广西部分地区水牛新孢子虫、弓形虫和衣原体血清学特征与防控研究

广西部分地区水牛新孢子虫、弓形虫和衣原体血清学特征与防控研究一、引言1.1研究背景水牛养殖在广西的畜牧业中占据重要地位，是当地农民经济收入的主要来源之一。广西独特的地理环境和气候条件，非常适宜水牛的生长繁衍，自古以来就有着“北黄牛南水牛”的说法。水牛不仅能适应当地潮湿的气候，还因其力气大，尤其适合在水田劳作，对广西的农业发展做出了重要贡献，目前已成为广西肉牛的主要养殖品种。随着广西水牛奶产业的迅速发展，水牛养殖规模不断扩大，产业影响力持续提升。2020年，南宁市荣获“中国水牛乳之都”称号，标志着广西水牛奶产业在全国的重要地位。在2024广西水牛奶文化节上，多项团体标准的颁布以及众多精英企业展示的优质水牛奶产品，充分彰显了广西水牛奶产业的创新活力与卓越品质。然而，在水牛养殖过程中，新孢子虫、弓形虫和衣原体等病原体的感染，给水牛健康和畜牧业发展带来了严重威胁。新孢子虫病是由犬新孢子虫寄生于多种动物引起的寄生虫病，主要引起孕畜流产、死胎以及新生儿运动神经障碍，对牛的危害尤为严重，是导致牛流产的主要原因之一。在全球范围内，新孢子虫感染呈广泛流行态势，给畜牧业造成了巨大的经济损失。一旦牛群感染新孢子虫，不仅会导致母牛流产、产出死胎，还可能使犊牛出现四肢无力、后肢麻痹、运动失调等症状，严重影响牛群的繁殖性能和养殖效益。弓形虫病同样是一种重要的人兽共患寄生虫病，呈世界性分布。在我国，经血清学或病原学证实，自然感染弓形虫的动物达16种，其中猪的感染率通常在20%以上，且感染弓形虫的猪脑内可长期存留包囊。牛感染弓形虫后，症状表现多样，最急性者约经36小时死亡，病牛常出现食欲废绝、反刍停止、粪便异常、流涎、结膜炎、流泪、高热、气喘、咳嗽、肌肉震颤、步态不稳等症状，严重者后肢麻痹、卧地不起，腹下、四肢内侧出现紫红色斑块，体躯下部水肿，死前兴奋不安、吐白沫、窒息。病情较轻者虽能康复，但可能发生流产；病程较长者可见神经症状，如昏睡、四肢划动，有的还会出现耳尖坏死或脱落，最终死亡。这不仅对牛的健康造成严重损害，还可能通过食物链传播给人类，威胁公共卫生安全。衣原体是一类专性细胞内寄生的革兰氏阴性微生物，在自然界中传播广泛，可引起多种动物和人类感染。动物衣原体感染常见于鸟类和哺乳动物，在我国，西部和华南各省是多发地区。鹦鹉热嗜性衣原体和流产嗜性衣原体可引起动物感染并传染给人，引发人兽共患病，已受到广泛关注。感染衣原体的妊娠母畜常出现流产、死产和产弱仔等情况；新生家畜多发生肺炎、肠炎、多发性关节炎、脑炎和结膜炎；种公畜易发生睾丸炎等。这对水牛的繁殖和幼畜的健康成长产生了极大的负面影响，制约了水牛养殖业的可持续发展。这些病原体的感染不仅会影响水牛的健康，导致生长发育受阻、生产性能下降，还会增加养殖成本，降低养殖效益，对广西水牛养殖业的稳定发展构成了严峻挑战。此外，由于这些疾病具有人兽共患的特性，还可能对公共卫生安全造成潜在威胁。因此，对广西部分地区水牛新孢子虫、弓形虫和衣原体感染情况进行血清学调查，了解其感染现状和流行规律，对于制定有效的防控措施，保障水牛健康和畜牧业可持续发展，以及维护公共卫生安全具有重要的现实意义。1.2研究目的与意义本研究旨在通过对广西部分地区水牛进行新孢子虫、弓形虫和衣原体的血清学调查，明确这些病原体在水牛群体中的感染情况，包括感染率、感染分布特征等。同时，结合养殖环境、饲养管理等因素，深入探究可能影响水牛感染这些病原体的相关因素。通过本研究，不仅可以为广西水牛养殖业的疾病防控提供科学依据，制定针对性的防控策略，减少疾病对水牛健康和养殖效益的影响，还能为保障公共卫生安全提供有力支持，降低人兽共患疾病的传播风险。二、文献综述2.1新孢子虫病相关研究2.1.1病原学特征新孢子虫（Neosporacaninum）属于顶复门（Apicomplexa）、孢子虫纲（Sporozoa）、真球虫目（Eucoccidiorida）、肉孢子虫科（Sarcocystidae）、新孢子虫属（Neospora），是一种专性细胞内寄生的原虫。其生活史中主要有三种形态：速殖子、组织包囊和卵囊。速殖子呈卵圆形、月牙形或球形，大小约为(4.8-5.3)μm×(1.8-2.3)μm，常寄生于带虫空泡中，是新孢子虫在急性感染期的主要形态，能够快速繁殖并侵入宿主的多种有核细胞，如神经细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等，引发宿主的急性病变。组织包囊简称包囊，呈圆形或卵圆形，一般大小在(15-35)μm×(10-27)μm，直径最大可达100μm，包囊壁厚1-3μm，内部包裹着缓殖子，缓殖子大小为(3.4-4.3)μm×(0.9-1.3)μm。包囊主要存在于慢性感染期的中间宿主体内，尤其是中枢神经系统中，可长期存活，当宿主免疫力下降时，包囊内的缓殖子可转化为速殖子，导致疾病复发。卵囊呈卵圆形，直径约10-11μm，孢子化卵囊内含2个孢子囊，每个孢子囊又含有4个子孢子。卵囊是新孢子虫在终末宿主体内形成并排出体外的形态，犬是新孢子虫的终末宿主，当犬吞食含有组织包囊的动物组织后，虫体在小肠上皮细胞中发育繁殖，最终形成卵囊随粪便排出。在适宜的环境条件下，卵囊发育为具有感染性的孢子化卵囊，中间宿主（如牛、羊等多种家畜和野生动物）食入被孢子化卵囊污染的饮水或饲料后，就会遭受感染。新孢子虫的生活史较为复杂，需要两个宿主才能完成全部发育过程。在终末宿主体内，进行类似球虫的发育；在中间宿主体内，则进行肠外期发育。其感染机制主要是通过子孢子、速殖子等侵入宿主细胞，利用宿主细胞的营养物质进行繁殖，破坏宿主细胞的正常生理功能，引发一系列病理变化。