天然产物化学成分提取分离方法课件

4.大孔吸附树脂大孔吸附树脂是一种没有何解

离基团具有大孔结构的高分子吸附

剂。分为非极性与中等极性两类。吸附性与分子筛原理相结合的分离材料。影响因素：大孔吸附树脂的特性、被分离物质及溶剂的性质均影响着分离结果。(1)分子极性极性大成分——易被极性树脂吸附，被分离成分与大孔树脂形成氢键的基

团越多，吸附力越强，极性大

的有机溶剂合适。

极性小的成分——易被非极性树脂附，极性小的洗脱剂，洗脱能力强。(2)分子体积对非极性大孔树脂而言；合物体积

越大，吸附力越强，这与大体积分子的疏水性有关。型号选择：分离大分子，大孔的树脂分离小分子，小孔的树脂(3)溶液的pH酸(碱)性化合物—

—

适当的酸(碱)性溶液中吸附；中性化合物——中性溶液中可被充分吸附(4)洗脱剂水、醇类、丙酮、乙酸乙酯等。(

5

)

应

用：天然化合物的分离与富集工作

如糖类、生物碱、黄酮、皂苷等。原理：小分子物质(无机盐、氨基酸等)在溶液中可通过半透膜，而大分子物质如多

糖、蛋白不能通过半透膜的性质达到分

离的目的。(五)根据物质的分子大小进征分保1.透

析

法：

用天然或人工合成的高分膜，

利用分子大小不同引起的扩散速度的差别对混合物进行分离提纯及浓缩的方法。(1)反渗透：(2)超滤：分离相对分子质量在500以上的组务(3)纳滤：介于反渗透和超滤之间，分离分子量在

200~2000之间。(4)微滤：用于超滤、纳滤、反渗透和其它膜分离

过程的预处理。(5)超速离心法：利用溶质在超速离心作用下具有不同的沉降性或浮游性而分离。2.凝胶过滤法：(也称分子筛过虑法、疑胶渗透色谱法)利用凝胶的三维网状结构的分子筛滤过作用使分子大小不同的物质得以分离。型

号

：葡聚糖凝胶(Sephadex

G一

25)羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex

LH一20(

六

根据物质的解离程度不同进行分离—离子交换吸法酸性、碱性及两性基团的化合物在水溶液中多呈解离状态，可以与离子交换树

脂上的基团交换，从而与其它非解离性物质分开。阳离子交换树脂：RSO₃-H++Na+C1RSO₃Na+月+Ci阴离子交换树脂：RN+OH

+Na+C1

RN+C1+Na+OH-应用：分离具有解离能力的酸性、碱性及两性

化合物，如生物碱、氨基酸、有机酸、酚类、肽类等天然药物化学成分。(七)结晶法：根据欲分离物质在有机溶剂中的溶解度差异及其与温度的依赖关系使某组分

从混合物中结晶析出的方法。在天然产物提取分离过程中，有时只要找

到合适的溶剂进行提取，提取液稍一浓缩就

有结晶析出。(八)色谱法(chromatography

)1、色谱法的基本原理：利用混合物中各组分的物理性质不同而在两相(固定相和流动相)之间的不均匀分配进行分离的一种方法。2、色谱法的分类

(1)按流动相类型进行分类：气相色谱、液相色谱(2)按操作形式进行分类：纸色谱(PC)、薄层色谱

(TLC)、

柱色谱

(CC)、

毛细管色谱(CTC)等。吸附色谱分配色谱离子交换色谱凝胶色谱亲和色谱吸附原理分配原理(萃取)离解作用和扩散作用分子筛、扩散作用生物对之间的特异性固体吸附剂

液体离子交换树脂

凝胶亲和剂吸附与解吸(3)按分离原理分：分离方法

分离原理类

型分析用高压液相色谱

(HPLC)制备用高压液相

色谱(HPLC)中压液相色谱(MPLC)低压液相色谱(MPLC)快速色谱压力(Pa)>20.2×10⁵>20.2×10⁵5.05~20.2×10⁵<5.05×10⁵约2.02×10⁵>5mg>5mg10mg~100mg>5mg加压液相色谱纸色谱的应用·

1.鉴定化合物·

2.检验化合物的纯度·

3.分离少量亲水性成分，如糖类、酚类、氨基酸、

多元醇等。

薄层色谱的应用·

1.鉴定化合物·2.检验化合物的纯度·

3.分离少量化合物4.指导提取溶剂的初步选择(R,值大于0.02以上)·5.指导分离条件的选择(提取次数、提取时间等)。苯-乙醚石油醚-乙酸乙酯

氯仿-乙醚氯仿-乙酸乙酯氯仿-甲醇丙酮-水甲醇-水1、吸附色谱：活性炭、硅藻土、分子筛，氧化铝

破胶、聚酰胺、凝胶、硅胶、聚酰胺、疑胶、美托树脂吸附色谱常用的混合溶剂(洗脱或展开)己烷-苯极性递增分离原理

吸附规律吸附原理

弱酸性、极性吸附剂对极性物质的吸附力较强

溶剂极性越小，吸附剂对

溶质的吸附力越强吸附原理

弱碱性、极性吸附剂吸附规律同上注：硅胶和氧化铝吸附色谱在进行展开或洗脱时，所用溶剂的极性宜逐步增加，跳跃不能太大，实践中多用混合溶剂，可通过调节比例以改变溶剂极性，达到梯度洗脱分离物质的目的。能用于极性物质、也

能用于非极性物质的

分离，但不适合碱性成分的分离碱性、中性成分的分离

不适合酸性成分的分离吸附剂硅胶(吸水

量超过17%

即不能用作

吸附剂)氧化铝(有中性、酸性、碱性)常用吸附色谱法简介注

：从活性炭上洗脱被吸附的物质时，洗脱剂的洗脱能力

随溶剂极性的减弱而增强。常用洗脱剂洗脱能力由小到大

的顺序为：水<10%乙醇<20%乙醇<30%乙醇<40%

乙醇<50%乙醇<75%乙醇<95%乙醇非极性物质具有较强的吸附力；

溶剂极性降低，则活性炭对溶质的

吸附力减弱分离原理吸附原理非极性吸附剂、

在水溶液中对吸附剂活性炭脱色(脂溶性色素)除杂、除臭吸附规律

吸附规律酚羟基数目多，吸附力强能形成分子内氢键者，吸附力下降母核芳香化程度高者，吸附力增强水(介质)中吸附力强，水洗脱力弱应用黄酮、蒽酿酚类的分离生物碱、萜类、甾体、糖类、氨基酸等的分离；植物粗提液的除鞣质处理。大孔吸附树脂吸附色谱的洗脱规律：对非极性大孔吸附树脂，洗脱液的极性越小，

洗脱能力越强；对极性大孔吸附树脂，洗脱液的极性越大，洗脱能力越强。各种溶剂对聚酰胺吸附色谱的洗脱能力由弱至强的顺序为：水

<甲

醇

<

丙

酮<NaOH

水溶液<甲酰胺<二甲基甲酰胺<尿素水溶液极性相近相吸；物质在溶剂中溶解

度增大，树脂对其吸附力下降；能与大孔吸附树脂形成氢键者易被吸附糖与苷的分离(从水提液富集苷类)、黄酮

三萜、生物碱等的精制大孔吸附

树脂(有极

性和非极

性两种)吸附原理氢键吸附吸附剂聚酰胺吸附性和

分子筛2、分配色谱(1)正相分配色谱：固定相的极性大于流动相的极性。以水或亲水性溶剂为固定相，与水不相混溶的有桃溶剂

为流动相。适用于分离水溶性或极性较大的组分。(2)反相分配色谱：固定相的极性小于流动相的极性。以亲脂性有机溶剂为固定相(石蜡油、RP-18、RP-8、RP-2),以水或亲水性溶剂为流动相。适用于分离脂溶性或极性较小的组分。(1)

正相分配色谱：载体：硅胶等(硅胶吸水>超过17%,

不

作

吸附剂，而作为载体)固定相：强极性溶剂，如水、缓冲溶液等流动相：氯仿、乙酸乙酯等弱极性有机溶剂洗脱规律：极性小成分先洗下极性大成分后洗下液-液分配色谱法(2

)反相分配色谱：亲脂性有机溶剂

—

—

固定相，水或亲水性溶剂——移动相。

固定相：可用石蜡油反相硅胶键合相RP-18

、RP-8

、RP-2流动相：水或甲醇等强极性溶剂洗脱规律：极性大的成分先洗下极性下的成分后洗下2.2.2、天然产物化学成分的精制与纯化·

重结晶法：利用化合物中各组分在溶剂中的溶解

度不同为分离依据的一种分离方法。·

蒸馏法：以液体混合物中各组分的挥发性不同作

为分离依据的一种分离方法。·

色谱法：利用不同物质在流动相和固定相中物理

性质不同而达到分离目的的一种分离方法系统溶剂分离法两相溶剂萃取法沉淀法吸附法盐析法透析法色谱法吸附色谱分配色谱离子交换色谱大孔树脂色谱凝胶色谱天然产物化学成分的分离方法·······极性物质吸附强非极性物质吸附弱极性物质吸附弱非极性物质吸附强分配色谱法

基本原理反相分配色谱正相分配色谱正相

色谱反相

色谱后出先出先出后出天然产物化学成分的精制与纯化方法结晶法蒸馏法吸附色谱分配色谱离子交换色谱大孔树脂色谱凝胶色谱亲和色谱色谱法和方法二

、四大谱在天然产物化学结构鉴定方面

的应用三、立体结构的测定方法四、一些天然产物结构的光谱特征2-3

天然产物化学成分的结构鉴定与测定一、天然产物化学成分结构鉴定的一般程序结沟测定的程字波谱、化学方法

推测出结构式分子量分子式的确定人工合成进行确认纯度鉴定推测母体结构类型功能基情况

方法1.检查有无均匀一致的晶型颜色2.有无敏锐的熔点3.PC或TLC在三种展开剂中

均呈单一斑点4.GC或HPLC

1.观察样品在提取过程中的行为2.测定其相关理化常数3.结合文献调研1.元素定量分析及分子量测定(同位素峰度比法及HR-MS),

确定分子式初步推断化合物类型测定分子式计算不饱和度程序纯度检验2.计算不饱和度1.官能团定性分析2.测定并解析化合物的有关谱学数据3.结合文献调研1.综合分析有关谱学数据及

官能团定性定量分析结果2.与已知化合物进行多方比较1.测定ORD

或

CD2.测定NOE

或2D-NMR3.进行X-

射线衍射分析4.进行人工合成确认确定分子中含有的官能团、结构片段

或基本结构骨架判断并确定分子的构造式推断并确定分子

的立体结构(构型、构象)一

、天然产物化学成分的结构鉴定与测定的一般程序和方法1.获得样品的背景信息2.根据样品来源和参考文献(原始文献和二手

文献)确定化合物类型3.测定样品的物理常数，查阅有关文献手册，

初步判断样品是已知物或未知物，若是已知

物，则按已知物的程序进行鉴定；若是未知

物则按未知物的程序进行结构测定.(一)已知化合物鉴定的一般程序和方法1.纯度检验2

.测样品的物理常数，与已知标准品的文献值对照，比较是否一致或接近。

3.测样品与标准品的混熔点。

4.将样品与标准品在三种溶剂系统中共色谱

(PC

或TLC),

比较其R,值是否一致。5.测样品的IR

光谱图，与标准品的图谱或与标

准谱图进行比较。·

外观、颜色、形态是否均一；·

测定各种物理常数，如熔点、沸点、比旋光度、折光率等，这些物理常数都能反映化合物的纯度。·

如果可能是已知物，用已知结构的对照品进行

对照测定或测定它们的共熔点等；·

也可对照文献报导值(注意各种测定条件的一致性)·

薄层层析(三种展开系统和三种显色方法)

GC、HPLC

等；检查纯度的方法：·

5

.测四谱并综合分析四谱数据，推导出化合物

的基本结构骨架信息。6.根据推出的结构，将所测得的四谱，特别是

NMR

谱的数据进行归属分析验证。7.人工合成进行确认·1.纯度检验，物理常数测定，与文献值比对·2.进行检识反应，确定样品类型。·

3.进行元素定性、定量分析，测得分子量，确定分子式。4.化学降解法确定分子结构式。(二)未知物结构测定的一般程疗与方法化学降解法●

化学降解法：将复杂分子通过氧化，还原等化学反

应，降解为几个结构比较简单又稳定的小分子化合

物，通过对降解产物的结构鉴定，再按降解机理合

理地推导出原来可能的化学结构式●

特

点：需用化合物量大；反应剧烈；主要产物得率少又费时；●

现在较少应用，仅保留一些比较简单规律性

又较强的降解反应●衍生物制备：用化学方法研究结构的一种常用手段，对结构推定有一定意义。二、四大谱在结构测定中的应用(

一

)紫外

—可见光谱(UV-VIS)原理：分子中电子跃迁引起的吸收，中π、π

-

π*的跃迁可因吸收紫外光及可见光所引起，

吸收光谱将出现紫外区和可见光区(200~700nm)。200nm

400nm700nm紫外区

(UV)

可见区(VIS)紫外吸收光谱可获得的结构信息：·

1、200~400nm无吸收峰，可能为饱和烃或无共轭双键的化合物。例如单烯烃。·

2

、270~350nm有弱吸收峰(=10~100)取代基团的位置、

种类、数目的推断。如加入诊断试剂推断黄酮的取代模式

型、数目、排列方式等)。

·(3)用于定量测定(以最大吸收波长作为检测波长进行含量测定)。(类·应

用

：

·

(

1)推断化合物的骨架类型—

共

轭

体系

。·

(2)

取代基团的位置、种类、数目的推断。

如加入诊断试剂推断黄酮的取代模式(类

型、数目、排列方式等)。(3)

用于定量测定(以最大吸收波长作为检

测波长进行含量测定)。·

特点

：·

样品用量少(只需5-10μg)·

样品能回收测定；·

常规紫外光谱仪价格低廉；4000

3600300015001000625cm-1特征频率区

指纹区特征官能团的鉴别

化合物真伪的鉴别(二)红外光谱

(B原理：分子中价键的伸缩及弯曲振动所引起的吸收而测得的吸收图谱，称为红外吸收光谱。芳环

1600、1580、1500cm-¹有2~3个峰双键

1620~1680

cm-¹应

用：IR

对未知结构化合物的鉴定，主要是用于官能团的确认、芳环取代类型的判断等定性分析。羟基(酚羟基、醇羟基)3600~3200

cm-¹游离羟基~3600

cm-¹氢键缔合羟基3400~3200

cm-1

羰基1600~1800

cm-1酮~1710

cm-¹酯1710~1735

cm-1两个化合物完全相同的条件1、

特征区完全吻合2、

指纹区也需完全一致特征官能团的鉴别

化合物真伪的鉴别(2)标准谱图查对法。如无对照品，也可检索有关IR

数据图谱文献，如被测物结构基本

已知，可能局部构型不同，在指纹区就会

有差别

。谱图三要素：位置、强度、峰形IR

用于鉴定化合物的方法有两种：(1)与标准物谱图对照法。在相同条件下若两个谱图完全吻合，则两物质相同：否则不

同

。红外光谱·

测定范围波数600～4000cm-1之

间

。其中1600cm⁻¹以上为化合物的特征基团区，1000-500cm-¹为指纹区。应用主要用于定性分析，功能基的确认，芳环取代类型的判断等。·优点：样品用量少(只需5-10

μg)任何气态、液态、固态样品均可测定；◆每种化合物都有红外吸收；常规红外光谱仪价格低廉；(三)。核磁共振谱(MQM·

NMR

谱：化合物分子在磁场中受电磁波的辐射，有磁距的原子核吸收一定的能量产生能级

的跃迁，即发生核磁共振，以吸收峰的频率对吸收强度作图所得之图谱。

N

MR

谱所提供的结构信息有：氢及碳原子的类型、数目、相互连接方式、周围的化学环境及构型、构象等。天然产物化学成分以有机物为主，分子结构中

必然有C、H

原子，它们的结合类型、化学环境不同，均可用NMR测定，是天然化合物结构测定的重

要手段。·○

氢核磁共振(

1H-NMR)谱

：·◆化学位移范围：在0～20ppm·◆三大要素：化学位移(ppm)、偶合

常

数

及

峰面积。·◆灵敏度高，样品用量少(1～5mg),测

试

时

间短

碳核磁共振(13C-NMR)谱

：·◆

化学位移范围：在0～250

ppm

。◆

要素：化学位移(ppm)·◆灵敏度较低，样品用量较多(5～20mg),测

试时间长1.H-NMR.

(核磁共振氢谱·

信息参数：化学位移(δ)、峰面积、峰裂分·

(s、d、t、q、m)

及偶合常数(J)·

(1)化学位移(ōppm):

0~20ppm·

与H

核所处的化学环境(1H

核周围的电子云密

度)有关，其外围电子云密度及绕核旋转产生的磁屏蔽效应不同，不同类型的¹H核共振信号出现

的区域不同，据此可以识别。●

电子云密度大，处于高场，δ值小·

电子云密度小，处于低场，δ值大~3.7-0CH₃-C=C-H11

10

9

8

7

6

5

4

3(δppm)推断化合物的结构(含¹H核基团的结构)常见结构的化学位移大致范围(要求熟记)~3.0-NCH₃(2)峰面积：磁等同质子的数目与峰面积(高度有关(3)峰裂分及偶和常数(J):

磁不等副的两个或两

组H核，在一定距离内因相互自旋偶合干扰使信号发生裂分，裂分峰间的距离称为偶合常数。裂分峰间的距离用偶合常数

(J)

表示。间隔的键数

越少，则其值越大，反之越小不同系统偶合常数(J

Hz)大小↓

峰裂分的数目符合n+1

规律(n=

磁等同质子的数目)s

单峰d

双峰t

三重峰q

四重峰m

多重峰芳环

J邻6~10HzJ间0~3HzJ对0~1Hz双键

J顺7~11HzJ反12~18Hz饱和烃类相邻碳原子上质子偶合常数的大小与两个氢原子之间的立体夹角θ有关0=60°

J=2~4

Hzθ=180°

J=9~10

Hz环己烷及其类似物相邻碳原子上质子的偶合常数Jaa10~13Hz(0=180°)Jae

2~5Hz(0=60°)Jee2~5Hz(0=60°)2.13C-NIMR(核

磁共振碳谱。13C-NMR

:

化学位移范围为0~250

pp

n·

信息参数：分子中各种不同类型及化学环境碳核的化学位移(ōc)、异核偶合常数(JCH)。其中利用度最高的是化学位移。由于碳谱的化学位移比氢谱大几十倍，因此分子

结构的微小差异所引起的化学位移的不同就能在碳谱

中反映出来如，果消除碳与氢的偶合，碳谱上每个碳原

子都对应有一条尖锐、可分辨的谱线。(1)化学位移：～大致范围(OC)不同13C

核

δC

大小与1³C

核所处的化学环境(周围

电子云密度)有关主要结构1³C

核

δC的大致范围(要求熟记)饱和碳原子(0~60)50(δC

ppm)200

150

100用于13C核类型的推断150~220(c=0)0200ppm50~80(c-0)(2)偶合常数。在碳谱中通常有三种偶合：13

C-13C

偶

合13C-1H偶合、13C-X偶合。13C-13C偶合几率很小，偶合裂分峰强度很低，一般观察不到。碳原子种类伯碳-CH₃仲碳-CH₂-叔碳季碳峰强度比1:3:3:11:2:11:1裂分峰数四重峰三重峰二重峰单峰碳谱中Jcn偶合裂分的规律如下(四)质谱(

MS·

1.确定分子量(高分辨质谱可将分子量精确

到小数点后三位),计算分子式。·

2.提供其他结构信息。如黄酮类，依碎片离子峰可以确定A-环

、B-

环的取代模式。·

3.与标准图谱比较用于化合物的鉴别(相同

条件下，其裂解是符合一定规律的)。·

4.

依裂解特征及碎片离子，推定或复核未知

化合物分子的部分结构。质谱主要离子源的电离方式及特点：电子轰击质谱

(EI-MS):

且前最常用但对于热敏成分(醇、糖苷、部分羧酸等)

及大分子物质(多糖、肽类)难以气化成分测不到分子离子峰

亦无法测得分子量解决措施电离新方法

将化合物乙酰化或三甲基样晶不必加热汽化而

硅烷化(TMS

化)制成热直接电离的新方法

稳定性好的挥发性衍生物

进行测定(2)场解吸质谱FD-MS(3)快原子轰击质谱FAB-MS(4)化学电离质谱CI-MS(5)电喷雾电离质谱

ESI-MS(6)基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)(7)场致电离质谱(FI-MS)(8)串联质谱(MS-MS)I◆适宜测定极性偏小和中等极性的化合物；◆常规质谱仪价格比较便宜，

一些特殊质谱

仪很昂贵；●

◆提供其他的结构信息片段；●特

点

：样品用量少(只需5～10

μg)·

应

用

：·

◆用于确定分子量；

。

◆求算分子式；三

、立体结构测定的方法(一)旋光光谱(Optical

rotatorydispeesion)(二)圆二色光谱

(Circular

Dichroism)(三

)

单

晶X-射线衍射谱

(X-Ray

diffraction

Method)的有

：·

(1)平坦谱线：分子中虽有不对称碳原子，

但在200~700nm

无紫外吸收时所得的图谱，无峰和谷之分。图谱在短波处升起者为正性谱线，降低者为负性谱线。·用不同波长的偏振光照射光学活性物质并用波长对比旋光度[a]×10-²或分子比旋[中]

×10-2作图，得到的曲线即为旋光光谱。常见(

一

)旋光光谱(0PD)·

(2)单纯Cotton效应谱线：光学活性分子

中若有发色团，则产生异常的旋光光谱，出

现峰和谷，得到所谓Cotton效

应谱线峰在

长波部分、谷在短波部分者为正性Cotton效

应谱线；反之则为负性Cotton效应谱线。·

(

3

)

复

合Cotton效应谱线：如ORD

谱线中

出现两个或更多峰与谷时，则称之为复合Cotton效应谱线。·

ORD

谱的谱线特征与分子的立体化学结构

(构型、构象)有着重要的关系。(二)圆二色光谱(CD)●

旋光性物质对组成平面偏振光的左圆偏振光和右圆

偏振光的摩尔吸光系数是不同的，这种现象称为圆二

色性。两种摩尔吸光系数之差随入射偏振光的波长变

化而变化，以△ε或有关量为纵坐标，波长为横坐标

得到的图谱称为圆二色谱。由于△ε的绝对值很小，常用摩尔椭圆度[θ]来代替，它与摩尔吸光系数的关

系

是

：[θ]=3300△ε。·

运

用CD

谱研究有机化合物的构型或构象，得出的结论与ORD

是

一致的。CD

比较明确，容易解

析

。(三)“单晶X

一射线们射法测定化合物晶体对X-射线的衍射谱，再通过计算机用数学的方法解析衍射谱，再还原为分子中个原子的排列关系，最后获得每个原子

在坐标系中的分布。从而给出化合物的化学结构。X-

射线衍射法不仅能测出化合物的一般结构，还能测定出化合物结构中的键长、键角、构象、

绝对构型等结构细节。四、一些天然产物结构的光增特征酚类化合物：UV吸收峰在280nm,IR吸收峰在1500~1600cm-

¹

、3300cm黄酮类化合物：UV

在240~285nm

及300~400nm

区间各有一个吸收峰，IR

在1500~1700cm-

¹处有吸收峰。皂苷类：H-NMR谱在高场有山峰形及几个甲基的尖峰信

号

。香豆素类：其

IR

在1500~1600cm-¹处有芳环吸收峰，1700cm-1附近有不饱和内酯吸收峰；UV

在240~260nm

区间有苯环吸收峰，320nm

处有

a.-吡喃酮环的吸收峰，H-NMR

谱主要是芳

环质子信号。生物碱：分子中含氮，可能是伯胺、仲胺或叔胺。伯胺、仲胺可根据IR

在3500cm附近的吸收峰或

¹H-NMR

谱相应质子信号为重水交换或变换

温度位移而确定；叔胺在IR或H-NMR无信号。萜类：

IH-NMR谱的大多数信号在高场。糖或糖苷：糖的质子信号大多集中在δ4~5,IR

吸收峰收峰在750~920cm-1本章学习方法概要·

对每一个具体的结构类型：要掌握下面的主线·

植物来源结构特点理化性质提取分离

纯化●

结构鉴定与测定

生物活性·

在理解的基础上，用自己的语言来消化和记忆，

善于归纳和总结，做到触类旁通，举一反三。思考题

：1.天然产物化学成分的提取分离方法有哪些?并说

明其应用范围.2.

天然产物化学成分的溶剂提取法有那些