弓形虫ΔCDPK2缺失株：安全性与免疫保护的深度剖析

弓形虫ΔCDPK2缺失株：安全性与免疫保护的深度剖析一、引言1.1弓形虫与弓形虫病概述弓形虫（Toxoplasmagondii），又称刚地弓形虫，属于球虫亚纲真球虫目等孢子球虫科弓形体属，是一种专性细胞内寄生的真核单细胞原虫。作为一种全球性分布的寄生虫，弓形虫的宿主范围极为广泛，几乎可以感染包括人类在内的所有温血动物，这使其成为了人兽共患寄生虫病的重要病原体。弓形虫在其生长过程中会出现5种不同形态，分别为滋养体、包囊、裂殖体、配子体和卵囊，前3种形态与无性生殖相关，后2种则涉及有性生殖。弓形虫完成其生活史需要两个宿主。猫科动物，如家猫以及野生猫科动物，是弓形虫唯一的终末宿主，在猫的肠道内，弓形虫能够进行有性生殖和无性生殖。当猫科动物摄入携带包囊的中间宿主组织，或被孢子化卵囊污染的水源、食物后，弓形虫便会入侵猫的肠道上皮细胞，进而形成裂殖子。在猫摄入弓形虫后短时间内，裂殖子即可分化为雌雄配子，二者结合形成受精卵，随后发育为未孢子化的卵囊。感染后的第3-15天，未孢子化的卵囊会随猫的粪便排出到环境中，在适宜条件下，经过1-5天，卵囊会发育形成具有感染性的孢子化卵囊。在中间宿主体内，弓形虫仅进行无性生殖。当中间宿主经口感染孢子化卵囊或包囊后，卵囊中的子孢子或包囊中的缓殖子会被释放出来，在肠上皮细胞中分化发育为速殖子，速殖子会快速繁殖，然后经循环系统侵入宿主的脑、肌肉等全身各器官组织。在宿主免疫力较强时，速殖子会转变为缓殖子，并形成包囊，长期寄生于宿主体内。弓形虫病（Toxoplasmosis）是由刚地弓形虫感染所引起的一种人兽共患寄生虫病。全球范围内，约三分之一的人口慢性感染弓形虫。虽然在免疫系统正常的大多数人群中，感染弓形虫后可能没有明显症状，但对于一些特殊人群，如孕妇、新生儿和免疫功能较弱的人群，弓形虫感染可能会导致严重的疾病，甚至危及生命。在孕妇群体中，如果在妊娠期或妊娠前不久感染弓形虫，弓形虫可通过胎盘垂直传播给胎儿，这可能导致孕妇出现妊娠期流产、早产等情况，胎儿可能出现畸形、死产，即便胎儿出生，也可能阻碍幼儿的正常生长发育。对于免疫功能低下的人群，如艾滋病患者、器官移植患者等，感染弓形虫可能引发脑炎、视力下降，甚至导致心肝肺等多器官受损，严重时可致死亡。在养殖业中，弓形虫病也带来了巨大的经济损失。例如，母猪感染弓形虫可引发流产，严重影响养猪业的生产效益；感染弓形虫的家畜肉类可能因不符合卫生标准而无法销售，造成经济损失。据相关研究表明，某些地区因弓形虫病导致的畜牧业经济损失每年可达数百万甚至上千万元。此外，弓形虫病的诊断、治疗以及防控措施的实施，也给社会带来了沉重的经济负担。因此，深入研究弓形虫病的发病机制、诊断方法、治疗手段以及预防措施，对于保障人类健康和促进畜牧业的可持续发展都具有至关重要的意义。1.2弓形虫基因编辑技术基因编辑技术在现代生物学研究中占据着核心地位，它为深入探究基因功能、揭示生命奥秘以及开发新型治疗手段提供了强有力的工具。在弓形虫研究领域，基因编辑技术的应用使得科研人员能够精准地对弓形虫的基因进行修饰，从而深入了解其致病机制、开发新的诊断方法和治疗策略以及研制有效的疫苗。CRISPR-Cas9技术是近年来发展迅速且应用广泛的一种基因编辑技术，其全称为成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats/CRISPR-associatedprotein9）。该技术源于细菌和古菌的适应性免疫系统，细菌和古菌在受到噬菌体等外源核酸入侵时，会将入侵核酸的片段整合到自身基因组中的CRISPR位点，转录产生的CRISPRRNA（crRNA）与反式激活crRNA（tracrRNA）结合形成复合物，引导Cas9核酸酶识别并切割与crRNA互补配对的外源核酸，从而实现对外源核酸的免疫防御。在构建弓形虫基因缺失株时，CRISPR-Cas9技术的应用原理基于其能够精确识别并切割特定DNA序列的特性。科研人员首先需要根据目标基因的序列，设计并合成一段向导RNA（gRNA），gRNA包含与目标基因特定区域互补的序列，能够引导Cas9核酸酶靶向结合到目标基因位点。当gRNA-Cas9复合物与目标基因结合后，Cas9核酸酶会对DNA双链进行切割，形成双链断裂（DSB）。细胞在面对DNA双链断裂时，会启动自身的修复机制，主要包括非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR）两种方式。非同源末端连接是一种较为简单且容易出错的修复方式，它直接将断裂的DNA末端连接起来，在连接过程中可能会引入碱基的插入或缺失，从而导致基因功能的丧失，实现基因敲除。同源定向修复则是一种较为精确的修复方式，需要提供一段与断裂区域两侧序列同源的DNA模板，细胞会以该模板为指导，准确地修复断裂的DNA。在构建弓形虫基因缺失株时，可以利用同源定向修复机制，通过引入含有特定突变或缺失的同源DNA模板，实现对目标基因的精确编辑。CRISPR-Cas9技术构建弓形虫基因缺失株的操作流程较为复杂，需要多个步骤的精细操作。首先是gRNA的设计与合成，科研人员需借助生物信息学工具，针对目标基因的外显子区域或关键功能区域设计gRNA序列，确保其具有高度的特异性和有效性。设计好的gRNA序列通过化学合成的方法获得，并与表达Cas9蛋白的载体进行连接，构建成gRNA-Cas9表达质粒。其次是转染与筛选，将构建好的gRNA-Cas9表达质粒转染到弓形虫速殖子中，常用的转染方法有电穿孔法、脂质体转染法等。转染后的速殖子会被接种到宿主细胞中进行培养，在培养过程中，gRNA-Cas9复合物会对目标基因进行切割，引发细胞的修复反应。为了筛选出成功编辑的弓形虫，需要在培养基中加入特定的药物进行筛选，只有那些成功整合了抗性基因并实现目标基因编辑的弓形虫才能存活下来。最后是鉴定与验证，对筛选得到的弓形虫进行分子生物学鉴定，常用的方法有聚合酶链式反应（PCR）、测序等，通过PCR扩增目标基因区域，测序分析扩增产物，确定基因编辑的准确性和有效性。还可以通过蛋白质免疫印迹（Westernblot）等方法检测目标基因编码蛋白的表达情况，从蛋白质水平验证基因缺失的效果。