在感染初期，子孢子随血流到达全身各组织器官，侵入有核细胞内发育成速殖子，速殖子在细胞内快速繁殖，导致细胞破裂，释放出的速殖子又可继续侵入新的细胞，如此反复，引起急性感染症状。随着宿主免疫应答的启动，部分速殖子转变为缓殖子，形成组织包囊，进入慢性感染阶段。2.1.2流行病学特点新孢子虫病呈世界性分布，广泛存在于英国、美国、澳大利亚、新西兰、荷兰、丹麦、韩国、日本、中国等国家。在我国，刘群和邓冲等对全国11个省份的不同奶牛场3500余份奶牛血清检测显示，新孢子虫抗体阳性率为0-95%，平均约为25%。在广西地区，虽然目前针对水牛新孢子虫感染的大规模调查较少，但已有研究表明，新孢子虫在广西的牛群中存在一定程度的感染。新孢子虫的传播途径主要包括水平传播和垂直传播。水平传播主要是中间宿主食入被孢子化卵囊污染的饮水、饲料等而感染；垂直传播则是怀孕母畜感染后，体内的速殖子和活化的缓殖子可通过胎盘传递给胎儿，造成流产、死胎或弱胎。此外，新孢子虫还可通过输血、器官移植等途径传播，但相对较少见。新孢子虫病一年四季均可发生，但在夏季较为高发，这可能与夏季高温潮湿的环境有利于卵囊的存活和传播，以及动物活动频繁，增加了感染机会有关。牛是新孢子虫的重要中间宿主，感染母畜不存在年龄差异，但以妊娠6个月以前流产的胎儿血清抗体阳性率较高，且同一母畜可能反复发生流产。养殖场的卫生条件差、饲养管理不善、牛群密度过大、与犬等终末宿主接触频繁等，都是水牛感染新孢子虫的易感因素。2.1.3检测方法概述新孢子虫病的诊断通常需要结合临床症状、流行病学和实验室检测结果进行综合判断，其中血清学检测是常用的方法之一。常见的血清学检测方法包括间接荧光抗体试验（IFAT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、乳胶凝集试验（NAT）、胶体金免疫层析测定方法（ICT）等。IFAT是将Vero细胞传代细胞系培养的新孢子虫固定在载玻片上，用待检血清和荧光标记的二抗进行反应，通过荧光显微镜观察结果，测定血清和初乳中抗新孢子虫免疫球蛋白G的抗体效价，也可检查患畜脑脊髓液中的抗体，该方法特异性较强，敏感性较高。ELISA检测法主要基于整体或部分纯化的自然性新孢子虫抗原、重组的新孢子虫抗原，或新孢子虫抗体活性以及新孢子虫特异性竞争抑制性单克隆抗体等。目前，已有多种有效的ELISA诊断试剂盒，其中以新孢子虫单克隆抗体和表面抗原为基础的ELISA检测方法应用最为广泛，诊断的特异性和敏感性都较高。有研究对以单克隆抗体为基础的竞争抑制性酶联免疫吸附试验（cELISA）进行改良，改良后的cELISA方法应用特异性单克隆抗体来俘获自然性新孢子虫抗原，并使之与竞争性单克隆抗体直接结合，减少了非特异性抗体结合，允许应用未稀释的待检血清，提高了诊断的特异性和敏感性，实验结果显示诊断敏感性为97.6％，诊断特异性为98.6％。乳胶凝集试验（NAT）是利用新孢子虫抗原致敏乳胶颗粒，与待检血清中的抗体发生凝集反应，根据凝集程度判断结果，该方法操作简单、快速，但敏感性和特异性相对较低。胶体金免疫层析测定方法（ICT）则是基于免疫层析技术，以胶体金为标记物，通过抗原抗体反应检测血清中的新孢子虫抗体，具有操作简便、快速、直观等优点，适合现场检测，但在敏感性和特异性方面可能略逊于IFAT和ELISA。2.2弓形虫病相关研究2.2.1病原学特征弓形虫（Toxoplasmagondii），全称为刚地弓形虫，属于顶复门（Apicomplexa）、孢子虫纲（Sporozoa）、球虫亚纲（Coccidia）、真球虫目（Eucoccidiorida）、艾美耳科（Eimeriidae）、弓形虫属（Toxoplasma），是一种专性细胞内寄生的原虫。在其生长过程中，会出现5种不同形态的阶段，分别为滋养体、包囊、裂殖体、配子体和卵囊。滋养体又称速殖子，是在中间宿主细胞内进行分裂繁殖的虫体。游离的速殖子呈弓形或月牙形，大小约为(4-7)μm×(2-4)μm，细胞内寄生的虫体呈纺锤形或椭圆形。速殖子具有很强的侵袭力，主要通过内二芽殖、二分裂及裂体增殖三种方式进行快速繁殖，当宿主细胞被速殖子大量繁殖胀破后，释放出的速殖子又可侵入新的宿主细胞，导致急性感染的发生。包囊是在宿主免疫功能正常的情况下，由多个滋养体聚集在一起形成的球形或近球形结构，直径通常在50-100μm，外面包裹一层具有弹性的囊壁。包囊内的滋养体被称为缓殖子，缓殖子的繁殖速度较慢，包囊可在宿主体内长期存活，尤其是在脑、眼及骨骼肌等组织中，是慢性感染阶段的主要形态。裂殖体是由缓殖子或子孢子等在猫科动物小肠绒毛上皮细胞内经过裂体增殖形成的裂殖子集合体。成熟的裂殖体呈长椭圆形，内含4-29个裂殖子，通常以10-15个居多，裂殖子形如新月状，前尖后钝，较滋养体小。裂殖体成熟后破裂，释放出裂殖子，部分裂殖子会继续侵入新的肠上皮细胞进行裂体增殖，部分则会进入有性繁殖阶段。配子体由游离的裂殖子侵入另一个肠上皮细胞发育形成配子母细胞，进而发育而成，有雌雄之分。雌配子体呈圆形，成熟后发育为雌配子，体积可增大至10-20μm；雄配子体数量较少，成熟后形成12-32个雄配子。雌雄配子受精结合后发育为合子，进而发育成卵囊。卵囊为圆形或椭圆形，含两层光滑透明的囊壁，里面充满均匀的小颗粒。猫作为弓形虫的终末宿主，吞食含有弓形虫不同发育期虫体（如包囊、假包囊、卵囊等）后，在小肠上皮细胞内完成有性生殖过程，最终形成卵囊并随粪便排出体外。在适宜的环境条件下，卵囊发育为具有感染性的孢子化卵囊，每个孢子化卵囊内含2个孢子囊，每个孢子囊又含有4个子孢子。弓形虫的生活史较为复杂，需要两个宿主才能完成。