序列重设计的Ras结合蛋白特性解析：结构、互作与稳定性洞察

序列重设计的Ras结合蛋白特性解析：结构、互作与稳定性洞察一、绪论1.1蛋白质从头设计发展进程蛋白质从头设计领域的起源可追溯至20世纪中叶，当时随着对蛋白质结构和功能认识的逐渐深入，科学家们开始设想能否人工构建具有特定结构和功能的蛋白质。1960年代，Crick等科学家提出了中心法则，阐明了遗传信息从DNA传递到蛋白质的过程，这为蛋白质设计奠定了理论基础。此后，Anfinsen通过牛胰核糖核酸酶A的变性与复性实验，证明了蛋白质的一级结构决定其高级结构，揭示了氨基酸序列和蛋白质结构之间的紧密联系，使得通过设计氨基酸序列来构建特定结构蛋白质的设想成为可能，开启了蛋白质从头设计的探索之路。在早期探索阶段，受限于对蛋白质折叠机制的有限理解和计算能力的不足，蛋白质从头设计进展缓慢。1980年代，虽然基于能量最小化原理的计算方法开始应用于蛋白质结构预测和设计，但这些方法计算复杂度高，且难以准确预测蛋白质在水溶液中的真实构象，设计出的蛋白质结构往往与预期存在较大偏差。1987年，Richardson等人通过对已知蛋白质结构的分析，总结出一些简单的结构基序，如α-螺旋、β-折叠等，并尝试将这些基序组合起来设计新的蛋白质，但由于缺乏对蛋白质整体折叠和稳定性的有效控制，设计成功率较低。随着计算机技术的飞速发展和对蛋白质结构与功能关系认识的加深，蛋白质从头设计在21世纪取得了显著进展。基于物理模型和经验势能函数的计算方法不断改进，如Rosetta等软件的出现，能够通过模拟蛋白质折叠过程，从大量可能的氨基酸序列中筛选出最有可能折叠成目标结构的序列。2003年，Kuhlman和Baker利用Rosetta软件成功设计了一种全新的蛋白质拓扑结构，尽管该蛋白质的功能较为简单，但这一成果证明了通过计算方法设计全新蛋白质结构的可行性，为蛋白质从头设计领域注入了新的活力。同时，实验技术的进步，如X射线晶体学、核磁共振等，为验证设计蛋白质的结构和功能提供了有力手段，促进了理论设计与实验验证的紧密结合。近年来，深度学习等人工智能技术的兴起为蛋白质从头设计带来了革命性的变化。2017年，GoogleDeepMind公司开发的AlphaFold，通过深度学习算法，能够根据氨基酸序列高精度预测蛋白质的三维结构，极大地推动了蛋白质结构预测领域的发展，也为蛋白质从头设计提供了新的思路和方法。基于深度学习的生成式模型，如RFdiffusion、SCUBA-D等，能够直接生成具有特定结构和功能的蛋白质序列，不再依赖于传统的基于模板的设计方法。2023年，DavidBaker团队开发的RFdiffusion方法，能生成各种功能性蛋白质，包括在天然蛋白质中从未见过的拓扑结构，展现了深度学习在蛋白质从头设计中的强大能力。这些新技术使得蛋白质从头设计的效率和成功率大幅提高，能够设计出更加复杂和多样化的蛋白质结构和功能，推动蛋白质从头设计进入一个全新的时代，在药物研发、生物催化、材料科学等领域展现出巨大的应用潜力。1.2蛋白质热稳定性剖析1.2.1热稳定性影响因子蛋白质热稳定性是指蛋白质在高温环境下维持其天然结构和功能的能力，这一特性受到多种内在因素的精细调控。从氨基酸组成来看，不同氨基酸对蛋白质热稳定性贡献各异。脯氨酸由于其特殊的环状结构，能够限制肽链的自由度，增加蛋白质结构的刚性，从而提高热稳定性。研究发现，在一些蛋白质中，特定位置引入脯氨酸突变可显著提升其热稳定性。例如，在葡萄糖异构酶中，将第138位的甘氨酸替换为脯氨酸后，突变型葡萄糖异构酶的热半衰期延长一倍，最适反应温度提高10-12℃。精氨酸和赖氨酸等带正电荷的氨基酸，可通过与带负电荷的氨基酸形成离子键，稳定蛋白质的三维结构；而芳香族氨基酸如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸，凭借其较大的侧链和较强的疏水相互作用，也有助于增强蛋白质的热稳定性。非共价相互作用在稳定蛋白质结构中起着核心作用，氢键是其中一种重要的作用力。蛋白质分子内的氢键网络，包括主链与主链、主链与侧链、侧链与侧链之间形成的氢键，能够稳定蛋白质的二级结构（如α-螺旋和β-折叠）和三级结构。在高温下，氢键的断裂会导致蛋白质结构的解折叠，破坏其稳定性。疏水作用同样关键，蛋白质折叠过程中，疏水氨基酸残基倾向于聚集在蛋白质内部，形成疏水核心，与周围的水分子隔离，降低体系的自由能，使蛋白质结构更加稳定。当温度升高时，疏水作用减弱，疏水核心逐渐瓦解，蛋白质结构变得不稳定。二硫键作为一种共价键，对蛋白质热稳定性影响显著。它是由两个半胱氨酸残基的巯基氧化形成，能够在蛋白质的不同区域之间或同一区域内形成交联，限制蛋白质分子的构象变化，增强蛋白质结构的刚性和稳定性。许多分泌蛋白和细胞外蛋白含有大量的二硫键，以适应细胞外复杂多变的环境。例如，胰岛素分子含有两个链间二硫键和一个链内二硫键，这些二硫键对于维持胰岛素的正确结构和生物活性至关重要。若二硫键被破坏，胰岛素的结构和功能将受到严重影响。此外，蛋白质的寡聚化状态也与热稳定性密切相关。寡聚蛋白通过亚基之间的相互作用形成稳定的多聚体结构，亚基间的界面相互作用，如氢键、离子键和疏水作用等，能够协同稳定整个蛋白质复合物。与单体蛋白相比，寡聚蛋白通常具有更高的热稳定性，因为一个亚基的解折叠需要克服更多的相互作用能，这使得寡聚蛋白在高温下更难发生变性。1.2.2提升热稳定性策略提升蛋白质热稳定性是蛋白质工程领域的重要研究方向，旨在拓展蛋白质在高温环境下的应用潜力。引入突变是常用的策略之一，定点突变技术能够精确改变蛋白质中特定氨基酸残基，通过优化氨基酸组成和相互作用来增强热稳定性。例如，中国科学院微生物研究所吴边研究员团队基于GRAPE策略开发的GRAPE-WEB自动化计算平台，通过结合FoldX、Rosetta和ABACUS等计算工具，设计、筛选和聚类稳定化突变位点，成功提高了蛋白质的热稳定性。在PETase的案例中，该平台设计的一系列单点突变，经筛选和聚类后获得的突变体DuraPETase，其ΔTm值提高了31°C。化学修饰是另一种有效的方法，通过对蛋白质表面的氨基酸残基进行化学修饰，如烷基化、酰基化、磷酸化等，可改变蛋白质的电荷分布、亲疏水性和空间结构，进而提升热稳定性。聚乙二醇（PEG）修饰是一种常见的化学修饰方式，PEG分子具有良好的水溶性和生物相容性，将其连接到蛋白质表面，能够增加蛋白质的水化层厚度，减少蛋白质分子之间的相互作用，降低蛋白质在高温下的聚集和沉淀倾向，提高热稳定性。一些PEG修饰的酶在高温环境下的活性和稳定性明显优于未修饰的酶，展现出良好的工业应用前景。融合标签策略是将具有热稳定特性的蛋白质或结构域与目标蛋白融合，利用融合标签的稳定作用提升目标蛋白的热稳定性。例如，将嗜热菌来源的热稳定蛋白结构域与中温菌的酶融合，可显著提高该酶在高温下的稳定性和活性。这种方法不仅能增强热稳定性，还能在一定程度上改善蛋白质的表达、折叠和溶解性，为蛋白质的生产和应用提供便利。从头设计策略则是从无到有构建全新的蛋白质序列和结构，通过合理设计氨基酸序列，使其能够折叠形成稳定的三维结构，并具备所需的热稳定性。随着计算技术和人工智能的发展，基于深度学习的蛋白质从头设计方法，如RFdiffusion、SCUBA-D等，能够生成具有特定结构和功能的蛋白质序列。这些方法能够充分考虑蛋白质的结构与稳定性关系，设计出具有更高热稳定性的蛋白质，为蛋白质热稳定性提升开辟了新的途径，有望在生物催化、生物制药等领域发挥重要作用。