2026届新高考生物冲刺复习基因的基本操作程序

2026届新高考生物冲刺复习基因工程的基本操作程序①目的基因的筛选与获取②基因表达载体的构建(核心)③将目的基因导入受体细胞④目的基因的检测和鉴定重组DNA分子旧知识回顾：获取目的基因的方法①

目的基因；②通过构建

来获取目的基因；③常用

特异性地快速扩增目的基因。人工合成基因文库PCR获得了目的基因后能不能直接将目的基因导入受体细胞，为什么？思考提示：不能，原因：①游离的DNA进入细胞后，一般会

；②即使可以进行转录和翻译，游离的DNA也无法跟着

进行复制，导致子代细胞中

。直接被分解细胞分裂不再含有目的基因00第2步

基因表达载体的构建【知识扩展】原核细胞的基因结构及表达模式图①

编码区：

转录相应的mRNA，

编码(翻译)出蛋白质的DNA区段。②非编码区：

转录相应的mRNA，

编码(翻译)出蛋白质的DNA区段。注：非编码区含有能调控遗传信息表达的DNA序列。能能不能不能00【知识扩展】真核细胞的基因结构及表达模式图【注意】不同于原核生物的基因，真核生物的编码区是

。又可分为：①外显子：

转录相应的mRNA，

编码蛋白质的DNA序列。

②内含子：

转录相应的mRNA，

编码蛋白质的DNA序列。能能能不能不连续，有间隔的00基因工程的基本操作程序00重组DNA分子①目的基因的筛选与获取②基因表达载体的构建③将目的基因导入受体细胞④目的基因的检测和鉴定★核心工作基因表达载体的构建（基因工程的核心工作）021.基因表达载体构建的目的：①让目的基因在受体细胞中

，并且可以遗传给下一代。②同时使目的基因能够

和

。2.基因表达载体的组成：稳定存在表达发挥作用呆得住能表达：转录、翻译

:便于重组DNA分子的筛选；

:位置：位于基因的上游；作用：RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动转录；

:

:主要是指编码特定蛋白质的基因；位置：位于基因的下游；作用：终止转录；终止子启动子标记基因目的基因复制原点：能够完成自主复制；基因表达载体的构建（基因工程的核心工作）02目的基因插入位点是随意的吗？应注意什么？思考提示：

随意的；目的基因的表达需要

与

的调控，所以目的基因应插入到启动子和终止子

的部位。不是启动子终止子之间基因表达载体的构建（基因工程的核心工作）023.基因表达载体的构建过程:①用一定的

切割载体(质粒)，使它出现

个切口。②用

限制酶或能产生

末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。③利用

将含目的基因的DNA片段拼接到载体的切口处，这样就形成了

（即：

）。限制酶同种相同DNA连接酶一一个重组DNA分子基因表达载体基因表达载体的构建·判断正误02(1)基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取()(2)基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子()(3)标记基因不一定是抗生素抗性基因()×基因表达载体的构建。×终止子√位置作用特点启动子

的起始点起

作用，本身

；.终止子

的终点起始密码子

的起始点

氨基酸终止密码子

的终点

氨基酸DNA上mRNA上翻译翻译转录转录不转录编码不编码调控【素养提升①】重组DNA分子的模拟操作021.请写出限制酶Spe

Ⅰ、Hind

Ⅲ、Xba

Ⅰ和Xho

Ⅰ切割形成的末端。SpeⅠHindⅢXbaⅠXhoⅠ注：上述限制酶中的SpeⅠ和XbaⅠ，识别DNA分子中

核苷酸序列，但能切割产生

黏性末端，这样的限制酶被称为同尾酶。不同相同【素养提升①】重组DNA分子的模拟操作022.限制酶

切割产生的DNA片段能与限制酶Spe

Ⅰ切割产生的DNA片段相连接，因为:

；3.连接完成后，该重组DNA分子的新连接处

.（填“能”或“不能”）再被所用的限制酶切割，因为:

.

。SpeⅠHindⅢXbaⅠXhoⅠXbaⅠXbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端不能所用的两种限制酶均不能识别该重组DNA分子的新连接处的脱氧核苷酸序列重组DNA分子提示：

；原因：用SmaⅠ会破坏质粒的

，不利于

。【素养提升②】限制酶的选择原则02１．构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？不能抗生素抗性基因（标记基因）进一步筛选重组DNA分子提示：

；弊端：①

；

②

；

③

；【素养提升②】限制酶的选择原则02相同的黏性末端，可以相互连接！2.只使用EcoRⅠ分别切割质粒和外源DNA，能否构建基因表达载体？能质粒、目的基因会发生自身环化连接质粒与目的基因会发生反向连接会发生两两自身连接注：用同种限制酶或同尾酶处理，产生的都是相同的黏性末端，均会出现以上弊端。单酶切法提示：