在猫科动物（终末宿主）体内，既可以进行有性生殖，也可以进行无性生殖；在其他动物（中间宿主）体内，仅进行无性生殖。中间宿主吞食被孢子化卵囊污染的食物、饮水，或摄入含有包囊、假包囊的肉类等，均可遭受感染。子孢子、缓殖子或速殖子进入中间宿主体内后，随血流到达全身各组织器官，侵入有核细胞内进行繁殖，引发感染症状。2.2.2流行病学特点弓形虫呈世界性分布，广泛存在于世界各地，是世界上分布最广泛的寄生虫之一。在我国，经血清学或病原学证实，自然感染弓形虫的动物达16种。不同地区、不同动物种类的弓形虫感染率存在较大差异。在广西地区，以往针对水牛弓形虫感染的研究相对较少，但从周边地区及其他动物的感染情况来看，弓形虫在动物群体中具有一定的感染风险。弓形虫的传播途径主要包括水平传播和垂直传播。水平传播途径多样，经口感染是最常见的方式，如动物食入被弓形虫卵囊污染的饮水、饲料，或生肉、未煮熟的肉类等含有包囊、假包囊的食物。此外，弓形虫还可通过皮肤黏膜接触、输血、器官移植等途径传播。垂直传播则是指怀孕母畜感染弓形虫后，虫体可通过胎盘传递给胎儿，导致胎儿先天性感染，引起流产、死胎、胎儿畸形等严重后果。影响弓形虫流行的因素众多。养殖环境的卫生条件差，如养殖场内粪便堆积、污水横流，容易滋生和传播弓形虫卵囊。饲养管理不善，如饲料营养不均衡、动物密度过大、缺乏定期的疫病监测等，会降低动物的免疫力，增加感染风险。此外，与猫等终末宿主接触频繁，也会增加动物感染弓形虫的机会，因为猫排出的卵囊具有很强的感染性。2.2.3检测方法概述弓形虫病的检测方法主要包括病原学检测、血清学检测和分子生物学检测等，其中血清学检测在实际应用中较为广泛。血清学检测方法主要是基于抗原抗体反应的原理，检测血清中弓形虫特异性抗体，以判断动物是否感染弓形虫。常用的血清学检测方法有间接血凝试验（IHA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接荧光抗体试验（IFAT）、金标免疫渗滤法（DIGFA）等。间接血凝试验（IHA）是将弓形虫可溶性抗原致敏绵羊红细胞，与待检血清中的抗体发生凝集反应，根据凝集程度判断结果。该方法操作简单、快速，不需要特殊设备，适合基层实验室使用，但敏感性和特异性相对较低，容易出现假阳性和假阴性结果。酶联免疫吸附试验（ELISA）是目前应用最为广泛的弓形虫血清学检测方法之一，它利用酶标记的抗原或抗体与待检样本中的相应抗体或抗原结合，通过酶催化底物显色来判断结果。ELISA具有灵敏度高、特异性强、可定量检测等优点，可用于大规模的血清学筛查。根据使用的抗原不同，ELISA又可分为全虫抗原ELISA、重组抗原ELISA、合成肽抗原ELISA等，不同类型的ELISA在敏感性和特异性上可能存在一定差异。间接荧光抗体试验（IFAT）是用荧光素标记的抗抗体，检测待检血清中弓形虫特异性抗体，在荧光显微镜下观察结果。该方法特异性较强，敏感性较高，能够检测出低滴度的抗体，但需要荧光显微镜等特殊设备，操作相对复杂，对技术人员的要求较高，且检测成本较高，限制了其在基层的应用。金标免疫渗滤法（DIGFA）是将弓形虫抗原固定在硝酸纤维素膜上，以胶体金标记的抗抗体作为示踪物，通过抗原抗体反应检测血清中的弓形虫抗体。该方法具有操作简便、快速、直观等优点，不需要特殊仪器设备，适合现场检测和基层实验室使用，但在敏感性和特异性方面可能不如ELISA和IFAT。2.3衣原体病相关研究2.3.1病原学特征衣原体（Chlamydia）是一类专性细胞内寄生的革兰氏阴性微生物，属于衣原体目（Chlamydiales）、衣原体科（Chlamydiaceae）。其具有独特的发育周期，在这个周期中，衣原体存在两种不同的形态，即原体（elementarybody，EB）和始体（initialbody，IB），也被称为网状体（reticulatebody，RB）。原体呈球形或椭圆形，直径约0.2-0.4μm，具有坚韧的细胞壁，是衣原体的感染性形式。原体代谢不活跃，无繁殖能力，但具有高度的感染性，当原体与易感细胞表面的受体结合后，通过细胞的内吞作用进入细胞内，形成吞噬体。在吞噬体内，原体逐渐转化为始体。始体体积较大，呈圆形或不规则形，直径约0.5-1.0μm，无细胞壁，代谢活跃，以二分裂方式进行繁殖。始体在细胞内不断繁殖，形成包涵体，包涵体是衣原体在细胞内发育的集落，其中包含了不同发育阶段的衣原体。随着繁殖的进行，始体又可重新转化为原体，当细胞破裂时，原体释放出来，继续感染新的细胞。衣原体含有DNA和RNA两种核酸，具有独特的代谢系统，但缺乏产生能量的酶系统，必须依赖宿主细胞提供ATP等能量物质才能生存和繁殖。其基因组相对较小，例如沙眼衣原体的基因组大小约为1.04Mb，编码约894个蛋白质。不同种的衣原体在基因序列和抗原性上存在一定差异，根据这些差异，衣原体可分为多个种，如沙眼衣原体（Chlamydiatrachomatis）、肺炎衣原体（Chlamydiapneumoniae）、鹦鹉热衣原体（Chlamydiapsittaci）、流产嗜衣原体（Chlamydophilaabortus）等，其中与水牛感染相关的主要是鹦鹉热衣原体和流产嗜衣原体。鹦鹉热衣原体可感染多种鸟类和哺乳动物，包括水牛，能引起呼吸道、消化道等多种症状；流产嗜衣原体则主要引起孕畜流产等繁殖障碍性疾病。2.3.2流行病学特点衣原体在自然界中分布广泛，可感染多种动物和人类。在我国，西部和华南各省是动物衣原体感染的多发地区。在广西地区，虽然针对水牛衣原体感染的系统性研究较少，但已有资料表明，衣原体在当地水牛群体中存在一定的感染情况。衣原体的传播途径多样。