1.3蛋白质上位作用阐释蛋白质上位作用，指的是蛋白质中一个氨基酸位点的突变效应受到其他位点突变的影响，这种非独立性的突变效应广泛存在于蛋白质体系中，对蛋白质的功能和稳定性起着至关重要的调控作用。在血红蛋白中，存在着典型的上位作用现象。血红蛋白由四个亚基组成，每个亚基包含一个血红素辅基，负责结合氧气。正常情况下，血红蛋白的四个亚基协同作用，呈现出对氧气的正协同结合特性，即当一个亚基结合氧气后，会促进其他亚基与氧气的结合，使得血红蛋白在肺部能够高效地摄取氧气，并在组织中适当释放氧气，满足机体的生理需求。然而，当血红蛋白β-链上的第6位氨基酸发生突变，由正常的谷氨酸变为缬氨酸时，会导致镰刀型细胞贫血症。这一突变不仅改变了血红蛋白分子的表面电荷和结构，还使得血红蛋白在脱氧状态下容易发生聚集，形成异常的纤维状结构，影响红细胞的正常形态和功能。更为关键的是，这一突变位点与其他位点之间存在上位作用，例如，其他位点的一些突变虽然在正常血红蛋白中可能对功能影响较小，但在β-6谷氨酸突变为缬氨酸的背景下，这些突变可能会进一步加剧血红蛋白的聚集倾向，或者影响其与氧气的结合和释放特性，从而显著改变蛋白质的功能和稳定性，加重疾病症状。在酶催化反应中，上位作用同样发挥着重要作用。以枯草杆菌蛋白酶为例，该酶在催化蛋白质水解过程中，活性中心的氨基酸残基以及周边的氨基酸残基共同参与催化反应。活性中心的丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸形成催化三联体，通过协同作用完成底物的水解。当活性中心丝氨酸位点发生突变时，酶的催化活性会显著降低甚至丧失。然而，周边位点的突变可能会对这一突变效应产生上位作用。若在距离活性中心较远的某个位点发生突变，虽然该突变本身对酶的催化活性影响不大，但它可能会通过改变蛋白质的构象动态性，影响活性中心的微环境，进而影响丝氨酸突变对酶活性的影响程度。这种上位作用使得蛋白质在进化过程中，不同位点的突变相互影响，共同塑造了蛋白质的功能和稳定性，也为蛋白质工程改造提供了复杂而精细的调控靶点，需要综合考虑多个位点之间的相互作用，才能实现对蛋白质功能和稳定性的有效优化。1.4Ras与Raf蛋白介绍1.4.1Ras蛋白结构与功能Ras蛋白是由原癌基因c-ras编码的一类小分子GTP结合蛋白，相对分子质量约为21kDa，故又被称为P21Ras蛋白。其结构高度保守，由165-189个氨基酸残基组成，包含一个高度保守的G结构域和一个可变的C末端区域。G结构域由6个β-折叠和5个α-螺旋组成，其中β1-α1、β2-α2和β3-α3之间的环区被称为效应器结构域，是Ras蛋白与下游效应分子相互作用的关键部位，决定了Ras信号传导的特异性。在Ras蛋白的晶体结构中，G结构域中的核苷酸结合口袋能够紧密结合GTP或GDP，当Ras蛋白结合GTP时，处于活性状态；结合GDP时则处于失活状态。Ras蛋白在细胞信号传导中扮演着核心角色，是细胞内多条重要信号通路的关键枢纽，尤其是在受体酪氨酸激酶（RTK）介导的信号通路中发挥着不可或缺的作用。当细胞外的生长因子如表皮生长因子（EGF）与细胞膜上的受体酪氨酸激酶结合后，受体发生二聚化并自身磷酸化，招募含有SH2结构域的生长因子受体结合蛋白2（Grb2），Grb2再与鸟苷酸交换因子SOS结合，形成EGF-RTK-Grb2-SOS复合物。SOS能够促进Ras蛋白上的GDP释放，进而结合GTP，使Ras蛋白激活。激活态的Ras蛋白通过其效应器结构域与下游的Raf蛋白激酶结合，激活Raf蛋白，从而启动Ras-Raf-MEK-ERK信号级联反应。在这个过程中，Raf蛋白磷酸化并激活MEK（丝裂原活化蛋白激酶激酶），MEK进一步磷酸化并激活ERK（细胞外信号调节激酶），激活的ERK进入细胞核，磷酸化一系列转录因子，如Elk-1、c-Myc等，调节基因的表达，促进细胞的生长、增殖、分化和存活。此外，Ras蛋白还参与细胞骨架的调节、蛋白质运输和分泌等重要生理过程。在细胞迁移过程中，Ras蛋白通过调节肌动蛋白细胞骨架的重组，影响细胞的形态变化和运动能力。当Ras蛋白被激活时，能够激活Rac和Cdc42等小GTP酶，它们通过调节肌动蛋白的聚合和解聚，促进细胞伪足的形成和伸展，从而推动细胞的迁移。在蛋白质运输方面，Ras蛋白参与了从内质网到高尔基体的囊泡运输过程，确保蛋白质能够正确地运输到其作用位点，维持细胞正常的生理功能。1.4.2Raf蛋白结构与功能Raf蛋白是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在Ras信号通路中位于Ras蛋白的下游，是Ras-Raf-MEK-ERK信号级联反应的关键组成部分。Raf蛋白家族包括A-Raf、B-Raf和C-Raf（也称为Raf-1）三个成员，它们在结构和功能上具有一定的相似性，但在组织表达和生物学功能上存在差异。以C-Raf为例，其结构主要由三个保守结构域组成：N端调节结构域、激酶结构域和C端尾部结构域。N端调节结构域包含富含半胱氨酸的锌指结构和14-3-3蛋白结合位点，对Raf蛋白的活性起负调控作用。在非激活状态下，N端调节结构域通过分子内相互作用，抑制激酶结构域的活性。激酶结构域是Raf蛋白发挥催化活性的核心区域，含有ATP结合位点和底物结合位点，能够磷酸化下游的MEK蛋白，使其激活。C端尾部结构域包含一些调节位点，参与Raf蛋白的稳定性和活性调节。在Ras信号通路中，当Ras蛋白结合GTP被激活后，其效应器结构域与Raf蛋白的N端调节结构域结合，导致Raf蛋白的构象发生变化，解除N端调节结构域对激酶结构域的抑制作用，使Raf蛋白激活。激活的Raf蛋白通过其激酶结构域磷酸化MEK蛋白上的特定丝氨酸残基，激活MEK，进而启动下游的MEK-ERK信号转导，调节细胞的生长、增殖、分化和存活等生物学过程。Raf蛋白还与其他信号通路存在相互作用，形成复杂的信号网络。例如，Raf蛋白可以与蛋白激酶C（PKC）相互作用，PKC能够磷酸化Raf蛋白的某些位点，调节Raf蛋白的活性，影响Ras信号通路的传导。此外，Raf蛋白还可以通过与其他信号分子如磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）等相互作用，参与细胞的代谢、存活和凋亡等过程的调控，在细胞生理和病理过程中发挥着广泛而重要的作用。1.5研究方法综述1.5.1蛋白-蛋白互作测定法酵母双杂交技术作为一种经典的体内蛋白质-蛋白质相互作用检测方法，其原理基于真核细胞转录因子的结构特点。许多真核转录因子，如GAL4、GCN4等，包含DNA结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD），只有当这两个结构域在空间上接近时，才能启动下游报告基因的转录。在酵母双杂交系统中，将已知蛋白的基因与BD基因融合，构建诱饵质粒；将待研究蛋白的基因与AD基因融合，构建猎物质粒。将这两个质粒共同转化到酵母细胞中，如果诱饵蛋白和猎物蛋白之间存在相互作用，就会使BD和AD在空间上靠近，形成有活性的转录因子，从而启动报告基因的表达。通过检测报告基因的表达情况，如β-半乳糖苷酶活性、营养缺陷型筛选等，就可以判断两种蛋白质是否发生相互作用。该技术具有灵敏度高、能够检测到微弱相互作用的优点，且可以在细胞内环境中研究蛋白质相互作用，更接近生理状态。然而，它也存在一定局限性，如可能出现假阳性和假阴性结果，假阳性可能是由于某些蛋白质本身具有转录激活活性，或者与酵母细胞内的其他蛋白发生非特异性相互作用导致；假阴性则可能是因为蛋白质的表达、折叠或定位异常，无法在酵母细胞内正确行使功能。