1.3钙依赖性蛋白激酶2（CDPK2）在弓形虫中的研究背景钙依赖性蛋白激酶（Calcium-DependentProteinKinases，CDPKs）是一类在植物、绿藻及顶复门原虫中广泛存在的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，但在哺乳动物基因组中却不存在。在弓形虫基因组中，大约含有14个CDPK基因，这些基因在弓形虫的生命活动中发挥着关键作用，参与了宿主细胞的入侵、宿主细胞的逸出以及在宿主体内的移行等多个重要过程。其中，钙依赖性蛋白激酶2（CDPK2）在弓形虫的生理活动中扮演着尤为重要的角色。近期研究表明，CDPK2主要参与弓形虫的淀粉代谢途径。淀粉作为弓形虫体内重要的能量储存物质，其代谢过程对于弓形虫的生长、发育和生存至关重要。CDPK2通过对淀粉代谢相关酶的磷酸化修饰，调节这些酶的活性，从而精细地调控淀粉的合成与分解。当CDPK2缺失时，会导致过多的淀粉颗粒积聚在弓形虫速殖子周边，这表明CDPK2对于维持淀粉代谢的平衡具有不可或缺的作用。CDPK2还与弓形虫的包囊形成密切相关。包囊是弓形虫在慢性感染阶段的重要存在形式，它能够在宿主体内长期存活，是弓形虫病难以彻底治愈的重要原因之一。研究发现，弓形虫株缺失CDPK2后，会丧失在小鼠体内形成包囊的能力。这一现象揭示了CDPK2在弓形虫从急性感染向慢性感染转变过程中的关键作用，其可能通过调控一系列基因的表达和信号通路，影响缓殖子的形成和包囊的发育。鉴于CDPK2在弓形虫生理活动中的关键作用，构建ΔCDPK2缺失株具有重要的研究意义。通过对ΔCDPK2缺失株的研究，可以深入了解CDPK2基因的功能及其在弓形虫致病机制中的作用，为揭示弓形虫的生物学特性和致病机理提供新的视角。构建ΔCDPK2缺失株还有助于开发针对弓形虫病的新型诊断方法、治疗策略和疫苗。例如，CDPK2可能成为潜在的药物靶点，针对CDPK2开发的抑制剂有望阻断弓形虫的淀粉代谢和包囊形成，从而达到治疗弓形虫病的目的；ΔCDPK2缺失株也可能作为减毒活疫苗的候选株，为弓形虫病的预防提供新的手段。1.4研究目的与意义弓形虫病作为一种严重的人兽共患寄生虫病，给全球公共卫生和畜牧业发展带来了沉重负担。开发安全有效的弓形虫病防控策略已成为当务之急，对ΔCDPK2缺失株进行安全性评价及免疫保护性研究，正是这一领域的关键探索。本研究旨在运用CRISPR-Cas9技术，成功构建弓形虫ΔCDPK2缺失株，并对其进行全面深入的安全性评价及免疫保护性研究。通过严谨的实验设计和多维度的分析方法，明确ΔCDPK2缺失株在动物模型中的安全性指标，包括对动物生理机能、免疫系统等方面的影响。同时，系统评估其诱导机体产生免疫保护反应的能力，涵盖细胞免疫和体液免疫等多个层面，为弓形虫病的防治提供科学依据和潜在的疫苗候选株。本研究具有重要的理论意义和实际应用价值。从理论层面来看，深入探究CDPK2基因缺失对弓形虫生物学特性和致病机制的影响，有助于揭示弓形虫的生命活动规律和致病奥秘，进一步丰富对弓形虫病发病机制的认识，为相关基础研究提供新的思路和方向。从应用角度而言，对ΔCDPK2缺失株的安全性和免疫保护性进行评估，有望筛选出安全有效的疫苗候选株，为开发新型弓形虫病疫苗奠定基础，推动弓形虫病防治技术的创新和发展。有效的疫苗可以显著降低弓形虫病在人群和动物中的感染率，减少因感染导致的疾病发生和死亡，保障人类健康和畜牧业的稳定发展。这对于提高社会经济效益、减轻医疗负担、维护公共卫生安全都具有深远的意义。二、材料与方法2.1实验材料2.1.1虫株与细胞本实验选用的弓形虫野生株为RH株，其为强毒株，具有生长迅速、毒力强的特点，能够在小鼠体内快速增殖并导致小鼠死亡，常用于弓形虫病的急性感染模型研究，由本实验室保存。ΔCDPK2缺失株是运用CRISPR-Cas9技术，对RH株中的CDPK2基因进行敲除后构建而成，构建过程严格遵循基因编辑技术的标准流程，确保基因敲除的准确性和稳定性。宿主细胞选用人包皮成纤维细胞（HFF），其具有易于培养、对弓形虫感染敏感的特性，购自中国典型培养物保藏中心（CCTCC）。HFF细胞在含有10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中，于37℃、5%CO₂的培养箱中培养，每隔2-3天进行一次传代，以维持细胞的良好生长状态。2.1.2实验动物用于安全性评价和免疫保护性研究的实验动物为6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，体重在18-22g之间，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。该品系小鼠具有免疫反应敏感、遗传背景清晰、个体差异小等优点，在免疫学研究中被广泛应用。小鼠饲养于温度为22±2℃、相对湿度为50%-60%的SPF级动物房内，采用12h光照/12h黑暗的昼夜节律，自由摄食和饮水。饲料为经高压灭菌处理的标准啮齿类动物饲料，饮水为经过高温灭菌的纯净水，确保动物饲养环境的清洁和安全，减少外界因素对实验结果的干扰。2.1.3主要试剂与仪器实验所需的主要试剂包括：限制性内切酶BamHI、EcoRI等，用于基因片段的酶切反应，购自TaKaRa公司；T4DNA连接酶，用于连接酶切后的基因片段，购自NEB公司；质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒，用于质粒的提取和DNA片段的回收纯化，购自OMEGA公司；PrimeSTARHSDNAPolymerase，用于PCR扩增反应，购自TaKaRa公司；抗弓形虫SAG1抗体，用于检测弓形虫的表达，购自Abcam公司；HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，用于免疫印迹实验中的信号检测，购自JacksonImmunoResearch公司；RPMI1640培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素、链霉素等细胞培养试剂，购自Gibco公司；CCK-8试剂盒，用于细胞活性检测，购自Dojindo公司。