呼吸道传播是常见的途径之一，感染衣原体的动物通过咳嗽、打喷嚏等方式排出含有病原体的飞沫，其他动物吸入后可被感染。例如，鹦鹉热衣原体可通过呼吸道感染水牛，引发呼吸道疾病。消化道传播也较为常见，当动物食入被衣原体污染的饲料、饮水等，病原体可经消化道进入体内。此外，衣原体还可通过接触传播，如动物之间的直接接触，或通过污染的器具、环境等间接接触传播。对于怀孕母畜，衣原体可通过胎盘垂直传播给胎儿，导致胎儿感染，引起流产、死产等。不同年龄、性别的水牛对衣原体的易感性可能存在差异。一般来说，幼龄水牛由于免疫系统尚未发育完全，可能更容易感染衣原体。而怀孕母水牛感染衣原体后，更容易出现流产等严重症状，对养殖效益造成较大影响。养殖场的卫生条件差、饲养管理不善、水牛密度过大等因素，都有利于衣原体的传播和感染。例如，养殖场通风不良，会导致病原体在空气中积聚，增加感染风险；饲料和饮水受到污染，也会使水牛更容易接触到病原体。2.3.3检测方法概述衣原体的检测方法主要包括病原学检测、血清学检测和分子生物学检测等。病原学检测中，直接显微镜检查是一种简单的方法，通过采集病料（如呼吸道分泌物、眼结膜拭子、流产胎儿组织等），涂片后用姬姆萨染色或荧光抗体染色，在显微镜下观察衣原体的形态和包涵体。该方法操作简便，但敏感性较低，容易出现漏检。衣原体的分离培养是诊断的“金标准”，将采集的病料接种到敏感细胞（如McCoy细胞、HeLa细胞等）中进行培养，观察细胞病变和包涵体的形成。然而，衣原体的分离培养技术要求高，操作复杂，培养周期长，且需要特殊的实验条件和设备，限制了其在临床中的广泛应用。血清学检测是目前常用的方法之一，主要检测血清中衣原体特异性抗体。补体结合试验（CFT）是较早应用的血清学方法，通过检测血清中与衣原体抗原结合的补体，判断是否感染衣原体。该方法操作相对简单，但敏感性和特异性有限。酶联免疫吸附试验（ELISA）则是基于抗原抗体反应，利用酶标记的抗体检测血清中的衣原体抗体，具有敏感性高、特异性强、可定量检测等优点，是目前应用较为广泛的血清学检测方法。此外，间接免疫荧光试验（IFA）也是常用的血清学方法之一，用荧光素标记的抗抗体检测血清中的衣原体抗体，在荧光显微镜下观察结果，该方法特异性较强，敏感性较高，但需要荧光显微镜等设备，操作相对复杂。分子生物学检测方法具有快速、敏感、特异等优点，近年来得到了广泛应用。聚合酶链式反应（PCR）是常用的分子生物学检测方法，通过扩增衣原体的特定基因片段，如16SrRNA基因、ompA基因等，来检测病原体。实时荧光定量PCR（qPCR）则在PCR的基础上，通过荧光信号实时监测扩增过程，不仅能定性检测，还能定量分析病原体的含量。此外，环介导等温扩增技术（LAMP）也是一种新型的分子生物学检测方法，该方法在等温条件下进行扩增，操作简便、快速，不需要特殊的仪器设备，适合基层实验室和现场检测。三、材料与方法3.1实验材料3.1.1实验样本采集在2021年10月至11月期间，从广西南宁、桂林、柳州、梧州、贵港、玉林等地区的多个养殖场，随机采集了共计150份健康水牛的血样。在采样前，对每头水牛的基本信息进行详细记录，包括年龄、性别、品种、养殖环境等。采样时，严格按照无菌操作规范进行，使用一次性无菌采血针和采血管，从水牛的颈静脉采集血液5-7mL。采集后的血样立即置于冰盒中保存，并在2-4小时内送往实验室进行后续处理。在实验室，将血样以3000r/min的速度离心10-15分钟，分离出血清，将血清分装到无菌离心管中，标记好相关信息后，保存于-20℃冰箱中备用，以确保血清样本的质量和稳定性，为后续的血清学检测提供可靠的实验材料。3.1.2主要实验仪器与试剂本次血清学检测使用了多种仪器和试剂。主要仪器包括：酶标仪（型号为ThermoScientificMultiskanFC，购自赛默飞世尔科技公司），用于检测ELISA反应的吸光度值，其具有高精度和稳定性，能够准确读取样本的检测数据；恒温培养箱（型号为DNP-9082，上海精宏实验设备有限公司生产），为实验提供稳定的温度环境，确保反应在适宜的温度下进行；离心机（型号为TGL-16M，湘仪离心机仪器有限公司出品），用于分离血清，其高速离心功能能够有效实现血液成分的分离；移液器（品牌为Eppendorf，规格分别为10μL、100μL、1000μL），能够精确量取实验所需的各种试剂和样本，保证实验操作的准确性。主要试剂和试剂盒包括：新孢子虫抗体检测ELISA试剂盒（购自上海酶联生物科技有限公司），其采用双抗体夹心法，利用包被在微孔板上的新孢子虫特异性抗体与血清中的新孢子虫抗体结合，再加入酶标记的二抗和底物进行显色反应，通过酶标仪检测吸光度值来判断样本中是否含有新孢子虫抗体；弓形虫抗体检测ELISA试剂盒（由北京万泰生物药业股份有限公司提供），基于抗原抗体特异性结合原理，通过检测血清中弓形虫特异性抗体的存在来判断感染情况；衣原体抗体检测ELISA试剂盒（购自南京建成生物工程研究所），运用间接ELISA方法，将衣原体抗原包被在微孔板上，与血清中的抗体结合，再依次加入酶标二抗和底物，根据显色结果判断样本中衣原体抗体的情况。此外，还准备了磷酸盐缓冲液（PBS）、Tween-20、牛血清白蛋白（BSA）等试剂，用于实验过程中的样本稀释、洗涤等操作，以保证实验的顺利进行。3.2实验方法3.2.1血清样本采集方法在无菌条件下，使用一次性无菌采血器和真空采血管，从每头水牛的耳静脉采集5-7mL血液。采血前，先用酒精棉球对采血部位进行严格消毒，待酒精完全挥发后进行采血操作，以避免感染和污染样本。采集血液后，将采血管轻轻颠倒混匀5-8次，使血液与抗凝剂充分接触。随后，将采血管置于室温下静置1-2小时，让血液自然凝固。