；优点：①

；

②

；【素养提升②】限制酶的选择原则023.使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA，能否构建基因表达载体？可以防止质粒、目的基因的自身环化连接还可以防止目的基因与载体的反向连接注：不能防止两两自身连接。能双酶切法相同的黏性末端，可以相互连接！【素养提升②】限制酶的选择原则02【小结】选择限制酶的基本原则:①切割目的基因时:

；②切割质粒时:至少保留一个完整的

,便于筛选；

除此之外还需保留

、

、

。③确保目的基因和载体上有

黏性末端(补充说明：平末端也可以，但连接平末端效率低）。能切下目的基因且不破坏目的基因相同标记基因复制原点启动子终止子结合基因表达载体的构建，考查科学思维【P332】

021.（2023·重庆卷，12）某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基，短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（如下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（）。B02A.实验所用引物，其中一个序列为5′－TGCGCAGT－3′B.步骤①所用酶是SpeⅠ和CfoⅠC.用步骤①的酶对载体进行酶切至少获得了2个片段D.酶切片段和载体连接时可使用E.coli连接酶或T4连接酶根据酶切后得到的黏性末端判断，步骤①所用酶是NheⅠ和CfoⅠ，×；如分析所示，√；步骤①用两种酶切割载体(质粒)，质粒上至少有两个切口，至少产生2个片段，√；目的基因片段和质粒经酶切后产生的均为黏性末端，均可，√；5’-AGCTAGCA-3’3’-TGACGCGT-5’结合基因表达载体的构建，考查科学思维【P331】

2.某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。02酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如下图所示，→表示引物5′→3′方向。

02(1)限制酶切割的化学键是

。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是：

。(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和

。磷酸二酯键保证N基因启动子、N基因、N基因终止子的完整性，确保N基因能够顺利表达C—G、U—A、A—T

02(3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是：

；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是：

。(4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是：

。菌株B2的基因组DNA无PCR产物无空气污染；更安全，无火灾隐患；分解效率更高，高效利用秸秆资源等基因工程的基本操作程序①目的基因的筛选与获取②基因表达载体的构建③将目的基因导入受体细胞④目的基因的检测和鉴定00重组DNA分子③将目的基因导入受体细胞常用方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入受体细胞03Ca2+处理法农杆菌转化法花粉管通道法显微注射法【方法一】用微量注射器将含目的基因的

DNA溶液直接注入

中。【方法二】在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，

将DNA溶液滴加在花柱切面上，

使目的基因借助

进入胚囊。将目的基因导入受体细胞·①花粉管通道法03子房花粉管通道受体细胞：受精卵→我国科学家独创将目的基因导入受体细胞·②农杆菌转化法03【方法一】可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片

，然后

，并

；【方法二】可以将

直接浸没在

中一段时间，然后培养植株并获得

，再进行

、

等；受体细胞：与农杆菌共培养筛选转化细胞再生成植株体细胞花序含有农杆菌的溶液种子筛选鉴定受体细胞：受精卵→常用将目的基因导入受体细胞·②农杆菌转化法031.农杆菌的特点：农杆菌细胞内含有

质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的

(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞内，并且将其整合到该细胞的

上。注：农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力；随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。TiT-DNA染色体DNA→常用将目的基因导入受体细胞·②农杆菌转化法032.转化：是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内

和

的过程。3.利用农杆菌进行转化的思路：维持稳定表达→常用Ti质粒目的基因植物细胞植物细胞染色体DNA农杆菌基因表达载体导入插入表达新性状植株转入构建注：导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。将目的基因导入受体细胞·②农杆菌转化法03【名师解读】1.农杆菌转化法中的两次拼接：①第一次拼接：将

拼接到

上；②第二次拼接（非人工操作）：将

拼接到

上。2.农杆菌转化法中的两次导入：①第一次导入：将

导入到

中；②第二次导入（非人工操作）：将

导入到

中。→常用目的基因Ti质粒的T-DNA被插入目的基因的T-DNA受体细胞染色体的DNA含目的基因的重组Ti质粒农杆菌含目的基因的T-DNA受体细胞将目的基因导入受体细胞·③显微注射法03显微注射受精卵受体细胞：受精卵构建基因表达载体并提纯利用

将基因表达载体注入动物的

中早期胚胎培养胚胎移植获得具有新性状的动物将目的基因导入受体细胞·④Ca2+处理法03大肠杆菌感受态细胞Ca2+混合基因表达载体缓冲液吸收DNA完成转化Ca2+的作用是什么？思考增加细菌细胞膜的通透性。感受态细胞有什么特点？思考细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。【素养提升】筛选出含目的基因(基因表达载体)的受体细胞03【问题1】质粒(普通质粒/重组质粒)一定能成功导入受体细胞吗？提示：