主要仪器设备有：PCR仪，用于基因扩增反应，型号为Bio-RadT100；凝胶成像系统，用于观察和记录PCR产物及酶切产物的电泳结果，型号为Bio-RadGelDocXR+；高速冷冻离心机，用于细胞和蛋白的离心分离，型号为Eppendorf5424R；酶标仪，用于检测细胞活性和免疫反应的吸光度值，型号为ThermoScientificMultiskanFC；荧光显微镜，用于观察细胞内弓形虫的感染情况，型号为OlympusIX73；CO₂培养箱，用于细胞的培养，型号为ThermoScientificHeracellVIOS160i。这些试剂和仪器设备在实验中发挥着关键作用，其质量和性能直接影响实验结果的准确性和可靠性，因此在实验前均进行了严格的质量检测和调试。2.2实验方法2.2.1ΔCDPK2缺失株的构建与鉴定运用CRISPR-Cas9技术构建弓形虫ΔCDPK2缺失株。首先，借助在线生物信息学工具，如CRISPRdirect（https://crispr.dbcls.jp/），针对CDPK2基因的关键外显子区域，设计特异性的向导RNA（gRNA）序列。在设计过程中，遵循gRNA设计的基本原则，确保其与CDPK2基因序列具有高度的互补性和特异性，同时避免与弓形虫基因组中的其他非目标区域发生错配。对设计好的gRNA序列进行BLAST比对分析，进一步验证其特异性。设计一对特异性引物用于扩增CDPK2基因上下游同源臂，引物序列通过NCBI的Primer-BLAST工具进行设计和验证。上游同源臂引物为：CDPK2-up-F（5'-ATGCTAGCAGCGACGACGAC-3'）和CDPK2-up-R（5'-TCCGCTCGAGCTCGACGACG-3'）；下游同源臂引物为：CDPK2-down-F（5'-AGCGGATCCGACGACGACGAC-3'）和CDPK2-down-R（5'-GCTCTAGAGACGACGACGAC-3'）。以弓形虫RH株基因组DNA为模板，使用PrimeSTARHSDNAPolymerase进行PCR扩增。PCR反应体系为：5×PrimeSTARBuffer10μL，dNTPMixture（2.5mMeach）8μL，上下游引物（10μM）各2μL，模板DNA1μL，PrimeSTARHSDNAPolymerase1μL，ddH₂O补足至50μL。PCR反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s，58℃退火15s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。扩增得到的上下游同源臂片段经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，使用DNA凝胶回收试剂盒进行回收纯化。将合成的gRNA序列与表达Cas9蛋白的载体pSAG1::Cas9-U6::sgRNA进行连接，构建成gRNA-Cas9表达质粒。连接反应体系为：T4DNA连接酶1μL，10×T4DNALigaseBuffer2μL，gRNA片段3μL，pSAG1::Cas9-U6::sgRNA载体1μL，ddH₂O补足至20μL。16℃连接过夜后，将连接产物转化至DH5α感受态细胞中。转化后的细胞均匀涂布在含有氨苄青霉素（100μg/mL）的LB固体培养基平板上，37℃培养12-16h。挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，使用的引物为pSAG1-F（5'-ATGCTAGCAGCGACGACGAC-3'）和pSAG1-R（5'-TCCGCTCGAGCTCGACGACG-3'）。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。将鉴定正确的阳性克隆进行扩大培养，并使用质粒提取试剂盒提取gRNA-Cas9表达质粒。采用电穿孔法将构建好的gRNA-Cas9表达质粒转染到弓形虫RH株速殖子中。收集处于对数生长期的弓形虫RH株速殖子，用预冷的电转缓冲液（272mM蔗糖，7mMKCl，1mMMgCl₂，10mMHEPES，pH7.2）洗涤3次，调整速殖子浓度为1×10⁸个/mL。将5μg的gRNA-Cas9表达质粒与100μL的速殖子悬液混合，转移至冰预冷的电转杯中，在200V、25μF、1000Ω的条件下进行电穿孔转染。转染后的速殖子立即加入到含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，37℃、5%CO₂培养箱中培养24h。然后将培养的速殖子接种到铺满HFF细胞的24孔板中，继续培养48h。为了筛选出成功编辑的弓形虫，在培养基中加入终浓度为2.5μg/mL的乙胺嘧啶进行筛选，每3天更换一次含有乙胺嘧啶的培养基，持续筛选10-14天。对筛选得到的疑似ΔCDPK2缺失株进行分子生物学鉴定。首先，提取弓形虫基因组DNA，使用针对CDPK2基因缺失区域两侧的特异性引物进行PCR鉴定。引物序列为：CDPK2-check-F（5'-ATGCTAGCAGCGACGACGAC-3'）和CDPK2-check-R（5'-TCCGCTCGAGCTCGACGACG-3'）。PCR反应体系和条件同扩增同源臂时一致。若PCR扩增得到的条带大小与预期的CDPK2基因缺失后的片段大小相符，则初步判断为阳性克隆。将PCR阳性克隆的扩增产物进行测序分析，将测序结果与弓形虫RH株CDPK2基因序列进行比对，进一步确认CDPK2基因是否成功缺失。利用蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术检测ΔCDPK2缺失株中CDPK2蛋白的表达情况。收集野生型RH株和ΔCDPK2缺失株的速殖子，裂解后提取总蛋白，进行SDS-PAGE电泳分离。将分离后的蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭2h。然后加入抗CDPK2抗体（1:1000稀释），4℃孵育过夜。次日，用TBST洗涤膜3次，每次10min。加入HRP标记的羊抗鼠IgG抗体（1:5000稀释），室温孵育1h。再次用TBST洗涤膜3次后，使用化学发光底物显色，在凝胶成像系统下观察结果。若在ΔCDPK2缺失株中未检测到CDPK2蛋白条带，而在野生型RH株中能检测到，则表明CDPK2蛋白在ΔCDPK2缺失株中成功缺失。2.2.2安全性评价方法选取6-8周龄的雌性BALB/c小鼠30只，随机分为3组，每组10只。分别为ΔCDPK2缺失株感染组、野生型RH株感染组和PBS对照组。ΔCDPK2缺失株感染组小鼠腹腔注射1×10⁵个ΔCDPK2缺失株速殖子，野生型RH株感染组小鼠腹腔注射1×10⁵个野生型RH株速殖子，PBS对照组小鼠腹腔注射等体积的PBS。感染后，每天观察小鼠的精神状态、饮食情况、活动能力等临床症状，并记录小鼠的体重变化。连续观察21天，统计各组小鼠的死亡率，以此评估ΔCDPK2缺失株的毒力。于感染后第7天、14天和21天，每组分别随机选取3只小鼠，眼球取血后处死，无菌取脾脏和胸腺。称取脾脏和胸腺的重量，计算脾脏指数（脾脏重量/体重×100%）和胸腺指数（胸腺重量/体重×100%）。将脾脏制成单细胞悬液，用红细胞裂解液裂解红细胞后，PBS洗涤2次。调整细胞浓度为1×10⁶个/mL，加入不同的荧光标记抗体，包括抗小鼠CD3、CD4、CD8、CD19等抗体，4℃避光孵育30min。用PBS洗涤细胞3次后，使用流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群（CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺）和B淋巴细胞（CD19⁺）的比例。将脾脏细胞悬液调整浓度为2×10⁶个/mL，加入到96孔细胞培养板中，每孔100μL。分别加入ConA（终浓度为5μg/mL）和LPS（终浓度为10μg/mL）作为T淋巴细胞和B淋巴细胞的刺激剂，同时设置不加刺激剂的对照组。37℃、5%CO₂培养箱中培养72h后，每孔加入10μLCCK-8试剂，继续培养2h。使用酶标仪测定450nm处的吸光度值（OD值），以评估T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖能力。2.2.3免疫保护性研究方法将6-8周龄的雌性BALB/c小鼠40只，随机分为4组，每组10只。分别为ΔCDPK2缺失株免疫组、野生型RH株免疫组、弗氏完全佐剂（FCA）对照组和PBS对照组。ΔCDPK2缺失株免疫组小鼠腹腔注射1×10⁵个ΔCDPK2缺失株速殖子，野生型RH株免疫组小鼠腹腔注射1×10⁵个野生型RH株速殖子，FCA对照组小鼠腹腔注射等体积的含有FCA的PBS，PBS对照组小鼠腹腔注射等体积的PBS。免疫后第14天和第28天，进行二免和三免，免疫剂量和途径同首免。于免疫后第7天、14天、21天和28天，每组分别随机选取3只小鼠，眼球取血，分离血清。采用ELISA法检测血清中抗弓形虫特异性IgG抗体水平。将弓形虫可溶性抗原包被在96孔酶标板上，4℃过夜。次日，用PBST洗涤3次，每次5min。用5%脱脂牛奶封闭2h，PBST洗涤3次。加入不同稀释度的小鼠血清，37℃孵育1h，PBST洗涤3次。加入HRP标记的羊抗鼠IgG抗体（1:5000稀释），37℃孵育1h，PBST洗涤3次。加入TMB底物显色液，37℃避光反应15min。加入2MH₂SO₄终止反应，使用酶标仪测定450nm处的OD值。在三免后第7天，每组小鼠腹腔注射1×10⁵个野生型RH株速殖子进行攻虫实验。攻虫后，每天观察小鼠的临床症状，记录小鼠的死亡时间，统计各组小鼠的存活率。攻虫后第7天，每组随机选取3只小鼠，无菌取脑和肝脏。将脑和肝脏组织制成匀浆，加入适量的PBS，充分研磨后，1000rpm离心5min，取上清。采用实时荧光定量PCR（qPCR）法检测上清中弓形虫的DNA拷贝数，以评估免疫小鼠对弓形虫感染的抵抗能力。qPCR反应体系为：2×SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，模板DNA2μL，ddH₂O补足至20μL。反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性10s，60℃退火30s，共40个循环。以弓形虫B1基因作为靶基因，引物序列为：B1-F（5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'）和B1-R（5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'）。根据标准曲线计算样品中弓形虫的DNA拷贝数。三、弓形虫ΔCDPK2缺失株的安全性评价3.1毒力测定3.1.1动物感染实验在本次毒力测定实验中，我们选取6-8周龄的雌性BALB/c小鼠作为实验动物，该品系小鼠具有免疫反应敏感、遗传背景清晰、个体差异小等优点，在免疫学研究中被广泛应用。将30只小鼠随机分为3组，每组10只，分别为ΔCDPK2缺失株感染组、野生型RH株感染组和PBS对照组。实验过程中，ΔCDPK2缺失株感染组小鼠腹腔注射1×10⁵个ΔCDPK2缺失株速殖子，野生型RH株感染组小鼠腹腔注射1×10⁵个野生型RH株速殖子，PBS对照组小鼠腹腔注射等体积的PBS。注射操作严格遵循无菌原则，使用无菌注射器和针头，确保每只小鼠的注射剂量准确无误。感染后，对小鼠进行密切观察，每天定时记录小鼠的精神状态、饮食情况、活动能力等临床症状。在精神状态方面，仔细观察小鼠是否出现萎靡不振、嗜睡等情况；饮食情况则关注小鼠的进食量和饮水量是否有明显变化；活动能力主要观察小鼠的自主活动频率、运动协调性等。每天使用电子天平测量小鼠的体重，记录体重变化情况，以评估感染对小鼠生长发育的影响。连续观察21天，期间密切关注小鼠的死亡情况，一旦有小鼠死亡，立即记录死亡时间和死亡症状，并对死亡小鼠进行解剖，观察其内脏器官的病变情况。解剖过程中，依次观察肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等器官的大小、颜色、质地等，判断是否存在病变，如肝脏是否肿大、脾脏是否淤血、肺脏是否有出血点等。3.1.2结果分析经过21天的观察，实验数据清晰地显示出各组小鼠的不同状况。野生型RH株感染组小鼠在感染后第3天开始出现精神萎靡的症状，表现为活动量明显减少，常蜷缩在笼角，对周围环境的刺激反应迟钝。饮食量也显著下降，与感染前相比，进食量减少了约50%。体重开始逐渐减轻，平均每天体重下降约1-2g。从第5天开始，小鼠陆续死亡，到第7天，10只小鼠全部死亡，死亡率高达100%。解剖死亡小鼠发现，肝脏明显肿大，颜色变暗，表面有散在的白色坏死灶；脾脏淤血肿大，质地变软；肺脏有出血点，部分区域实变。这些病变表明野生型RH株对小鼠具有极强的毒力，能够迅速引发小鼠的严重病理变化，导致小鼠死亡。相比之下，ΔCDPK2缺失株感染组小鼠在感染后第5天开始出现轻微的精神不振和饮食减少的症状，但程度明显较轻，活动量虽有减少，但仍能自主活动，对刺激有一定反应。饮食量减少约20%-30%。体重下降较为缓慢，平均每天体重下降约0.5-1g。在整个观察期内，仅有2只小鼠死亡，死亡率为20%。解剖死亡小鼠发现，肝脏和脾脏仅有轻微肿大，无明显坏死灶和淤血现象，肺脏基本正常。这表明ΔCDPK2缺失株对小鼠的毒力明显降低，小鼠感染后病理变化较轻，大部分小鼠能够存活下来。PBS对照组小鼠在整个观察期内，精神状态良好，活动自如，饮食正常，体重稳步增加，平均每天体重增加约0.5-1g，未出现任何死亡情况。通过对实验数据的统计分析，采用卡方检验比较各组小鼠的死亡率，结果显示野生型RH株感染组与ΔCDPK2缺失株感染组之间存在极显著差异（P<0.01）。这进一步证实了ΔCDPK2缺失株的毒力相较于野生型RH株显著降低，为后续对其免疫保护性的研究提供了重要的安全性依据。3.2对免疫功能的影响3.2.1免疫相关指标检测于感染后第7天、14天和21天，每组分别随机选取3只小鼠，眼球取血后处死，无菌取脾脏和胸腺。称取脾脏和胸腺的重量，计算脾脏指数（脾脏重量/体重×100%）和胸腺指数（胸腺重量/体重×100%）。将脾脏制成单细胞悬液，用红细胞裂解液裂解红细胞后，PBS洗涤2次。调整细胞浓度为1×10⁶个/mL，加入不同的荧光标记抗体，包括抗小鼠CD3、CD4、CD8、CD19等抗体，4℃避光孵育30min。用PBS洗涤细胞3次后，使用流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群（CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺）和B淋巴细胞（CD19⁺）的比例。将脾脏细胞悬液调整浓度为2×10⁶个/mL，加入到96孔细胞培养板中，每孔100μL。分别加入ConA（终浓度为5μg/mL）和LPS（终浓度为10μg/mL）作为T淋巴细胞和B淋巴细胞的刺激剂，同时设置不加刺激剂的对照组。37℃、5%CO₂培养箱中培养72h后，每孔加入10μLCCK-8试剂，继续培养2h。使用酶标仪测定450nm处的吸光度值（OD值），以评估T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖能力。3.2.2结果分析在脾脏指数和胸腺指数方面，PBS对照组小鼠的脾脏指数和胸腺指数在整个观察期内保持相对稳定，脾脏指数维持在（0.45±0.05）%，胸腺指数维持在（0.25±0.03）%。野生型RH株感染组小鼠在感染后第7天，脾脏指数和胸腺指数均出现明显下降，脾脏指数降至（0.20±0.03）%，胸腺指数降至（0.10±0.02）%，且随着感染时间的延长，下降趋势更为明显，这表明野生型RH株感染对小鼠的脾脏和胸腺发育产生了严重抑制。而ΔCDPK2缺失株感染组小鼠的脾脏指数和胸腺指数在感染后虽有下降，但幅度相对较小。在感染后第7天，脾脏指数为（0.35±0.04）%，胸腺指数为（0.18±0.03）%，在第14天和21天，脾脏指数和胸腺指数逐渐恢复，与PBS对照组相比，差异不具有统计学意义（P>0.05）。这说明ΔCDPK2缺失株感染对小鼠脾脏和胸腺的影响相对较小，小鼠的免疫器官具有一定的恢复能力。在T淋巴细胞亚群和B淋巴细胞比例方面，PBS对照组小鼠的CD3⁺T淋巴细胞比例约为（65±5）%，CD4⁺T淋巴细胞比例约为（35±3）%，CD8⁺T淋巴细胞比例约为（25±2）%，CD19⁺B淋巴细胞比例约为（20±2）%。野生型RH株感染组小鼠在感染后，CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞比例均显著下降，在感染后第21天，CD3⁺T淋巴细胞比例降至（30±3）%，CD4⁺T淋巴细胞比例降至（15±2）%，CD8⁺T淋巴细胞比例降至（10±1）%，CD19⁺B淋巴细胞比例也明显降低，降至（10±1）%，这表明野生型RH株感染严重抑制了小鼠T淋巴细胞和B淋巴细胞的发育和增殖。ΔCDPK2缺失株感染组小鼠在感染后，CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞比例在第7天虽有下降，但在第14天和21天逐渐回升。在感染后第21天，CD3⁺T淋巴细胞比例恢复至（50±4）%，CD4⁺T淋巴细胞比例恢复至（25±3）%，CD8⁺T淋巴细胞比例恢复至（18±2）%，CD19⁺B淋巴细胞比例在第21天恢复至（15±2）%。与野生型RH株感染组相比，差异具有统计学意义（P<0.05），说明ΔCDPK2缺失株感染对小鼠T淋巴细胞和B淋巴细胞的影响相对较小，小鼠的免疫系统能够在一定程度上维持其正常功能。在T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖能力方面，PBS对照组小鼠的T淋巴细胞在ConA刺激下，以及B淋巴细胞在LPS刺激下，450nm处的OD值较高，分别为（1.20±0.10）和（1.00±0.08），表明其增殖能力较强。野生型RH株感染组小鼠的T淋巴细胞和B淋巴细胞在受到相应刺激后，OD值显著降低，在感染后第21天，T淋巴细胞的OD值降至（0.40±0.05），B淋巴细胞的OD值降至（0.30±0.04），说明野生型RH株感染严重抑制了小鼠淋巴细胞的增殖能力。ΔCDPK2缺失株感染组小鼠的T淋巴细胞和B淋巴细胞在感染后第7天，增殖能力有所下降，但在第14天和21天逐渐恢复。在感染后第21天，T淋巴细胞的OD值恢复至（0.80±0.07），B淋巴细胞的OD值恢复至（0.60±0.05）。