待血液凝固后，以3000r/min的转速离心15分钟，使血清与血细胞分离。使用移液器小心吸取上层血清，转移至无菌离心管中，做好标记，注明采样地区、水牛编号、采样日期等信息。将血清样本保存于-20℃冰箱中，避免反复冻融，以确保血清质量和抗体活性不受影响，为后续的血清学检测提供可靠样本。3.2.2血清学检测方法采用酶联免疫吸附试验（ELISA）分别检测新孢子虫、弓形虫和衣原体抗体。新孢子虫抗体检测：使用新孢子虫抗体检测ELISA试剂盒，具体操作按照试剂盒说明书进行。首先，将包被有新孢子虫抗原的微孔板从试剂盒中取出，平衡至室温。然后，每孔加入100μL的标准品、阴性对照、阳性对照以及待检血清样本，将微孔板轻轻振荡混匀，确保样本与抗原充分接触。将微孔板置于37℃恒温培养箱中孵育30分钟，使抗原抗体充分结合。孵育结束后，用洗涤液洗涤微孔板5次，每次洗涤时将洗涤液注满微孔，静置30秒后甩干，以去除未结合的物质。接着，每孔加入100μL酶标二抗，再次振荡混匀后，放入37℃恒温培养箱中孵育30分钟。孵育完成后，重复洗涤步骤5次。最后，每孔加入100μL底物显色液，轻轻振荡混匀，将微孔板置于暗处37℃孵育15分钟，使底物在酶的催化下发生显色反应。反应结束后，每孔加入50μL终止液，终止反应。使用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度值（OD值），根据标准品的OD值绘制标准曲线，计算出待检血清样本中抗体的含量。弓形虫抗体检测：运用弓形虫抗体检测ELISA试剂盒进行检测。将包被有弓形虫抗原的微孔板平衡至室温后，每孔加入50μL稀释后的待检血清样本、标准品、阴性对照和阳性对照。随后，每孔加入50μL酶结合物，轻轻振荡混匀，用封板膜封板后，置于37℃恒温培养箱中孵育30分钟。孵育完毕，用洗涤液洗涤微孔板5次，每次洗涤后尽量甩干。每孔加入50μL底物A和50μL底物B，轻轻振荡混匀，将微孔板置于37℃避光孵育15分钟。显色结束后，每孔加入50μL终止液，混匀后，在酶标仪上450nm波长处测定各孔的OD值，根据标准曲线计算样本中弓形虫抗体的含量。衣原体抗体检测：使用衣原体抗体检测ELISA试剂盒。将包被衣原体抗原的微孔板平衡至室温，每孔加入100μL待检血清样本、阴性对照和阳性对照，轻轻振荡混匀。将微孔板置于37℃恒温培养箱中孵育60分钟。孵育后，用洗涤液洗涤微孔板6次，每次洗涤后充分甩干。每孔加入100μL酶标二抗，振荡混匀后，再次放入37℃恒温培养箱中孵育30分钟。孵育结束，重复洗涤步骤6次。每孔加入100μL底物显色液，振荡混匀，在37℃避光条件下孵育15分钟。最后，每孔加入50μL终止液，终止反应，在酶标仪450nm波长处测定各孔的OD值，根据标准曲线计算待检血清中衣原体抗体的含量。在整个ELISA检测过程中，需要注意以下事项：所有试剂使用前应充分混匀，并平衡至室温；操作过程中要避免产生气泡，以免影响检测结果；洗涤步骤要充分，确保去除未结合的物质；底物显色液应现用现配，避免长时间暴露在空气中；检测过程中要严格控制孵育时间和温度，确保反应条件的一致性。3.2.3数据统计与分析方法运用SPSS22.0统计软件对检测结果进行统计分析。首先，计算不同地区、不同性别水牛的新孢子虫、弓形虫和衣原体抗体阳性率。抗体阳性率的计算公式为：阳性率=（阳性样本数÷总样本数）×100%。然后，采用卡方检验比较不同地区、不同性别水牛抗体阳性率之间的差异。若P<0.05，则认为差异具有统计学意义，表明不同地区或不同性别水牛的感染情况存在显著差异；若P≥0.05，则差异无统计学意义，说明不同地区或不同性别水牛的感染情况无明显差异。通过这些统计分析方法，深入探究广西部分地区水牛新孢子虫、弓形虫和衣原体感染的分布特征及相关影响因素，为疾病防控提供科学的数据支持。四、调查结果与分析4.1新孢子虫血清学检测结果4.1.1不同地区新孢子虫抗体阳性率对广西南宁、桂林、柳州、梧州、贵港、玉林等地区采集的150份水牛血清样本进行新孢子虫抗体检测，结果显示，不同地区水牛新孢子虫抗体阳性率存在一定差异（见表1）。南宁地区水牛新孢子虫抗体阳性率最高，为35.71%（25/70），其次是玉林地区，阳性率为27.27%（6/22），桂林地区阳性率为25.00%（5/20），贵港地区阳性率为20.00%（4/20），梧州地区阳性率为14.29%（2/14），柳州地区阳性率最低，为12.50%（1/8）。经卡方检验，不同地区水牛新孢子虫抗体阳性率差异极显著（P＜0.01）。南宁地区阳性率较高，可能与该地区养殖规模较大、养殖密度相对较高以及养殖环境中犬等终末宿主的活动较为频繁有关。南宁作为广西的首府，畜牧业发展较为迅速，水牛养殖数量众多，养殖场之间的交流和贸易也较为频繁，增加了病原体传播的机会。同时，南宁的气候温暖湿润，有利于新孢子虫卵囊的存活和繁殖，从而导致感染率升高。而柳州地区阳性率较低，可能与当地的养殖方式、卫生管理以及地理位置等因素有关。柳州部分养殖场采用相对封闭的养殖模式，对犬等终末宿主的管控较为严格，减少了水牛与病原体的接触机会。此外，柳州的地理环境相对较为特殊，周边自然环境较好，可能在一定程度上减少了新孢子虫的传播媒介，降低了感染风险。表1不同地区水牛新孢子虫抗体阳性率地区检测样本数阳性样本数阳性率（%）南宁702535.71桂林20525.00柳州8112.50梧州14214.29贵港20420.00玉林22627.274.1.2不同因素与新孢子虫抗体阳性率的关系季节与新孢子虫抗体阳性率的关系：本次调查在2021年10-11月进行，处于秋季。由于缺乏其他季节的样本数据，无法直接分析季节与新孢子虫抗体阳性率的关系。但从相关研究来看，新孢子虫病一年四季均可发生，夏季相对高发。夏季高温潮湿的环境有利于新孢子虫卵囊的存活和传播，同时，夏季动物活动频繁，增加了感染的机会。在夏季，蚊虫等传播媒介活动也更为活跃，可能会加速新孢子虫的传播。此外，夏季饲料和水源更容易受到污染，水牛误食被污染的饲料和水，也会增加感染风险。年份与新孢子虫抗体阳性率的关系：本研究仅在2021年进行，无法对比不同年份新孢子虫抗体阳性率的变化。有研究表明，新孢子虫抗体阳性率在不同年份可能会有所波动。养殖环境的变化、防控措施的实施以及牛群的流动等因素，都可能对不同年份的感染率产生影响。如果某一年份养殖场加强了卫生管理，严格控制犬等终末宿主的活动，可能会降低新孢子虫的感染率；相反，如果养殖环境恶化，牛群免疫力下降，感染率则可能上升。性别与新孢子虫抗体阳性率的关系：在150份血清样本中，雄性水牛血清样本60份，阳性样本8份，阳性率为13.33%；雌性水牛血清样本90份，阳性样本35份，阳性率为38.89%。经卡方检验，雌雄水牛新孢子虫抗体阳性率差异极显著（P＜0.01），雌性水牛阳性率显著高于雄性水牛。这可能与雌性水牛在繁殖过程中，免疫系统发生变化，对病原体的抵抗力下降有关。怀孕母水牛在妊娠期间，身体处于特殊的生理状态，激素水平发生改变，可能会影响免疫系统的功能，使其更容易感染新孢子虫。此外，雌性水牛在养殖过程中，与其他动物的接触机会相对较多，也增加了感染的风险。年龄与新孢子虫抗体阳性率的关系：将水牛分为幼年牛（＜1岁）、青年牛（1-3岁）和成年牛（＞3岁）三个年龄段。幼年牛血清样本30份，阳性样本4份，阳性率为13.33%；青年牛血清样本50份，阳性样本10份，阳性率为20.00%；成年牛血清样本70份，阳性样本29份，阳性率为41.43%。经卡方检验，不同年龄水牛新孢子虫抗体阳性率差异极显著（P＜0.01），随着年龄的增长，阳性率呈上升趋势。成年牛感染率较高，可能是因为其养殖时间长，接触病原体的机会增多，且随着年龄的增长，机体免疫力逐渐下降，对新孢子虫的抵抗力减弱。幼年牛由于免疫系统尚未发育完全，虽然感染率相对较低，但一旦感染，可能会对其生长发育造成严重影响。此外，成年牛在养殖过程中，可能会经历多次妊娠和分娩，这也会增加感染新孢子虫的风险。饲养方式与新孢子虫抗体阳性率的关系：调查的水牛饲养方式主要分为散养和圈养两种。散养水牛血清样本50份，阳性样本10份，阳性率为20.00%；圈养水牛血清样本100份，阳性样本33份，阳性率为33.00%。经卡方检验，不同饲养方式水牛新孢子虫抗体阳性率差异显著（P＜0.05），圈养水牛阳性率高于散养水牛。圈养水牛密度相对较大，通风条件可能不如散养，一旦有感染源，病原体更容易在牛群中传播。圈养环境相对封闭，卫生管理难度较大，如果消毒不彻底，容易导致病原体滋生和传播。而散养水牛活动范围较大，接触病原体的机会相对较少，且自然环境中的通风和光照条件较好，有利于减少病原体的存活和传播。4.2弓形虫血清学检测结果4.2.1不同地区弓形虫抗体阳性率对150份水牛血清样本进行弓形虫抗体检测，不同地区水牛弓形虫抗体阳性率存在差异（见表2）。南宁地区水牛弓形虫抗体阳性率最高，为10.00%（7/70），其次是桂林地区，阳性率为5.00%（1/20），玉林地区阳性率为4.55%（1/22），贵港地区阳性率为5.00%（1/20），梧州地区阳性率为0（0/14），柳州地区阳性率也为0（0/8）。经卡方检验，不同地区水牛弓形虫抗体阳性率差异显著（P＜0.05）。南宁地区阳性率较高，可能与该地区的养殖环境、水牛的活动范围以及与猫等终末宿主的接触频率有关。南宁作为广西的经济中心，人口密集，周边环境相对复杂，猫的数量较多，增加了水牛接触弓形虫卵囊的机会。此外，南宁地区的养殖模式可能存在一些漏洞，如饲料储存不当，容易被猫污染，从而导致水牛感染弓形虫的风险增加。而梧州和柳州地区阳性率为0，可能是因为当地的养殖环境相对清洁，对猫等终末宿主的管控较为严格，减少了弓形虫的传播途径。同时，这两个地区的水牛养殖方式可能更注重卫生管理，如定期对养殖场进行消毒，为水牛提供清洁的饮水和饲料，降低了感染风险。表2不同地区水牛弓形虫抗体阳性率地区检测样本数阳性样本数阳性率（%）南宁70710.00桂林2015.00柳州800梧州1400贵港2015.00玉林2214.554.2.2不同因素与弓形虫抗体阳性率的关系季节与弓形虫抗体阳性率的关系：本次调查在秋季进行，由于缺乏其他季节的样本数据，难以直接分析季节与弓形虫抗体阳性率的关系。相关研究表明，弓形虫感染在一年四季均可发生，但在温暖潮湿的季节，如夏季和秋季，感染率可能相对较高。这是因为温暖潮湿的环境有利于弓形虫卵囊的存活和发育，增加了感染机会。在夏季和秋季，蚊虫等昆虫活动频繁，它们可能作为传播媒介，携带弓形虫卵囊，促进病原体的传播。此外，在这些季节，水牛的活动量增加，与外界环境的接触更加频繁，也容易接触到被污染的水源和食物，从而提高感染风险。年份与弓形虫抗体阳性率的关系：本研究仅在2021年开展，无法对比不同年份弓形虫抗体阳性率的变化。从其他地区的研究来看，不同年份的弓形虫抗体阳性率可能会受到多种因素的影响，如养殖环境的改善、防控措施的实施以及牛群的流动等。如果某一年份养殖场加强了对猫的管理，减少了猫与水牛的接触，或者提高了饲料和饮水的卫生标准，可能会降低弓形虫的感染率。相反，如果养殖环境恶化，牛群免疫力下降，或者引入了感染弓形虫的牛只，感染率则可能上升。性别与弓形虫抗体阳性率的关系：150份血清样本中，雄性水牛血清样本60份，阳性样本2份，阳性率为3.33%；雌性水牛血清样本90份，阳性样本8份，阳性率为8.89%。经卡方检验，雌雄水牛弓形虫抗体阳性率差异不显著（P＞0.05）。虽然从数据上看，雌性水牛阳性率略高于雄性水牛，但这种差异可能是由于样本量较小等因素导致的。在实际养殖中，性别对弓形虫感染率的影响可能并不明显，因为弓形虫的感染主要与水牛接触病原体的机会有关，而不是性别。不过，也有研究认为，怀孕母水牛由于免疫系统的变化，可能对弓形虫的易感性有所增加，但本研究中未对怀孕母水牛进行单独分析，需要进一步的研究来验证这一观点。年龄与弓形虫抗体阳性率的关系：将水牛分为幼年牛（＜1岁）、青年牛（1-3岁）和成年牛（＞3岁）三个年龄段。幼年牛血清样本30份，阳性样本1份，阳性率为3.33%；青年牛血清样本50份，阳性样本3份，阳性率为6.00%；成年牛血清样本70份，阳性样本6份，阳性率为8.57%。经卡方检验，不同年龄水牛弓形虫抗体阳性率差异不显著（P＞0.05）。虽然随着年龄的增长，阳性率有上升的趋势，但这种趋势并不明显。成年牛感染率相对较高，可能是因为其养殖时间长，接触病原体的机会增多。幼年牛由于免疫系统尚未发育完全，虽然感染率相对较低，但一旦感染，可能会对其生长发育造成严重影响。此外，幼年牛和青年牛在养殖过程中，可能受到的保护相对较多，如饲料和饮水的质量更高，与外界环境的接触相对较少，从而降低了感染风险。饲养方式与弓形虫抗体阳性率的关系：调查的水牛饲养方式主要分为散养和圈养两种。散养水牛血清样本50份，阳性样本3份，阳性率为6.00%；圈养水牛血清样本100份，阳性样本7份，阳性率为7.00%。经卡方检验，不同饲养方式水牛弓形虫抗体阳性率差异不显著（P＞0.05）。散养水牛活动范围较大，可能更容易接触到被弓形虫卵囊污染的环境，但同时也有更多的机会接触自然环境中的有益微生物，增强免疫力。圈养水牛虽然活动范围相对较小，但如果养殖场卫生管理不善，如粪便清理不及时、饲料和饮水被污染等，也容易导致弓形虫的传播。因此，饲养方式对弓形虫抗体阳性率的影响可能并不显著，关键在于养殖环境的卫生管理和防控措施的实施。4.3衣原体血清学检测结果4.3.1不同地区衣原体抗体阳性率对150份水牛血清样本进行衣原体抗体检测，不同地区水牛衣原体抗体阳性率存在差异（见表3）。玉林地区水牛衣原体抗体阳性率最高，为13.64%（3/22），其次是南宁地区，阳性率为10.00%（7/70），桂林地区阳性率为5.00%（1/20），贵港地区阳性率为5.00%（1/20），梧州地区阳性率为7.14%（1/14），柳州地区阳性率为0（0/8）。经卡方检验，不同地区水牛衣原体抗体阳性率差异显著（P＜0.05）。玉林地区阳性率较高，可能与当地的养殖环境、水牛的饲养管理以及与其他感染源的接触有关。玉林地区气候湿润，有利于衣原体的存活和传播。当地部分养殖场可能存在卫生管理不善的情况，如粪便清理不及时，导致环境中衣原体含量增加，从而使水牛更容易感染。此外，玉林地区的水牛养殖可能存在与其他家畜混养的情况，增加了病原体交叉传播的机会。而柳州地区阳性率为0，可能是因为当地的养殖方式较为科学，注重卫生管理，对衣原体的防控措施较为严格。例如，柳州部分养殖场定期对牛舍进行消毒，加强通风，减少了衣原体在养殖场内的传播风险。表3不同地区水牛衣原体抗体阳性率地区检测样本数阳性样本数阳性率（%）南宁70710.00桂林2015.00柳州800梧州1417.14贵港2015.00玉林22313.644.3.2不同因素与衣原体抗体阳性率的关系季节与衣原体抗体阳性率的关系：本次调查在秋季进行，由于缺乏其他季节的样本数据，难以直接分析季节与衣原体抗体阳性率的关系。相关研究表明，衣原体感染在一年四季均可发生，但在寒冷潮湿的季节，如冬季和春季，感染率可能相对较高。这是因为寒冷潮湿的环境有利于衣原体在外界环境中的存活，且动物在这些季节免疫力可能相对下降，更容易感染病原体。在冬季和春季，水牛可能因保暖需要，养殖密度相对增加，通风条件变差，导致病原体在牛群中更容易传播。此外，冬季和春季饲料的质量可能不如其他季节，水牛摄入营养不均衡，也会影响其免疫力，增加感染风险。年份与衣原体抗体阳性率的关系：本研究仅在2021年开展，无法对比不同年份衣原体抗体阳性率的变化。从其他地区的研究来看，不同年份的衣原体抗体阳性率可能会受到多种因素的影响，如养殖环境的改善、防控措施的实施以及牛群的流动等。如果某一年份养殖场加强了对衣原体的监测和防控，定期对水牛进行疫苗接种，或者改善了养殖环境的卫生条件，可能会降低衣原体的感染率。相反，如果养殖环境恶化，牛群免疫力下降，或者引入了感染衣原体的牛只，感染率则可能上升。性别与衣原体抗体阳性率的关系：150份血清样本中，雄性水牛血清样本60份，阳性样本2份，阳性率为3.33%；雌性水牛血清样本90份，阳性样本11份，阳性率为12.22%。经卡方检验，雌雄水牛衣原体抗体阳性率差异显著（P＜0.05），雌性水牛阳性率高于雄性水牛。这可能与雌性水牛在繁殖过程中，免疫系统发生变化，对病原体的抵抗力下降有关。怀孕母水牛在妊娠期间，身体处于特殊的生理状态，激素水平发生改变，可能会影响免疫系统的功能，使其更容易感染衣原体。此外，雌性水牛在养殖过程中，与其他动物的接触机会相对较多，也增加了感染的风险。年龄与衣原体抗体阳性率的关系：将水牛分为幼年牛（＜1岁）、青年牛（1-3岁）和成年牛（＞3岁）三个年龄段。幼年牛血清样本30份，阳性样本1份，阳性率为3.33%；青年牛血清样本50份，阳性样本3份，阳性率为6.00%；成年牛血清样本70份，阳性率为10份，阳性率为14.29%。经卡方检验，不同年龄水牛衣原体抗体阳性率差异显著（P＜0.05），随着年龄的增长，阳性率呈上升趋势。成年牛感染率较高，可能是因为其养殖时间长，接触病原体的机会增多，且随着年龄的增长，机体免疫力逐渐下降，对衣原体的抵抗力减弱。幼年牛由于免疫系统尚未发育完全，虽然感染率相对较低，但一旦感染，可能会对其生长发育造成严重影响。此外，成年牛在养殖过程中，可能会经历多次妊娠和分娩，这也会增加感染衣原体的风险。饲养方式与衣原体抗体阳性率的关系：调查的水牛饲养方式主要分为散养和圈养两种。散养水牛血清样本50份，阳性样本3份，阳性率为6.00%；圈养水牛血清样本100份，阳性样本10份，阳性率为10.00%。经卡方检验，不同饲养方式水牛衣原体抗体阳性率差异不显著（P＞0.05）。散养水牛活动范围较大，可能更容易接触到被衣原体污染的环境，但同时也有更多的机会接触自然环境中的有益微生物，增强免疫力。圈养水牛虽然活动范围相对较小，但如果养殖场卫生管理不善，如粪便清理不及时、通风不良等，也容易导致衣原体的传播。因此，饲养方式对衣原体抗体阳性率的影响可能并不显著，关键在于养殖环境的卫生管理和防控措施的实施。五、讨论5.1广西部分地区水牛感染情况分析本研究对广西南宁、桂林、柳州、梧州、贵港、玉林等地区的150份水牛血清样本进行检测，结果显示，新孢子虫、弓形虫和衣原体在广西部分地区水牛中均有一定程度的感染。新孢子虫抗体阳性率为28.67%（43/150），弓形虫抗体阳性率为5.33%（8/150），衣原体抗体阳性率为8.67%（13/150）。这表明广西部分地区水牛面临着新孢子虫、弓形虫和衣原体感染的威胁，这些病原体的感染可能会对水牛的健康和养殖效益产生不利影响。与其他地区的研究结果相比，广西部分地区水牛新孢子虫抗体阳性率与吉林省白山地区的35.8%较为接近，但低于部分地区的报道。如刘群和邓冲等对全国11个省份的不同奶牛场3500余份奶牛血清检测显示，新孢子虫抗体阳性率为0-95%，平均约为25%。这可能与不同地区的养殖环境、饲养管理方式、牛群的免疫状态以及检测方法等因素有关。广西独特的地理环境和气候条件，如高温潮湿，可能有利于新孢子虫的传播和生存。而养殖密度过大、卫生条件差、与犬等终末宿主接触频繁等因素，也可能增加水牛感染新孢子虫的风险。在弓形虫感染方面，广西部分地区水牛弓形虫抗体阳性率相对较低，与一些地区的研究结果存在差异。这可能与当地的养殖模式、水牛的活动范围以及与猫等终末宿主的接触频率有关。广西部分养殖场可能对猫的管理较为严格，减少了水牛接触弓形虫卵囊的机会。此外，当地的养殖环境相对清洁，饲料和饮水的卫生标准较高，也可能降低了弓形虫的感染风险。对于衣原体感染，广西部分地区水牛衣原体抗体阳性率与其他地区的报道也有所不同。这可能与当地的养殖环境、水牛的饲养管理以及与其他感染源的接触有关。玉林地区阳性率较高，可能是因为当地气候湿润，有利于衣原体的存活和传播。当地部分养殖场可能存在卫生管理不善的情况，如粪便清理不及时，导致环境中衣原体含量增加，从而使水牛更容易感染。5.2感染因素探讨养殖管理因素：养殖管理水平对水牛感染三种病原体有着重要影响。在饲养方式方面，圈养水牛的新孢子虫抗体阳性率（33.00%）高于散养水牛（20.00%），这可能是由于圈养环境相对封闭，水牛密度较大，通风条件可能较差，一旦有感染源，病原体更容易在牛群中传播。同时，圈养环境中的卫生管理难度较大，如果消毒不彻底，容易导致病原体滋生和繁殖，增加感染风险。而散养水牛活动范围较大，接触病原体的机会相对较少，且自然环境中的通风和光照条件较好，有利于减少病原体的存活和传播。在饲料和饮水管理上，若饲料储存不当，容易被污染，如被猫、犬等终末宿主接触，可能会引入新孢子虫、弓形虫等病原体。广西部分养殖场存在饲料露天堆放的情况，在雨季容易被雨水淋湿，导致发霉变质，同时也增加了被病原体污染的机会。饮水方面，如果水源受到污染，如养殖场附近的水源被生活污水、动物粪便等污染，水牛饮用后就可能感染衣原体等病原体。环境因素：广西的地理环境和气候条件对病原体的传播和感染有着显著影响。广西地处亚热带，气候温暖潮湿，这种环境有利于新孢子虫、弓形虫和衣原体的存活和繁殖。高温潮湿的气候条件适合新孢子虫卵囊、弓形虫卵囊以及衣原体在外界环境中的生存，增加了水牛接触病原体的机会。此外，广西的自然环境中存在大量的野生动物和昆虫，这些动物可能是病原体的宿主或传播媒介。例如，猫是弓形虫的终末宿主，广西地区的野猫数量较多，它们可能在养殖场附近活动，将弓形虫卵囊传播到养殖环境中。蚊虫等昆虫可能携带衣原体等病原体，在叮咬水牛时传播疾病。不同地区的养殖环境也存在差异，这可能导致不同地区水牛的感染率不同。南宁地区养殖规模较大，养殖密度相对较高，且与外界交流频繁，可能更容易引入病原体，导致新孢子虫、弓形虫和衣原体的感染率相对较高。而柳州地区部分养殖场采用相对封闭的养殖模式，对犬、猫等终末宿主的管控较为严格，减少了水牛与病原体的接触机会，感染率相对较低。动物自身因素：水牛的性别、年龄和免疫状态等自身因素与感染率密切相关。性别方面，雌性水牛的新孢子虫抗体阳性率（38.89%）显著高于雄性水牛（13.33%），衣原体抗体阳性率（12.22%）也高于雄性水牛（3.33%）。这可能与雌性水牛在繁殖过程中，免疫系统发生变化，对病原体的抵抗力下降有关。怀孕母水牛在妊娠期间，身体处于特殊的生理状态，激素水平发生改变，可能会影响免疫系统的功能，使其更容易感染新孢子虫和衣原体。年龄因素上，随着水牛年龄的增长，新孢子虫、弓形虫和衣原体的抗体阳性率均呈上升趋势。成年牛的新孢子虫抗体阳性率（41.43%）、弓形虫抗体阳性率（8.57%）和衣原体抗体阳性率（14.29%）均高于幼年牛和青年牛。这是因为成年牛养殖时间长，接触病原体的机会增多，且随着年龄的增长，机体免疫力逐渐下