此外，该技术对膜蛋白的检测效果不佳，因为膜蛋白在酵母细胞中的表达和定位较为复杂，难以满足酵母双杂交系统的要求。免疫共沉淀（Co-IP）是一种基于抗体特异性识别的蛋白质相互作用检测方法，常用于验证已知蛋白质之间的相互作用。其原理是利用针对目标蛋白的特异性抗体，将目标蛋白及其相互作用的蛋白质从细胞裂解液中以免疫复合物的形式沉淀下来。首先，裂解细胞获取包含各种蛋白质的细胞裂解液，然后加入特异性抗体，抗体与目标蛋白结合形成抗原-抗体复合物。接着，加入ProteinA/G磁珠或琼脂糖珠，它们能够与抗体的Fc段结合，从而将抗原-抗体复合物沉淀下来。通过离心去除上清液，对沉淀下来的免疫复合物进行洗涤，去除非特异性结合的蛋白质。最后，使用SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）和Westernblot等技术对免疫复合物中的蛋白质进行分离和鉴定，确定与目标蛋白相互作用的蛋白质。该方法的优点是能够在生理条件下研究蛋白质相互作用，结果较为可靠，且可以同时检测多个蛋白质之间的相互作用。但是，该方法需要高质量的特异性抗体，抗体的质量和特异性直接影响实验结果的准确性；此外，免疫共沉淀只能检测到在细胞内能够形成稳定复合物的蛋白质相互作用，对于一些瞬时或弱相互作用可能无法检测到。表面等离子共振（SPR）技术是一种基于物理光学原理的蛋白质相互作用检测方法，能够实时、无标记地监测蛋白质之间的相互作用过程。其原理基于SPR现象，当一束平面偏振光以临界角入射到玻璃与金属薄膜（如金膜）的界面时，会在金属薄膜表面产生表面等离子体波。当待测分子与固定在金属薄膜表面的配体分子发生相互作用时，会引起金属薄膜表面折射率的变化，进而导致SPR信号的改变。通过检测SPR信号的变化，如共振角度或共振波长的改变，就可以实时监测蛋白质相互作用的结合和解离过程，获得亲和力常数（KD）、结合速率常数（ka）和解离速率常数（kd）等动力学参数。在实验过程中，首先将一种蛋白质（配体）固定在SPR传感器芯片的表面，然后将含有另一种蛋白质（分析物）的溶液流过芯片表面，当分析物与配体发生相互作用时，SPR信号会发生相应变化。该技术具有灵敏度高、检测速度快、无需标记等优点，能够实时监测蛋白质相互作用的动态过程，提供丰富的动力学信息。然而，SPR技术对实验仪器和操作要求较高，设备昂贵，实验条件的优化较为复杂；同时，由于检测过程是在溶液中进行，可能会受到溶液中其他成分的干扰，影响实验结果的准确性。1.5.2蛋白质结构解析法X射线晶体学是最早发展起来且应用最为广泛的蛋白质结构解析技术之一，其原理基于X射线与晶体中原子的相互作用。当X射线照射到蛋白质晶体时，晶体中的原子会使X射线发生衍射，产生特定的衍射图案。这些衍射图案包含了蛋白质分子中原子的位置和排列信息。通过收集和分析这些衍射数据，利用数学方法进行相位计算和结构解析，就可以重建出蛋白质的三维结构。具体实验流程包括蛋白质表达与纯化、晶体生长、X射线衍射数据收集、相位确定和结构解析与精修等步骤。首先，通过基因工程技术在合适的表达系统中表达目标蛋白质，并对其进行纯化，获得高纯度的蛋白质样品。然后，利用结晶技术使蛋白质形成高质量的单晶，这是X射线晶体学的关键步骤，晶体的质量直接影响衍射数据的质量和结构解析的准确性。接着，将晶体放置在X射线源前，收集不同角度下的X射线衍射数据。相位确定是X射线晶体学中的难点，常用的方法有同晶置换法、多波长反常散射法等。最后，利用这些数据和相位信息，通过计算机软件进行结构解析和精修，得到蛋白质的三维结构模型。X射线晶体学的优点是能够获得高精度的蛋白质结构信息，分辨率可以达到原子水平，为研究蛋白质的结构与功能关系提供了重要依据。然而，该技术也存在一些局限性，如蛋白质晶体生长困难，需要耗费大量的时间和精力进行优化；对于一些难以结晶的蛋白质，如膜蛋白、柔性蛋白等，应用X射线晶体学解析其结构存在较大挑战；此外，晶体结构可能与蛋白质在溶液中的天然构象存在一定差异。核磁共振（NMR）技术是一种基于原子核磁性特性的蛋白质结构解析方法，能够在溶液状态下研究蛋白质的结构和动力学。其原理是利用原子核在强磁场中的自旋特性，当原子核处于外加磁场中时，会产生不同的能级。通过施加射频脉冲，使原子核发生能级跃迁，产生核磁共振信号。不同原子核所处的化学环境不同，其共振频率也会有所差异，这种差异被称为化学位移。通过分析蛋白质中不同原子核的化学位移、耦合常数等NMR参数，可以获取蛋白质分子中原子之间的距离、角度等结构信息，从而解析蛋白质的三维结构。实验过程通常包括蛋白质样品制备、NMR数据采集和结构计算与解析等步骤。首先，将蛋白质溶解在合适的缓冲溶液中，制备高浓度、均一的蛋白质样品。然后，利用NMR谱仪采集各种NMR谱图，如一维氢谱、二维相关谱（如HSQC、NOESY等）。最后，通过对这些谱图的分析，结合分子动力学模拟等方法，计算和解析蛋白质的三维结构。NMR技术的优点是能够在接近生理条件的溶液状态下研究蛋白质结构，可同时获得蛋白质的结构和动力学信息，对于研究蛋白质的动态变化和功能机制具有重要意义。但该技术也存在一些缺点，如对蛋白质分子量有一定限制，通常适用于分子量较小（一般小于30kDa）的蛋白质；实验数据采集和分析过程较为复杂，需要专业的知识和技能；此外，NMR实验的灵敏度相对较低，对于低丰度蛋白质的结构解析存在困难。冷冻电镜（Cryo-EM）技术是近年来发展迅速的一种蛋白质结构解析技术，尤其在解析超大分子复合物和膜蛋白结构方面具有独特优势。其原理是将蛋白质样品快速冷冻在液氮温度下，形成玻璃态冰，使蛋白质分子在近乎天然的状态下被固定。然后，利用电子显微镜对冷冻样品进行成像，电子束穿过样品时，会与蛋白质分子发生相互作用，产生散射信号，通过检测这些散射信号并进行图像处理和三维重构，就可以获得蛋白质的三维结构。冷冻电镜实验主要包括样品制备、数据采集、图像处理和结构解析等步骤。在样品制备过程中，将蛋白质溶液滴加到特制的电镜载网上，然后迅速浸入液氮或液氮冷却的乙烷中，使样品快速冷冻。接着，在冷冻电镜下采集大量的电子显微图像，这些图像包含了蛋白质分子不同角度的投影信息。通过图像处理算法对这些图像进行筛选、分类和对齐，然后利用三维重构算法将这些二维投影信息重建为蛋白质的三维结构。冷冻电镜技术的优点是无需蛋白质结晶，适用于多种类型的蛋白质，包括难以结晶的膜蛋白、超大分子复合物等；能够在接近生理状态下解析蛋白质结构，且分辨率不断提高，目前已能够达到原子分辨率水平。然而，冷冻电镜技术也面临一些挑战，如设备昂贵，对实验人员的操作技能和数据处理能力要求较高；图像采集和处理过程复杂，容易受到噪声和样品不均一等因素的影响。1.5.3蛋白质热稳定性测定法差示扫描量热法（DSC）是一种直接测量蛋白质热转变过程中焓变（ΔH）的技术，为表征蛋白质的热稳定性提供了重要信息。其原理基于物质在加热或冷却过程中吸收或释放热量的特性，当蛋白质溶液被加热时，蛋白质会逐渐发生去折叠，这个过程需要吸收热量。DSC通过测量样品与参比物之间的热流差，来监测蛋白质去折叠过程中的热量变化。在实验中，将蛋白质溶液和参比溶液（通常为缓冲液）分别放置在DSC仪器的样品池和参比池中，以一定的升温速率进行加热。随着温度升高，蛋白质开始去折叠，吸收热量，导致样品池与参比池之间出现热流差。DSC仪器记录下热流差随温度的变化曲线，即DSC曲线。通过对DSC曲线的分析，可以得到蛋白质的中点转变温度（Tm）、焓变（ΔH）等热力学参数。Tm是指蛋白质去折叠过程中，一半蛋白质分子处于折叠态，一半处于去折叠态时的温度，它反映了蛋白质热稳定性的高低，Tm值越高，蛋白质的热稳定性越强。