，因为质粒携带目的基因导入受体细胞的成功率

。因此还需要进一步

出成功导入质粒的受体细胞。不一定不高筛选【素养提升】筛选出含目的基因(基因表达载体)的受体细胞03【方法1】利用标记基因筛选出含质粒(普通质粒/重组质粒)的受体细胞：①原理：质粒上的标记基因一般是

。而受体细胞本身

抵抗该抗生素的能力。用含有

的培养基培养受体细胞，能够生存的是

。某种抗生素的抗性基因没有该抗生素被导入了质粒的受体细胞提示：

，因为导入

的和导入

的受体细胞均能在该培养基中存活。①普通质粒(含抗性基因的质粒)氨苄青霉素抗性基因②重组质粒(含抗性基因和目的基因的质粒)氨苄青霉素抗性基因目的基因【素养提升】筛选出含目的基因(基因表达载体)的受体细胞03【问题2】根据标记基因的作用，在含有某种抗生素的培养基中筛选存活的受体细胞一定是导入目的基因(重组质粒/基因表达载体)的受体细胞吗？不一定普通质粒重组质粒【素养提升】筛选出含目的基因(基因表达载体)的受体细胞03【方法2】利用双标记技术筛选出含目的基因(重组质粒)的受体细胞：①原理：在构建基因表达载体时，使用两个不同的标记基因(如抗性基因)，将目的基因插入其中一个标记基因内，导致该标记基因

正常表达；则普通质粒具有

种标记，重组质粒只有

种标记。无法重组质粒重组质粒普通质粒两一【素养提升】筛选出含目的基因(基因表达载体)的受体细胞03②筛选方法：影印培养法(以“将目的基因插入四环素抗性基因”为例)a.用

法将细菌接种在含氨苄青霉素的培养基上培养，再利用

影印到含有四环素的培养基上，b.对比含不同抗生素的平板，

.

的菌落，就是含目的基因(重组质粒)的目标菌落。c.最后，可在含

的培养基上挑取

菌落(如图)进行培养。稀释涂布平板灭菌的绒布在含氨苄青霉素培养基上能生长，在四环素培养基上不能生长氨苄青霉素1、2、3、6、9结合基因工程的基本操作程序，考查科学思维【P331】

1.用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（）D03A.若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基

中能形成菌落重组质粒和普通质粒中都有四环素抗性基因，故不一定，√；单酶切法，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，√；重组质粒和普通质粒的DNA长度不同，凝胶电泳技术鉴定，√；SphⅠ酶切会破坏TetR，故不能在含Tet的培养基中形成菌落，×；基因工程的基本操作程序00重组DNA分子①目的基因的筛选与获取②基因表达载体的构建③将目的基因导入受体细胞④目的基因的检测和鉴定④目的基因的检测和鉴定目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。目的基因的检测和鉴定04类型检测内容方法分子水平的检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了

.目的基因是否转录出了

.目的基因是否翻译成

.个体生物学水平的鉴定个体是否具有相应

.目的基因(DNA)mRNAPCR等技术蛋白质抗原-抗体杂交技术性状抗虫接种实验、抗病接种实验等逆转录目的基因的检测与鉴定·①PCR等技术04提取待测DNA转基因生物PCR通过电泳检测是否扩增出目的基因提取待测mRNA转基因生物PCR利用目的基因的核苷酸序列设计引物。PCR中的引物应该根据什么进行设计？思考目的基因的检测与鉴定·②分子杂交技术04原理探针含有目的基因的DNA单链片段。注：带有放射性同位素标记或荧光分子标记等。结果显示出

，则检测出目的基因/mRNA。图示①DNA分子杂交：

②DNA-RNA分子杂交:碱基互补配对原则杂交带目的基因的检测与鉴定·③抗原-抗体杂交技术04原理探针与抗原特异性结合的抗体。注：带有放射性同位素标记或荧光分子标记等。结果显示出

，则检测出目的蛋白。图示抗原与抗体的特异性结合杂交带→说明目的基因成功表达。目的基因的检测与鉴定·④个体生物学水平的鉴定实例04转基因生物鉴定方法成功标志抗虫植物抗病毒（菌）植物抗盐植物抗除草剂植物获取目的基因产物的转基因生物饲喂害虫害虫死亡病毒（菌）感染未染病盐水浇灌正常生长喷洒除草剂正常生长提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较功能、活性正常关键·真题必刷【P332】2.(2024·福建卷)病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR来应对感染。麻疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46(hCD46)是麻疹病毒入侵细胞的主要受体，小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。(1)利用PCR技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的扩增过程是:

。(2)将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是

。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用

限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。两种引物通过碱基互补配对分别与含hCD46基因的两条模板链结合EcoRⅠ和NotⅠAgeⅠ和HindⅢ(3)为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其

。将胚胎移植到小鼠c的子宫中，应选用桑葚胚的原因是：

。(4)利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组，目的是：

。(5)若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR