蛋白质适当解离，通常采用的pH值靠近其等电点（不是等电点）缓冲溶液的离子强度不能过高，通常在10~20mmol层析方案的确定，需要视试验情况作适当调整洗脱方式：pH梯度离子强度梯度纸层析是一种常用的快速分离、鉴定方法，可用于定性分析以及确定分离方案，但一般不用于定量分析介质：滤纸操作方法：将试样溶于适当溶剂中，点样于滤纸的一端；选用适当的展开剂，借助毛细管现象从点样的一端向另一端流动，展开结束后，取下滤纸，晾干，染色显迹展开剂的选择展开剂可以是单一溶剂，也可以是混合溶剂常用的氨基酸纸层析体系中使用的展开剂为：正丁醇-甲酸-水（15：3：2）展开方式：上行色谱下行色谱径向色谱纸层析和薄层层析分离过程

纸层析和薄层层析也属于色谱分析法。但与其它色谱方法不同的是在分离过程中一般不使用动力源。

纸层析和薄层层析流动相的移动是依靠毛细作用。将试样点在色谱滤纸或层析板的一端，并将该端浸在作为流动相的溶剂（常称之为展开剂）中，随着溶剂向上的移动，经过试样点时，带动试样向上运动。薄层色谱法将固定相涂布在惰性固体上，形成薄层进行色谱分离的方法常用的固定相有：硅胶和氧化铝优点：设备简单、操作方便快速显色方式多，如可以选用浓硫酸等进行显色灵敏度高（较纸层析）可以大量制备操作技术1.层析纸和层析板特制的色层滤纸。按需要剪裁成长条形（或筒型）。层析板是用专门的涂布器把浆状的吸附剂（硅胶或氧化铝，200～250目）均匀地涂在长条形玻璃板上（厚度0.15～0.5mm）。干燥后即可使用。2.展开剂

由一种或多种溶剂按一定比例组成。如用纸层析分离氨基酸时，常用的展开剂组成和配比为：正丁醇：乙酸：水=4：1：1。3.点样

用微量注射器或玻璃毛细管吸取一定量试样点在原点上。试样点的直径一般应小于5mm。可并排点多个试样同时展开。4.显色、检测

有些组份在紫外光照射下产生荧光，可在紫外灯下用铅笔将组份斑点描绘出来。常用的显色方法有喷洒显色剂、碘蒸气熏或氨水熏等。特点及应用

平板色谱简单、方便、及操作费用低，可以在一块层析板上同时展开多个试样及将多条滤纸同时展开。