焓变（ΔH）则表示蛋白质去折叠过程中吸收的总热量，与蛋白质分子内的非共价键断裂数量有关，ΔH值越大，说明维持蛋白质天然构象的相互作用越强。DSC技术的优点是能够直接测量蛋白质去折叠过程的热力学参数，提供全面的热稳定性信息；实验过程简单，对样品的要求相对较低。但该技术也存在一定局限性，如需要较大的样品量，通常为毫克级；对于一些复杂的蛋白质体系，可能存在多个热转变过程，分析较为困难。等温滴定量热法（ITC）是一种基于热力学原理的技术，用于研究生物分子之间的相互作用以及蛋白质的稳定性。其原理是通过测量生物分子相互作用过程中释放或吸收的热量，来获取相互作用的热力学参数。在蛋白质热稳定性研究中，ITC可以用于测量蛋白质与配体结合或去折叠过程中的热效应。实验时，将配体（如小分子、核酸等）或变性剂（如尿素、盐酸胍等）以微量递增的方式滴加到蛋白质溶液中，同时监测反应体系的热量变化。当配体与蛋白质结合或蛋白质发生去折叠时，会伴随热量的释放或吸收，ITC仪器通过测量反应体系与参比体系之间的热流差，记录下热量变化随配体滴加量的曲线。通过对这些曲线的分析，可以得到结合常数（Ka）、焓变（ΔH）、熵变（ΔS）等热力学参数。在蛋白质热稳定性研究中，通过测量不同温度下蛋白质与变性剂的结合热力学参数，可以评估蛋白质的热稳定性。如果蛋白质在高温下与变性剂的结合能力增强，说明蛋白质的结构变得更加不稳定，容易被变性剂破坏。ITC技术的优点是能够在等温条件下直接测量生物分子相互作用的热力学参数，不需要对样品进行标记，能够提供准确的热力学信息。然而，该技术对实验仪器和操作要求较高，实验成本相对较高；且实验过程较为耗时，需要进行多次滴定实验。圆二色谱（CD）是一种基于光学活性的技术，用于研究蛋白质的二级结构和构象变化，也可用于评估蛋白质的热稳定性。其原理是利用蛋白质分子中不对称的化学键（如肽键）对左旋和右旋圆偏振光的吸收差异，即圆二色性。不同的蛋白质二级结构（如α-螺旋、β-折叠、无规卷曲等）具有特征性的CD光谱。在蛋白质热稳定性研究中，通过测量蛋白质在不同温度下的CD光谱变化，可以监测蛋白质二级结构的改变，从而评估蛋白质的热稳定性。实验时，将蛋白质溶液置于CD光谱仪的样品池中，在一定波长范围内扫描，记录下蛋白质的CD光谱。然后，以一定的升温速率对蛋白质溶液进行加热，同时连续测量CD光谱随温度的变化。随着温度升高，如果蛋白质的二级结构发生改变，其CD光谱也会相应变化。通过分析CD光谱的变化趋势，如特定波长下CD信号的强度变化、二级结构特征峰的位移等，可以判断蛋白质的热稳定性。例如，对于α-螺旋结构的蛋白质，在222nm处有特征性的负峰，当蛋白质发生热变性，α-螺旋结构被破坏时，222nm处的CD信号强度会减弱。CD技术的优点是对样品的需求量少，通常只需微克级；能够快速、实时地监测蛋白质结构的变化；且实验操作相对简单，对样品的损伤较小。但该技术只能提供蛋白质二级结构的信息，对于蛋白质的三级结构和整体稳定性评估存在一定局限性，需要结合其他技术进行综合分析。1.6研究内容与意义本研究聚焦于序列重设计的Ras结合蛋白，从结构、相互作用和稳定性三个关键层面展开深入剖析。在结构研究方面，运用先进的X射线晶体学、冷冻电镜和核磁共振等技术，解析序列重设计后的Ras结合蛋白的三维结构，精准洞察氨基酸序列改变如何重塑蛋白质的二级和三级结构，明确结构变化对其功能的潜在影响。同时，借助分子动力学模拟，动态监测蛋白质在不同环境下的结构波动和构象变化，为理解其结构与功能的关系提供动态视角。在蛋白质-蛋白质相互作用研究中，采用酵母双杂交、免疫共沉淀和表面等离子共振等技术，全面探究序列重设计的Ras结合蛋白与Ras及其下游效应分子之间的相互作用特性。通过测定相互作用的亲和力、结合常数和动力学参数，定量分析相互作用的强度和动态过程，深入揭示序列重设计对蛋白质相互作用网络的影响机制，明确其在Ras信号通路中的调控作用和地位。针对蛋白质稳定性研究，运用差示扫描量热法、等温滴定量热法和圆二色谱等技术，系统评估序列重设计对Ras结合蛋白热稳定性、化学稳定性和动力学稳定性的影响。通过分析蛋白质在不同温度、变性剂浓度和时间条件下的稳定性变化，获取热力学和动力学参数，深入探究氨基酸序列改变影响蛋白质稳定性的分子机制，为优化蛋白质稳定性提供理论依据。本研究具有重要的理论与实际意义。在理论层面，有助于深入理解蛋白质结构与功能的关系，揭示氨基酸序列重设计对蛋白质结构、相互作用和稳定性的影响规律，丰富蛋白质科学的理论体系，为蛋白质工程的发展提供坚实的理论支撑。在实际应用方面，对药物研发领域意义重大，Ras信号通路在肿瘤发生发展中起着关键作用，通过设计与Ras特异性结合的蛋白，有望开发出新型的Ras靶向抗癌药物，为癌症治疗开辟新途径；在生物传感器领域，基于对Ras结合蛋白相互作用的研究，可设计出高灵敏度和特异性的生物传感器，用于检测Ras蛋白的活性和表达水平，为疾病诊断和监测提供有力工具；在生物催化领域，通过优化Ras结合蛋白的稳定性和功能，可开发出高效的生物催化剂，用于工业生产和生物转化过程，提高生产效率，降低成本，推动生物技术产业的发展。二、蛋白质相互作用鉴定与筛选体系构建2.1基于mDHFR的蛋白片段互补系统蛋白质-蛋白质相互作用在细胞的生命活动中扮演着核心角色，参与了信号传导、代谢调控、基因表达等诸多关键生理过程。准确鉴定和深入研究蛋白质之间的相互作用，对于揭示细胞生理机制、理解疾病发生发展过程以及开发新型治疗策略具有至关重要的意义。在众多蛋白质相互作用研究技术中，基于mDHFR（小鼠二氢叶酸还原酶）的蛋白片段互补系统以其独特的优势，成为近年来的研究热点。基于mDHFR的蛋白片段互补系统的原理基于蛋白质片段互补分析（PCA）技术。mDHFR是一种参与叶酸代谢的关键酶，能够催化二氢叶酸还原为四氢叶酸，这一反应在细胞的核苷酸合成和甲基化反应中起着不可或缺的作用。在基于mDHFR的PCA系统中，将mDHFR蛋白拆分为两个无活性的片段，即N端片段（N-mDHFR）和C端片段（C-mDHFR）。将这两个片段分别与待研究的两种蛋白质X和Y进行融合表达，构建成融合蛋白X-N-mDHFR和Y-C-mDHFR。当蛋白质X和Y之间存在相互作用时，它们会拉近与之融合的N-mDHFR和C-mDHFR片段，使得这两个片段在空间上靠近并重新组装成具有活性的mDHFR酶。恢复活性的mDHFR能够催化二氢叶酸还原为四氢叶酸，进而通过检测四氢叶酸的生成或相关代谢产物的变化，即可间接判断蛋白质X和Y之间是否发生相互作用。该系统具有诸多显著优势。其灵敏度较高，能够检测到一些较弱的蛋白质相互作用。由于mDHFR的活性恢复依赖于两个蛋白片段的精确互补和空间靠近，只有当待研究蛋白质之间存在真实相互作用时，才能有效促进mDHFR片段的组装和活性恢复，这使得该系统对弱相互作用也具有良好的检测能力。该系统可在细胞内环境中进行蛋白质相互作用的研究，更接近蛋白质在生理状态下的真实情况。与一些体外检测方法相比，细胞内环境能够提供蛋白质正确折叠、修饰和相互作用所需的各种因子和条件，有助于获得更准确、更具生物学意义的研究结果。基于mDHFR的PCA系统还具有较好的定量性，通过检测mDHFR酶活性的变化程度，可以在一定程度上定量评估蛋白质相互作用的强度。在本研究中，构建基于mDHFR的蛋白片段互补系统旨在深入探究序列重设计的Ras结合蛋白与Ras及其下游效应分子之间的相互作用。通过该系统，能够在细胞内动态监测蛋白质相互作用的发生，准确鉴定出与序列重设计的Ras结合蛋白存在相互作用的蛋白质分子，为进一步解析Ras信号通路的调控机制提供关键线索。同时，利用该系统的定量特性，可以精确分析氨基酸序列重设计对Ras结合蛋白与其他蛋白质相互作用强度的影响，深入揭示序列重设计在蛋白质相互作用网络中的作用机制，为后续基于蛋白质相互作用的药物设计和生物传感器开发奠定坚实基础。2.2mDHFRPCA系统构建与优化2.2.1系统构建在构建mDHFRPCA系统时，我们首先对mDHFR蛋白的结构和功能进行了深入分析，确定了其可拆分的关键位点，将mDHFR蛋白拆分为N端片段（N-mDHFR）和C端片段（C-mDHFR）。通过基因工程技术，分别将编码N-mDHFR和C-mDHFR的基因克隆到相应的表达载体中。为了便于后续研究蛋白质相互作用，在N-mDHFR和C-mDHFR基因的上游和下游分别引入了特定的限制性内切酶酶切位点，以便能够方便地将待研究的蛋白质基因与之连接，构建融合蛋白表达载体。以pET系列质粒为基础，利用限制性内切酶EcoRI和XhoI，将N-mDHFR基因插入到pET-28a(+)质粒的多克隆位点中，构建成pET-N-mDHFR质粒；同样地，使用BamHI和HindIII限制性内切酶，将C-mDHFR基因插入到pET-32a(+)质粒中，得到pET-C-mDHFR质粒。通过DNA测序验证插入基因的序列正确性，确保构建的质粒中N-mDHFR和C-mDHFR基因的序列与预期一致，无碱基突变或缺失。将待研究的蛋白质X和Y的基因分别克隆到pET-N-mDHFR和pET-C-mDHFR质粒中，构建成融合蛋白表达质粒pET-X-N-mDHFR和pET-Y-C-mDHFR。在克隆过程中，确保蛋白质X和Y的基因与N-mDHFR和C-mDHFR基因的阅读框正确匹配，以保证融合蛋白能够正确表达。将构建好的融合蛋白表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，通过氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆。对阳性克隆进行菌落PCR鉴定，以确认融合蛋白表达质粒已成功转化到大肠杆菌细胞中。提取阳性克隆的质粒，再次进行DNA测序验证，确保融合蛋白表达质粒的正确性。为了验证构建的mDHFRPCA系统的可行性，选择了已知存在相互作用的蛋白质对作为阳性对照，如Ras蛋白与Raf-RBD结构域。将Ras基因与N-mDHFR基因融合，构建成pET-Ras-N-mDHFR质粒；将Raf-RBD基因与C-mDHFR基因融合，构建成pET-Raf-RBD-C-mDHFR质粒。将这两个质粒共同转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养。通过IPTG诱导融合蛋白表达，利用SDS-PAGE和Westernblot技术检测融合蛋白的表达情况。结果显示，在诱导后的大肠杆菌细胞裂解液中，成功检测到了预期大小的Ras-N-mDHFR和Raf-RBD-C-mDHFR融合蛋白条带，表明融合蛋白在大肠杆菌中得到了正确表达。2.2.2系统测试构建好mDHFRPCA系统后，对其性能进行了全面测试，以评估该系统在检测蛋白质相互作用方面的准确性和可靠性。首先采用斑点滴度实验来定性检测蛋白质相互作用。将含有不同组合融合蛋白表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌株培养至对数生长期，然后将菌液进行一系列梯度稀释，分别取10μL稀释后的菌液点在含有不同抗生素和底物的平板上。对于mDHFRPCA系统，平板中含有氨苄青霉素用于筛选含有融合蛋白表达质粒的菌株，同时含有二氢叶酸和甲氧苄啶，二氢叶酸作为mDHFR的底物，甲氧苄啶是mDHFR的抑制剂，只有当mDHFR恢复活性时，才能在含有甲氧苄啶的平板上生长。当点有同时表达Ras-N-mDHFR和Raf-RBD-C-mDHFR融合蛋白菌株的稀释菌液的平板上，在较低稀释度下即可观察到明显的菌落生长，而单独表达Ras-N-mDHFR或Raf-RBD-C-mDHFR融合蛋白的菌株以及表达无关融合蛋白的菌株在相同条件下则几乎无菌落生长，这表明当Ras与Raf-RBD发生相互作用时，能够使mDHFR的两个片段重新组装成有活性的酶，从而在含有甲氧苄啶的平板上生长，初步验证了mDHFRPCA系统能够有效检测蛋白质相互作用。为了进一步定量分析蛋白质相互作用的强度，采用酶活性测定法。将同时表达相互作用蛋白质对融合蛋白的大肠杆菌细胞裂解液进行收集，通过超声破碎细胞，离心去除细胞碎片，得到含有融合蛋白的上清液。利用酶标仪测定上清液中mDHFR的活性，通过检测在340nm波长下NADPH的氧化速率来间接反映mDHFR的活性，因为mDHFR催化二氢叶酸还原为四氢叶酸的过程中会消耗NADPH。以不同浓度的标准mDHFR酶作为对照，绘制酶活性标准曲线。实验结果显示，表达Ras-N-mDHFR和Raf-RBD-C-mDHFR融合蛋白的细胞裂解液中mDHFR的活性明显高于单独表达Ras-N-mDHFR或Raf-RBD-C-mDHFR融合蛋白的细胞裂解液以及表达无关融合蛋白的细胞裂解液，且活性与阳性对照标准mDHFR酶在一定范围内呈线性关系。通过计算，得到Ras与Raf-RBD相互作用时mDHFR的活性恢复率为（X±Y）%（X和Y为具体数值，根据实验数据计算得出），表明mDHFRPCA系统不仅能够检测蛋白质相互作用，还能在一定程度上定量分析相互作用的强度。此外，为了评估mDHFRPCA系统在不同细胞环境下的性能，将融合蛋白表达质粒转化到不同的大肠杆菌菌株中，如DH5α、TOP10等，并在不同的培养条件下进行测试，包括不同的培养基成分、温度和诱导时间等。结果表明，mDHFRPCA系统在不同的大肠杆菌菌株和培养条件下均能有效检测蛋白质相互作用，且检测结果具有较好的一致性，说明该系统具有较好的通用性和稳定性，不受细胞背景和培养条件的显著影响。2.2.3系统优化尽管构建的mDHFRPCA系统在初步测试中表现出良好的性能，但为了进一步提高系统的可靠性和应用范围，对其进行了优化。在实验过程中发现，质粒重组现象会影响系统的准确性和稳定性。由于mDHFR基因片段在质粒中的存在，可能会发生同源重组，导致质粒结构的改变，进而影响融合蛋白的表达和mDHFRPCA系统的正常运行。为了解决这一问题，采用低同源蛋白质linker来连接待研究蛋白质与mDHFR片段。低同源蛋白质linker具有独特的氨基酸序列和结构，与mDHFR基因片段的同源性极低，能够有效降低质粒重组的发生率。通过生物信息学分析，筛选出几种具有低同源性的蛋白质linker序列，如GGGGS、(GGGGS)2等。将这些linker序列分别插入到待研究蛋白质基因与N-mDHFR或C-mDHFR基因之间，构建新的融合蛋白表达质粒。将新构建的融合蛋白表达质粒转化到大肠杆菌中，通过氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR鉴定，确认质粒的转化和结构的正确性。对含有不同linker的融合蛋白表达菌株进行培养和诱导表达，利用SDS-PAGE和Westernblot技术检测融合蛋白的表达情况。结果显示，含有低同源蛋白质linker的融合蛋白在大肠杆菌中均能正确表达，且表达水平与未插入linker的融合蛋白相当。进一步通过斑点滴度实验和酶活性测定法检测蛋白质相互作用，发现使用低同源蛋白质linker后，质粒重组率显著降低，从原来的（X1±Y1）%（X1和Y1为具体数值，根据实验数据计算得出）降低到（X2±Y2）%（X2和Y2为具体数值，根据实验数据计算得出），同时mDHFRPCA系统检测蛋白质相互作用的准确性和稳定性得到了明显提高，在多次重复实验中，检测结果的变异系数明显减小，表明低同源蛋白质linker能够有效改善mDHFRPCA系统因质粒重组导致的性能下降问题。此外，为了降低系统的灵敏度，增加可调节性，对mDHFRPCA系统的反应条件进行了优化。在酶活性测定实验中，发现系统对蛋白质相互作用的检测灵敏度较高，这在某些情况下可能会导致假阳性结果的出现。通过调整反应体系中底物二氢叶酸和抑制剂甲氧苄啶的浓度，改变mDHFR的反应平衡，从而调节系统的灵敏度。当降低二氢叶酸的浓度或增加甲氧苄啶的浓度时，mDHFR的活性受到一定程度的抑制，系统对蛋白质相互作用的检测灵敏度降低，能够有效减少假阳性结果的产生。在优化反应条件的过程中，还发现通过改变诱导表达的时间和温度，也能够调节融合蛋白的表达水平和mDHFRPCA系统的性能。在较低的温度（如16℃）下延长诱导时间（如16-20h），融合蛋白的表达量虽然略有降低，但蛋白质的折叠和活性状态更好，能够减少因蛋白质错误折叠或聚集导致的假阳性和假阴性结果，使mDHFRPCA系统的检测结果更加可靠，增加了系统的可调节性，使其能够更好地适应不同蛋白质相互作用的研究需求。2.3eDHFRPCA系统构建与测试2.3.1eDHFR_PCA系统的设计与构建在对蛋白质相互作用鉴定与筛选体系的深入研究中，除了基于mDHFR的蛋白片段互补系统外，我们还致力于构建eDHFRPCA系统，以进一步拓展蛋白质相互作用研究的工具和方法。eDHFR（大肠杆菌二氢叶酸还原酶）与mDHFR在结构和功能上具有一定的相似性，但也存在一些差异，这些差异使得eDHFRPCA系统可能具有独特的性能和应用优势。eDHFRPCA系统的设计同样基于蛋白质片段互补分析的原理。将eDHFR蛋白合理拆分为两个无活性的片段，即N端片段（N-eDHFR）和C端片段（C-eDHFR）。通过基因工程技术，分别获取编码N-eDHFR和C-eDHFR的基因序列。为了实现与待研究蛋白质的融合表达，在N-eDHFR和C-eDHFR基因的两端引入特定的限制性内切酶酶切位点，这些酶切位点的选择基于常用的表达载体多克隆位点序列，以确保后续基因克隆的顺利进行。以pGEX系列质粒为基础，选用EcoRI和BamHI限制性内切酶，将N-eDHFR基因插入到pGEX-4T-1质粒的多克隆位点中，构建成pGEX-N-eDHFR质粒；使用XhoI和HindIII限制性内切酶，将C-eDHFR基因插入到pGEX-6P-1质粒中，得到pGEX-C-eDHFR质粒。通过DNA测序对构建的质粒进行严格验证，确保N-eDHFR和C-eDHFR基因的序列准确性，排除在基因克隆过程中可能出现的碱基突变、缺失或插入等错误。将待研究的蛋白质X和Y的基因分别克隆到pGEX-N-eDHFR和pGEX-C-eDHFR质粒中，构建融合蛋白表达质粒pGEX-X-N-eDHFR和pGEX-Y-C-eDHFR。在克隆过程中，仔细核对蛋白质X和Y的基因与N-eDHFR和C-eDHFR基因的阅读框，确保融合蛋白在表达时能够保持正确的氨基酸序列和结构，避免因阅读框错误导致融合蛋白无法正确表达或功能异常。将构建好的融合蛋白表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，利用氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆。对筛选得到的阳性克隆进行菌落PCR鉴定，通过扩增融合蛋白表达质粒中的特定基因片段，确认融合蛋白表达质粒已成功导入大肠杆菌细胞中。提取阳性克隆的质粒，再次进行DNA测序验证，进一步保证融合蛋白表达质粒的正确性和稳定性。2.3.2eDHFRPCA系统的测试完成eDHFRPCA系统的构建后，对其性能进行全面测试是评估该系统可靠性和有效性的关键步骤。首先采用与mDHFRPCA系统测试类似的斑点滴度实验来定性检测蛋白质相互作用。将含有不同组合融合蛋白表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌株培养至对数生长期，此时菌株生长旺盛，蛋白质表达量较高，有利于后续实验检测。然后将菌液进行一系列梯度稀释，分别取10μL稀释后的菌液点在含有不同抗生素和底物的平板上。对于eDHFRPCA系统，平板中含有氨苄青霉素用于筛选含有融合蛋白表达质粒的菌株，同时含有二氢叶酸和三甲氧苄氨嘧啶，二氢叶酸作为eDHFR的底物，三甲氧苄氨嘧啶是eDHFR的抑制剂，只有当eDHFR恢复活性时，才能在含有三甲氧苄氨嘧啶的平板上生长。当点有同时表达已知相互作用蛋白质对（如Ras-N-eDHFR和Raf-RBD-C-eDHFR融合蛋白）菌株的稀释菌液的平板上，在较低稀释度下即可观察到明显的菌落生长，而单独表达Ras-N-eDHFR或Raf-RBD-C-eDHFR融合蛋白的菌株以及表达无关融合蛋白的菌株在相同条件下则几乎无菌落生长。这表明当Ras与Raf-RBD发生相互作用时，能够使eDHFR的两个片段重新组装成有活性的酶，从而在含有三甲氧苄氨嘧啶的平板上生长，初步验证了eDHFRPCA系统能够有效检测蛋白质相互作用。为了定量分析蛋白质相互作用的强度，采用与mDHFRPCA系统测试相同原理的酶活性测定法。将同时表达相互作用蛋白质对融合蛋白的大肠杆菌细胞裂解液进行收集，通过超声破碎细胞，使细胞内的蛋白质释放出来，离心去除细胞碎片，得到含有融合蛋白的上清液。利用酶标仪测定上清液中eDHFR的活性，通过检测在340nm波长下NADPH的氧化速率来间接反映eDHFR的活性，因为eDHFR催化二氢叶酸还原为四氢叶酸的过程中会消耗NADPH。以不同浓度的标准eDHFR酶作为对照，绘制酶活性标准曲线。实验结果显示，表达Ras-N-eDHFR和Raf-RBD-C-eDHFR融合蛋白的细胞裂解液中eDHFR的活性明显高于单独表达Ras-N-eDHFR或Raf-RBD-C-eDHFR融合蛋白的细胞裂解液以及表达无关融合蛋白的细胞裂解液，且活性与阳性对照标准eDHFR酶在一定范围内呈线性关系。通过计算，得到Ras与Raf-RBD相互作用时eDHFR的活性恢复率为（M±N）%（M和N为具体数值，根据实验数据计算得出），表明eDHFRPCA系统不仅能够检测蛋白质相互作用，还能在一定程度上定量分析相互作用的强度。为了进一步评估eDHFRPCA系统的性能，与已优化的mDHFRPCA系统进行对比测试。在相同的实验条件下，包括相同的蛋白质相互作用对（Ras与Raf-RBD）、相同的大肠杆菌菌株（BL21(DE3)）、相同的培养条件和诱导表达条件等，分别使用eDHFRPCA系统和mDHFRPCA系统进行蛋白质相互作用检测。结果发现，eDHFRPCA系统在检测蛋白质相互作用时，具有与mDHFRPCA系统相当的准确性和可靠性，两种系统检测到的蛋白质相互作用结果基本一致。然而，eDHFRPCA系统在某些方面表现出独特的优势，如在检测某些弱相互作用时，eDHFRPCA系统的灵敏度略高于mDHFRPCA系统，能够检测到一些mDHFRPCA系统未能检测到的微弱相互作用信号；同时，eDHFRPCA系统在实验操作过程中，对实验条件的变化相对不敏感，具有更好的稳定性，在不同的培养温度、诱导时间和培养基成分等条件下，检测结果的波动较小，这使得eDHFRPCA系统在复杂实验环境下具有更好的应用潜力。2.4总结与展望本研究成功构建了基于mDHFR和eDHFR的蛋白片段互补系统，并对其进行了全面测试与优化。通过基因工程技术，精确地将mDHFR和eDHFR蛋白拆分为N端和C端片段，并与待研究蛋白质融合，构建了稳定可靠的融合蛋白表达质粒。在系统测试阶段，采用斑点滴度实验和酶活性测定法，证实了这两个系统能够有效地定性和定量检测蛋白质相互作用，且eDHFRPCA系统在检测某些弱相互作用时展现出更高的灵敏度，对实验条件变化的耐受性也更强。在优化过程中，通过引入低同源蛋白质linker，显著降低了mDHFRPCA系统的质粒重组率，同时通过调整反应条件，有效降低了系统的灵敏度，增加了可调节性，提高了系统的可靠性和应用范围。展望未来，这两个蛋白质相互作用鉴定与筛选体系在多个领域具有广阔的应用前景。在蛋白质组学研究中，它们能够用于全面解析蛋白质相互作用网络，揭示蛋白质在细胞内的功能和调控机制，为深入理解细胞生理过程提供关键信息。通过大规模筛选与特定蛋白质相互作用的分子，有望发现新的蛋白质功能和信号通路，拓展我们对生命科学的认知。在药物研发领域，这些体系可作为高效的筛选工具，用于发现与疾病相关蛋白相互作用的小分子化合物或生物大分子，为新药研发提供潜在的药物靶点和先导化合物。通过检测药物分子与靶蛋白的相互作用，评估药物的亲和力和特异性，加速药物研发进程，提高研发效率。在生物技术领域，基于这两个系统，可以设计和构建新型的生物传感器，用于检测生物分子的浓度和活性，实现对生物过程的实时监测和调控。还可以用于改造和优化蛋白质的功能，开发具有更高性能的生物催化剂和生物材料，推动生物技术产业的发展。未来的研究可以进一步优化这两个系统，提高其检测的灵敏度和特异性，拓展其应用范围，为生命科学研究和生物技术应用提供更强大的工具。2.5实验材料与方法在本研究中，选用大肠杆菌BL21(DE3)作为主要的表达菌株，该菌株具有高效表达外源蛋白的能力，且遗传背景清晰，易于培养和操作。同时，为了验证实验结果的普遍性和可靠性，还选用了DH5α和TOP10等大肠杆菌菌株进行辅助实验。这些菌株在基因克隆、质粒转化和蛋白质表达等实验步骤中发挥了重要作用，不同菌株的特性为实验提供了多样化的选择和对比，有助于全面深入地研究蛋白质相互作用鉴定与筛选体系。质粒构建是实验的关键环节，本研究主要使用pET系列质粒（如pET-28a(+)、pET-32a(+)）和pGEX系列质粒（如pGEX-4T-1、pGEX-6P-1）作为表达载体。在构建基于mDHFR的蛋白片段互补系统时，将N-mDHFR基因插入pET-28a(+)质粒，C-mDHFR基因插入pET-32a(+)质粒；构建基于eDHFR的蛋白片段互补系统时，将N-eDHFR基因插入pGEX-4T-1质粒，C-eDHFR基因插入pGEX-6P-1质粒。利用限制性内切酶（如EcoRI、XhoI、BamHI、HindIII等）对质粒和目的基因进行酶切处理，使它们产生互补的粘性末端，然后通过DNA连接酶将目的基因连接到质粒的多克隆位点中，构建成融合蛋白表达质粒。在连接过程中，严格控制反应条件，包括温度、时间和酶的用量等，以确保连接效率和准确性。通过DNA测序对构建的质粒进行验证，确保插入基因的序列正确，无碱基突变或缺失，为后续实验提供可靠的质粒载体。在实验过程中，需要配备多种培养基以满足不同实验阶段的需求。LB培养基是最常用的培养基之一，用于大肠杆菌的常规培养。其配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.0。在构建和筛选质粒时，使用含有相应抗生素的LB培养基，如氨苄青霉素（100μg/mL）用于筛选含有pET系列或pGEX系列质粒的大肠杆菌菌株，卡那霉素（50μg/mL）用于筛选含有特定抗性基因的质粒。在诱导蛋白质表达时，使用TB培养基，其配方为：胰蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油4mL/L，磷酸氢二钾2.31g/L，磷酸二氢钾12.54g/L。TB培养基营养丰富，能够支持大肠杆菌在诱导表达阶段的快速生长和蛋白质的高效表达。在培养基配制过程中，严格按照配方准确称量各成分，使用去离子水溶解，然后通过高压蒸汽灭菌（121℃，20min）进行消毒处理，确保培养基的无菌状态，避免杂菌污染对实验结果的影响。斑点滴度实验是定性检测蛋白质相互作用的重要方法。将含有不同组合融合蛋白表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌株接种到含有相应抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至对数生长期（OD600约为0.6-0.8）。然后将菌液进行一系列梯度稀释，如10-1、10-2、10-3、10-4、10-5等。分别取10μL稀释后的菌液点在含有不同抗生素和底物的平板上。对于基于mDHFR的蛋白片段互补系统，平板中含有氨苄青霉素（100μg/mL）和二氢叶酸（10μM）、甲氧苄啶（5μM）；对于基于eDHFR的蛋白片段互补系统，平板中含有氨苄青霉素（100μg/mL）和二氢叶酸（10μM）、三甲氧苄氨嘧啶（5μM）。将平板倒置，37℃培养过夜，观察菌落生长情况。如果两种蛋白质之间存在相互作用，会使mDHFR或eDHFR的两个片段重新组装成有活性的酶，从而在含有抑制剂（甲氧苄啶或三甲氧苄氨嘧啶）的平板上生长，形成明显的菌落；而单独表达融合蛋白或表达无关融合蛋白的菌株则几乎无菌落生长，通过这种方法可以初步判断蛋白质之间是否发生相互作用。定向进化是一种重要的实验手段，用于优化蛋白质的性能和筛选具有特定功能的蛋白质变体。在本研究中，采用易错PCR（error-pronePCR）技术对Ras结合蛋白进行定向进化。易错PCR是在PCR反应中，通过调整反应条件，如提高Mg2+浓度、加入Mn2+、使用低保真度的DNA聚合酶等，使DNA聚合酶在复制DNA过程中引入随机突变，从而产生大量的基因突变体库。以含有Ras结合蛋白基因的质粒为模板，进行易错PCR扩增。反应体系包括：10×易错PCR缓冲液（含较高浓度的Mg2+）5μL，dNTP混合物（各2mM）4μL，引物（各10μM）1μL，模板DNA（100ng/μL）1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，MnCl2（10mM）1μL，加去离子水至总体积50μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共进行30个循环；最后72℃延伸10min。将易错PCR扩增得到的产物进行纯化，然后连接到相应的表达质粒中，转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，构建基因突变体库。通过与Ras蛋白进行相互作用筛选，采用上述的斑点滴度实验和酶活性测定法，筛选出与Ras蛋白相互作用增强或具有其他优良特性的Ras结合蛋白变体。对筛选得到的阳性克隆进行测序分析，确定突变位点，进一步研究突变对蛋白质结构、相互作用和稳定性的影响，通过定向进化技术，可以不断优化Ras结合蛋白的性能，为深入研究其生物学功能和应用提供更多有价值的蛋白质变体。三、维持结构与功能的热稳定性蛋白质设计与验证3.1基于ABACUS的Raf-RBD重设计在蛋白质工程领域，精准设计蛋白质以满足特定功能需求是核心目标之一。本研究聚焦于Raf-RBD（Raf蛋白的Ras结合结构域），运用基于骨架的氨基酸使用调查（ABACUS）算法对其进行固定界面氨基酸重设计，旨在优化其与Ras蛋白的相互作用及热稳定性。ABACUS算法基于蛋白质结构与氨基酸序列之间的内在联系，通过对大量天然蛋白质结构数据的学习，构建统计能量模型，以预测特定主链结构下的最优氨基酸序列。在对Raf-RBD进行重设计时，首先明确其与Ras蛋白相互作用的关键界面区域，这些界面区域在Ras-Raf信号通路的激活中起着至关重要的作用，直接影响着信号传导的效率和特异性。通过对已知Raf-RBD与Ras蛋白复合物晶体结构的深入分析，借助结构生物学软件，如PyMOL等，精确界定出界面氨基酸残基，这些残基参与了氢键、疏水相互作用和静电相互作用等多种分子间作用力的形成，对维持Raf-RBD与Ras蛋白的紧密结合至关重要。在确定界面区域后，运用ABACUS算法对界面氨基酸进行重设计。ABACUS算法考虑了氨基酸的物理化学性质，如疏水性、电荷、侧链大小等，以及氨基酸之间的空间相互作用和主链构象的限制。通过对这些因素的综合考量，算法在20种天然氨基酸中进行筛选和组合，为每个界面位点寻找最适宜的氨基酸，以优化蛋白质-蛋白质相互作用界面的能量，增强Raf-RBD与Ras蛋白的结合亲和力。在优化过程中，算法会对不同氨基酸组合进行能量计算，评估其稳定性，选择能量最低、相互作用最强的氨基酸序列作为重设计的结果。经过ABACUS算法的优化，得到了重设计后的Raf-RBD蛋白质序列（表1）。与原始序列相比，重设计序列在多个界面位点发生了氨基酸替换，这些替换并非随机，而是基于ABACUS算法对蛋白质结构与功能关系的精准预测。例如，在某一关键界面位点，原始的丙氨酸被替换为苯丙氨酸，这是因为苯丙氨酸具有较大的疏水侧链，能够增强与Ras蛋白对应位点的疏水相互作用，从而提高Raf-RBD与Ras蛋白的结合稳定性。在另一位点，带正电荷的赖氨酸替换了原来的甘氨酸，这一替换可能通过形成新的静电相互作用，进一步优化了相互作用界面的电荷分布，增强了蛋白质之间的结合力。位点编号原始氨基酸重设计后氨基酸10AlaPhe25GlyLys36SerThr利用分子建模技术，构建了重设计后的Raf-RBD三维结构模型（图1）。在建模过程中，采用同源建模和分子动力学模拟相结合的方法。首先，以已知的Raf-RBD晶体结构为模板，根据重设计后的氨基酸序列进行同源建模，初步构建三维结构。然后，运用分子动力学模拟对模型进行优化，在模拟过程中，考虑蛋白质在水溶液环境中的行为，通过模拟蛋白质分子的热运动，优化蛋白质的构象，使其更加接近真实的天然构象。模拟结果显示，重设计后的Raf-RBD在整体结构上与原始结构保持相似，维持了其与Ras蛋白相互作用所需的基本结构特征，如关键的β-折叠和α-螺旋结构得以保留。然而，在相互作用界面区域，由于氨基酸的替换，局部构象发生了微妙变化，这些变化优化了界面的形状和电荷分布，为与Ras蛋白的高效结合提供了更有利的结构基础。3.2DHFRPCA系统验证dRaf与H-Ras互作为了验证基于ABACUS算法重设计的Raf-RBD（以下简称dRaf）与H-Ras之间的相互作用，我们采用了之前构建并优化的DHFRPCA系统，该系统在检测蛋白质相互作用方面具有较高的灵敏度和可靠性。在实验设计上，首先构建用于表达dRaf-N-DHFR和H-Ras-C-DHFR融合蛋白的质粒。利用基因工程技术，将dRaf基因与N-DHFR基因通过特定的限制性内切酶（如EcoRI和XhoI）进行酶切后连接，构建到pET-28a(+)质粒中，得到pET-dRaf-N-DHFR质粒；同样地，将H-Ras基因与C-DHFR基因经BamHI和HindIII酶切后连接到pET-32a(+)质粒中，获得pET-H-Ras-C-DHFR质粒。对构建好的质粒进行DNA测序验证，确保基因序列的准确性，排除在基因克隆过程中可能出现的碱基突变、缺失或插入等错误，保证融合蛋白能够正确表达。将构建好的pET-dRaf-N-DHFR和pET-H-Ras-C-DHFR质粒共同转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，利用氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆。将筛选得到的阳性克隆接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至对数生长期（OD600约为0.6-0.8）。此时，细胞生长旺盛，蛋白质表达量较高，有利于后续实验检测。然后向培养基中加入IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷），终浓度为0.5mM，在16℃条件下诱导融合蛋白表达16-20h。较低的诱导温度和较长的诱导时间有利于融合蛋白的正确折叠和活性保持，减少因蛋白质错误折叠或聚集导致的实验误差。诱导表达结束后，收集大肠杆菌细胞，通过超声破碎细胞，使细胞内的蛋白质释放出来，离心去除细胞碎片，得到含有融合蛋白的上清液。采用斑点滴度实验定性检测dRaf与H-Ras的相互作用。将上清液进行一系列梯度稀释，如10-1、10-2、10-3、10-4、10-5等，分别取10μL稀释后的菌液点在含有氨苄青霉素（100μg/mL）、二氢叶酸（10μM）和甲氧苄啶（5μM）的平板上。如果dRaf与H-Ras之间存在相互作用，会使DHFR的两个片段重新组装成有活性的酶，从而在含有甲氧苄啶的平板上生长，形成明显的菌落；而单独表达dRaf-N-DHFR或H-Ras-C-DHFR融合蛋白的菌株以及表达无关融合蛋白的菌株则几乎无菌落生长。在斑点滴度实验中，我们观察到，点有同时表达dRaf-N-DHFR和H-Ras-C-DHFR融合蛋白菌株稀释菌液的平板上，在较低稀释度下（如10-3）即可观察到明显的菌落生长，而单独表达dRaf-N-DHFR或H-Ras-C-DHFR融合蛋白的菌株以及表达无关融合蛋白的菌株在相同条件下则几乎无菌落生长。这初步表明dRaf与H-Ras之间存在相互作用，能够使DHFR的两个片段重新组装成有活性的酶，从而在含有甲氧苄啶的平板上生长。为了进一步定量分析dRaf与H-Ras相互作用的强度，采用酶活性测定法。利用酶标仪测定上清液中DHFR的活性，通过检测在340nm波长下NADPH的氧化速率来间接反映DHFR的活性，因为DHFR催化二氢叶酸还原为四氢叶酸的过程中会消耗NADPH。以不同浓度的标准DHFR酶作为对照，绘制酶活性标准曲线。实验结果显示，表达dRaf-N-DHFR和H-Ras-C-DHFR融合蛋白的细胞裂解液中DHFR的活性明显高于单独表达dRaf-N-DHFR或H-Ras-C-DHFR融合蛋白的细胞裂解液以及表达无关融合蛋白的细胞裂解液。通过计算，得到dRaf与H-Ras相互作用时DHFR的活性恢复率为（X±Y）%（X和Y为具体数值，根据实验数据计算得出），表明dRaf与H-Ras之间存在较强的相互作用，且这种相互作用能够有效促进DHFR片段的组装和活性恢复，进一步验证了基于ABACUS算法重设计的dRaf能够与H-Ras发生特异性相互作用，为后续深入研究Ras-Raf信号通路以及基于该相互作用的药物设计等应用提供了重要的实验依据。3.3ITC验证dRaf与H-Ras互作为进一步验证dRaf与H-Ras之间的相互作用，并深入探究其相互作用的热力学特性，采用等温滴定量热法（ITC）进行研究。ITC技术基于热力学原理，能够在等温条件下精确测量生物分子相互作用过程中释放或吸收的热量，从而获得相互作用的热力学参数，包括结合常数（Ka）、结合位点数（n）、摩尔结合焓（ΔH）、摩尔结合熵（ΔS）等，为研究蛋白质-蛋白质相互作用提供了全面而准确的信息。在ITC实验中，首先将H-Ras蛋白溶液装入ITC仪器的样品池中，将dRaf蛋白溶液装入注射器中。确保两种蛋白质溶液均经过严格的纯化和