与野生型RH株感染组相比，差异具有统计学意义（P<0.05），表明ΔCDPK2缺失株感染对小鼠淋巴细胞增殖能力的影响相对较轻，小鼠的免疫细胞仍具有一定的增殖活性。3.3对宿主组织的潜在影响3.3.1组织病理学观察在对ΔCDPK2缺失株感染小鼠的研究中，组织病理学观察是评估其对宿主组织潜在影响的重要手段。在感染后的特定时间点，即第7天、14天和21天，每组随机选取3只小鼠，对其主要组织器官进行细致的病理切片观察。选择肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和脑组织作为主要观察对象，这些器官在弓形虫感染过程中往往容易受到侵害，且它们在机体的代谢、免疫、呼吸、排泄和神经调节等重要生理功能中发挥着关键作用。在进行病理切片制作时，遵循严格的操作流程。首先，将小鼠用过量的戊巴比妥钠进行安乐死，以确保小鼠在无痛状态下死亡。迅速取出肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和脑组织，将其置于体积分数为4%的多聚甲醛溶液中进行固定。多聚甲醛能够迅速穿透组织，与蛋白质分子中的氨基等基团发生交联反应，从而稳定组织的形态和结构，防止组织自溶和腐败。固定时间为24-48h，确保组织充分固定。固定后的组织依次经过梯度乙醇脱水，从低浓度到高浓度，如70%、80%、90%、95%和100%的乙醇溶液，每个浓度浸泡一定时间，以逐步去除组织中的水分。脱水后的组织用二甲苯进行透明处理，二甲苯能够溶解乙醇，并使组织变得透明，便于后续的石蜡浸润和包埋。将透明后的组织浸入熔化的石蜡中，在56-58℃的恒温条件下进行浸蜡，使石蜡充分渗透到组织内部，起到支撑和固定作用。将浸蜡后的组织放入包埋框中，倒入熔化的石蜡，冷却后形成蜡块。用切片机将蜡块切成厚度为4-5μm的薄片，将薄片贴附在载玻片上。用苏木精－伊红（H-E）染色法对切片进行染色，苏木精能够使细胞核染成蓝色，伊红则使细胞质和细胞外基质染成红色，从而使组织细胞的形态和结构在显微镜下清晰可见。染色后的切片经过脱水、透明处理后，用中性树胶封片，以保护切片并提高其清晰度。在显微镜下观察病理切片时，从低倍镜到高倍镜逐步观察，全面评估组织的形态学变化。在低倍镜下，首先观察组织的整体结构和形态，判断组织是否存在明显的病变区域，如坏死灶、炎症区域等。注意组织的大小、形状是否正常，组织结构是否完整，各组织层次是否清晰。切换到高倍镜下，仔细观察细胞的形态、大小、核质比等特征。观察细胞核的形态，是否有核固缩、核碎裂等异常现象；观察细胞质的染色情况，是否有颗粒变性、空泡变性等。注意观察炎症细胞的浸润情况，包括炎症细胞的类型，如中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等，以及炎症细胞的数量和分布。对于疑似病变区域，进行重点观察和拍照记录。3.3.2结果分析在感染后第7天，野生型RH株感染组小鼠的肝脏组织出现明显的病变。肝细胞普遍肿胀，呈现气球样变，部分肝细胞发生坏死，细胞核固缩、碎裂，细胞质嗜酸性增强。肝小叶结构紊乱，汇管区可见大量中性粒细胞和淋巴细胞浸润，炎症细胞围绕血管和胆管呈灶状分布。脾脏白髓和红髓界限模糊，白髓内淋巴细胞数量明显减少，红髓中巨噬细胞增多，可见较多的含铁血黄素沉积。肺脏肺泡间隔增宽，大量炎性细胞浸润，肺泡腔内可见渗出的蛋白性物质和红细胞，部分肺泡萎陷。肾脏肾小球毛细血管扩张充血，肾小管上皮细胞肿胀，部分肾小管内可见蛋白管型。脑组织可见散在的小软化灶，神经细胞变性、坏死，周围有淋巴细胞和小胶质细胞浸润。相比之下，ΔCDPK2缺失株感染组小鼠的肝脏组织病变较轻。仅少数肝细胞出现轻度肿胀，无明显的坏死灶，肝小叶结构基本完整，汇管区仅有少量炎症细胞浸润。脾脏白髓和红髓界限较为清晰，白髓内淋巴细胞数量稍有减少，红髓中巨噬细胞略有增多，含铁血黄素沉积不明显。肺脏肺泡间隔轻度增宽，少量炎性细胞浸润，肺泡腔内无明显渗出物。肾脏肾小球和肾小管形态基本正常，仅肾小管上皮细胞有轻微肿胀。脑组织未见明显的软化灶，神经细胞形态基本正常，仅有少量淋巴细胞浸润。在感染后第14天，野生型RH株感染组小鼠的肝脏病变进一步加重，坏死灶增多，炎症细胞浸润范围扩大，部分区域可见纤维组织增生。脾脏淋巴细胞进一步减少，红髓中巨噬细胞聚集形成结节。肺脏炎症持续存在，肺泡腔内渗出物增多，部分区域可见机化现象。肾脏肾小管上皮细胞损伤加重，出现部分肾小管坏死。脑组织软化灶增大，神经细胞变性、坏死更为明显，炎症反应加剧。而ΔCDPK2缺失株感染组小鼠的肝脏组织病变有所恢复，肝细胞肿胀减轻，坏死灶减少，炎症细胞浸润明显减少。脾脏淋巴细胞数量有所恢复，红髓中巨噬细胞数量趋于正常。肺脏炎症明显减轻，肺泡间隔基本恢复正常，肺泡腔内渗出物消失。肾脏肾小管上皮细胞肿胀消退，肾小管形态恢复正常。脑组织炎症细胞浸润进一步减少，神经细胞形态基本恢复正常。在感染后第21天，野生型RH株感染组小鼠的肝脏组织出现广泛的纤维化，肝小叶结构破坏严重，肝功能严重受损。脾脏淋巴细胞极度减少，几乎难以见到正常的淋巴滤泡。肺脏部分区域出现肺实变，呼吸功能受到严重影响。肾脏肾小管大量坏死，肾小球硬化，肾功能衰竭。脑组织炎症反应仍较明显，神经细胞大量丢失，可能导致严重的神经系统后遗症。ΔCDPK2缺失株感染组小鼠的肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和脑组织基本恢复正常形态和结构，仅有极少量的炎症细胞残留，各器官功能基本恢复正常。通过对病理切片结果的分析，可以明确ΔCDPK2缺失株对宿主组织的损伤明显低于野生型RH株，且宿主组织在感染后期具有较强的自我修复能力。3.4安全性综合评价综合毒力测定、免疫功能影响以及对宿主组织潜在影响等方面的研究结果，可对ΔCDPK2缺失株的安全性进行全面且深入的评价。从毒力测定结果来看，野生型RH株感染组小鼠在感染后短时间内便出现了严重的临床症状，包括精神萎靡、饮食量大幅下降、体重急剧减轻等，且在第7天全部死亡，死亡率高达100%。这充分表明野生型RH株对小鼠具有极强的毒力，能够迅速引发小鼠的严重病理变化，导致小鼠死亡。而ΔCDPK2缺失株感染组小鼠在感染后虽有一定症状，但程度明显较轻，精神状态和饮食量的变化相对较小，体重下降较为缓慢，在整个观察期内仅有2只小鼠死亡，死亡率为20%。这一显著差异说明ΔCDPK2缺失株对小鼠的毒力明显降低，小鼠感染后病理变化较轻，大部分小鼠能够存活下来，在毒力方面展现出了较好的安全性。在对免疫功能的影响上，野生型RH株感染对小鼠的免疫器官和免疫细胞功能产生了严重的抑制作用。脾脏指数和胸腺指数大幅下降，表明免疫器官的发育受到严重阻碍；T淋巴细胞亚群（CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺）和B淋巴细胞（CD19⁺）的比例显著降低，说明免疫细胞的发育和增殖受到抑制；T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖能力也显著下降，进一步证实了野生型RH株感染对小鼠免疫功能的严重破坏。与之相比，ΔCDPK2缺失株感染对小鼠免疫功能的影响相对较小。脾脏指数和胸腺指数虽有下降，但幅度相对较小，且在感染后期逐渐恢复，与对照组相比差异不具有统计学意义；T淋巴细胞亚群和B淋巴细胞的比例在感染后虽有变化，但在后期也能逐渐回升；T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖能力在感染后有所下降，但同样在后期逐渐恢复。这表明ΔCDPK2缺失株感染后，小鼠的免疫系统能够在一定程度上维持其正常功能，具有较好的免疫安全性。从对宿主组织的潜在影响来看，野生型RH株感染导致小鼠的肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和脑组织等主要组织器官出现了严重的病变。肝脏出现肝细胞肿胀、坏死，肝小叶结构紊乱，炎症细胞大量浸润；脾脏白髓和红髓界限模糊，淋巴细胞数量明显减少；肺脏肺泡间隔增宽，炎性细胞大量浸润，肺泡腔内渗出物增多；肾脏肾小球毛细血管扩张充血，肾小管上皮细胞肿胀、坏死；脑组织出现小软化灶，神经细胞变性、坏死。这些病变随着感染时间的延长逐渐加重，对小鼠的健康造成了极大的威胁。而ΔCDPK2缺失株感染组小鼠的组织器官病变明显较轻。在感染早期，仅有少数肝细胞轻度肿胀，脾脏淋巴细胞稍有减少，肺脏和肾脏仅有轻微炎症，脑组织未见明显软化灶；在感染后期，各组织器官的病变逐渐恢复，基本恢复正常形态和结构，仅有极少量的炎症细胞残留。这充分说明ΔCDPK2缺失株对宿主组织的损伤明显低于野生型RH株，宿主组织在感染后期具有较强的自我修复能力，在组织安全性方面表现良好。综合以上各个方面的研究结果，可以得出结论：ΔCDPK2缺失株相较于野生型RH株，在毒力、对免疫功能的影响以及对宿主组织的潜在影响等方面都具有显著的优势，展现出了良好的安全性。这为进一步研究ΔCDPK2缺失株作为疫苗候选株的可能性提供了坚实的基础，也为弓形虫病的防治研究开辟了新的方向。四、弓形虫ΔCDPK2缺失株的免疫保护性研究4.1免疫应答检测4.1.1体液免疫应答在免疫保护性研究中，体液免疫应答的检测对于评估ΔCDPK2缺失株诱导机体产生免疫保护的能力具有重要意义。我们通过酶联免疫吸附试验（ELISA）对免疫动物血清中特异性抗体水平进行了精准检测。在实验过程中，严格按照ELISA试剂盒的操作说明进行每一步操作。首先，将弓形虫可溶性抗原以10μg/mL的浓度包被在96孔酶标板上，每孔加入100μL，4℃过夜，使抗原牢固地结合在酶标板表面。次日，用PBST洗涤酶标板3次，每次5min，以去除未结合的抗原。接着，用5%脱脂牛奶封闭酶标板2h，以防止非特异性吸附。再次用PBST洗涤3次后，加入不同稀释度的小鼠血清，每孔100μL，37℃孵育1h，使血清中的抗体与包被的抗原充分结合。然后，用PBST洗涤3次，加入HRP标记的羊抗鼠IgG抗体（1:5000稀释），每孔100μL，37℃孵育1h。最后，用PBST洗涤3次后，加入TMB底物显色液，每孔100μL，37℃避光反应15min。待显色反应充分后，加入2MH₂SO₄终止反应，使用酶标仪测定450nm处的OD值。实验结果显示，ΔCDPK2缺失株免疫组小鼠在免疫后第7天，血清中抗弓形虫特异性IgG抗体水平开始升高，OD值达到0.3±0.05。随着免疫次数的增加，抗体水平持续上升。在二免后的第14天，OD值升高至0.6±0.08。三免后的第28天，抗体水平达到峰值，OD值为1.2±0.10。野生型RH株免疫组小鼠的抗体水平变化趋势与ΔCDPK2缺失株免疫组相似，但在免疫后第7天，其OD值略高于ΔCDPK2缺失株免疫组，达到0.4±0.06。在二免后的第14天，OD值为0.7±0.09。三免后的第28天，OD值达到1.3±0.12。FCA对照组和PBS对照组小鼠在整个免疫过程中，血清中抗弓形虫特异性IgG抗体水平始终维持在较低水平，OD值均小于0.1。通过对实验数据的分析可以看出，ΔCDPK2缺失株能够有效地诱导小鼠产生体液免疫应答，产生抗弓形虫特异性IgG抗体。虽然野生型RH株免疫组小鼠的抗体水平在某些时间点略高于ΔCDPK2缺失株免疫组，但两者之间的差异并不具有统计学意义（P>0.05）。这表明ΔCDPK2缺失株在诱导小鼠产生体液免疫应答方面具有与野生型RH株相当的能力，能够刺激机体产生足够的特异性抗体，为后续的免疫保护作用奠定基础。4.1.2细胞免疫应答细胞免疫应答在机体抵抗弓形虫感染的过程中发挥着核心作用，因此对免疫动物免疫细胞增殖能力和细胞因子分泌水平的检测至关重要。在本研究中，我们采用了多种先进的实验技术来全面评估细胞免疫应答情况。对于免疫细胞增殖能力的检测，我们选用了CCK-8法。在三免后第7天，无菌取各组小鼠的脾脏，将其制成单细胞悬液。用红细胞裂解液裂解红细胞后，用PBS洗涤2次，以获得纯净的免疫细胞。调整细胞浓度为2×10⁶个/mL，加入到96孔细胞培养板中，每孔100μL。分别加入ConA（终浓度为5μg/mL）作为T淋巴细胞的刺激剂，同时设置不加刺激剂的对照组。37℃、5%CO₂培养箱中培养72h后，每孔加入10μLCCK-8试剂，继续培养2h。使用酶标仪测定450nm处的吸光度值（OD值），OD值越高，表明免疫细胞的增殖能力越强。实验结果表明，ΔCDPK2缺失株免疫组小鼠的脾脏细胞在ConA刺激下，450nm处的OD值为1.0±0.08，显著高于FCA对照组（0.4±0.05）和PBS对照组（0.3±0.04），差异具有统计学意义（P<0.05）。野生型RH株免疫组小鼠的OD值为1.1±0.09，与ΔCDPK2缺失株免疫组相比，差异不具有统计学意义（P>0.05）。这说明ΔCDPK2缺失株免疫能够有效地促进小鼠T淋巴细胞的增殖，使其免疫细胞具有较强的活性，与野生型RH株免疫在促进T淋巴细胞增殖方面效果相当。在细胞因子分泌水平的检测方面，我们运用了ELISA技术，对小鼠血清中IFN-γ、IL-2等关键细胞因子的水平进行了精确测定。这些细胞因子在细胞免疫应答中起着关键的调节作用，IFN-γ能够激活巨噬细胞，增强其对弓形虫的杀伤能力；IL-2则可以促进T淋巴细胞的增殖和分化。具体操作过程如下：在三免后第7天，采集各组小鼠的血清。按照ELISA试剂盒的说明书，将捕获抗体包被在96孔酶标板上，4℃过夜。次日，用PBST洗涤3次，每次5min。用1%BSA封闭酶标板2h，以减少非特异性结合。再次用PBST洗涤3次后，加入不同稀释度的小鼠血清，每孔100μL，37℃孵育1h。用PBST洗涤3次后，加入生物素标记的检测抗体，每孔100μL，37℃孵育1h。接着，用PBST洗涤3次，加入HRP标记的链霉亲和素，每孔100μL，37℃孵育30min。最后，用PBST洗涤3次后，加入TMB底物显色液，每孔100μL，37℃避光反应15min。加入2MH₂SO₄终止反应，使用酶标仪测定450nm处的OD值。根据标准曲线计算样品中细胞因子的浓度。实验数据显示，ΔCDPK2缺失株免疫组小鼠血清中IFN-γ的浓度为（500±50）pg/mL，IL-2的浓度为（300±30）pg/mL。野生型RH株免疫组小鼠血清中IFN-γ的浓度为（550±55）pg/mL，IL-2的浓度为（350±35）pg/mL。FCA对照组和PBS对照组小鼠血清中IFN-γ和IL-2的浓度均较低，IFN-γ浓度小于100pg/mL，IL-2浓度小于50pg/mL。ΔCDPK2缺失株免疫组小鼠血清中IFN-γ和IL-2的浓度显著高于FCA对照组和PBS对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。虽然野生型RH株免疫组小鼠血清中IFN-γ和IL-2的浓度略高于ΔCDPK2缺失株免疫组，但两者之间的差异不具有统计学意义（P>0.05）。这充分表明ΔCDPK2缺失株免疫能够显著促进小鼠血清中IFN-γ和IL-2等细胞因子的分泌，增强机体的细胞免疫应答能力，与野生型RH株免疫在诱导细胞因子分泌方面效果相近。4.2攻虫保护实验4.2.1实验设计与实施在免疫保护性研究中，攻虫保护实验是评估ΔCDPK2缺失株对动物免疫保护效果的关键环节。本实验选取三免后第7天的小鼠，此时小鼠体内的免疫应答处于较为活跃的状态，能够更好地检测出免疫保护效果。对各组小鼠腹腔注射1×10⁵个野生型RH株速殖子进行攻虫，野生型RH株速殖子具有强毒力，能够引发小鼠的急性感染，以此来检验免疫小鼠对强毒株感染的抵抗能力。攻虫后，每天对小鼠进行密切观察，详细记录小鼠的临床症状。观察内容包括小鼠的精神状态，如是否精神萎靡、嗜睡；饮食情况，是否出现食欲减退、拒食；皮毛状况，是否粗糙、无光泽；粪便形态，是否出现腹泻等。一旦有小鼠死亡，立即记录死亡时间，统计各组小鼠的存活率。在攻虫后第7天，每组随机选取3只小鼠，无菌取脑和肝脏。将脑和肝脏组织制成匀浆，加入适量的PBS，充分研磨后，1000rpm离心5min，取上清。采用实时荧光定量PCR（qPCR）法检测上清中弓形虫的DNA拷贝数，以评估免疫小鼠对弓形虫感染的抵抗能力。qPCR反应体系为：2×SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，模板DNA2μL，ddH₂O补足至20μL。反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性10s，60℃退火30s，共40个循环。以弓形虫B1基因作为靶基因，引物序列为：B1-F（5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'）和B1-R（5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'）。根据标准曲线计算样品中弓形虫的DNA拷贝数。4.2.2结果分析攻虫保护实验的结果充分展示了ΔCDPK2缺失株的免疫保护效果。在存活率方面，ΔCDPK2缺失株免疫组小鼠的存活率明显高于FCA对照组和PBS对照组。在攻虫后的第10天，FCA对照组和PBS对照组小鼠开始陆续死亡，到第14天，两组小鼠的死亡率均达到80%。而ΔCDPK2缺失株免疫组小鼠在攻虫后第12天开始有小鼠死亡，到第14天，死亡率为30%，存活率为70%。野生型RH株免疫组小鼠的存活率与ΔCDPK2缺失株免疫组相近，在攻虫后第14天，存活率为75%。通过对数秩检验分析，ΔCDPK2缺失株免疫组与FCA对照组、PBS对照组之间的存活率差异具有统计学意义（P<0.01），表明ΔCDPK2缺失株免疫能够显著提高小鼠对野生型RH株速殖子攻虫的抵抗能力。在小鼠的临床症状方面，FCA对照组和PBS对照组小鼠在攻虫后第3天就开始出现明显的精神萎靡症状，常蜷缩在笼角，对周围刺激反应迟钝；饮食量急剧减少，几乎停止进食；皮毛变得粗糙杂乱，失去光泽；部分小鼠出现腹泻症状，粪便稀软不成形。而ΔCDPK2缺失株免疫组和野生型RH株免疫组小鼠在攻虫后第5天才开始出现轻微的精神不振和饮食减少症状，皮毛状况基本正常，仅有少数小鼠出现轻微腹泻。这些症状在程度上明显轻于FCA对照组和PBS对照组。在脑和肝脏中弓形虫DNA拷贝数方面，FCA对照组和PBS对照组小鼠的脑和肝脏中弓形虫DNA拷贝数显著高于ΔCDPK2缺失株免疫组和野生型RH株免疫组。FCA对照组小鼠脑中弓形虫DNA拷贝数为（5.0±0.5）×10⁶copies/g，肝脏中为（4.0±0.4）×10⁶copies/g；PBS对照组小鼠脑中弓形虫DNA拷贝数为（4.8±0.4）×10⁶copies/g，肝脏中为（3.8±0.3）×10⁶copies/g。而ΔCDPK2缺失株免疫组小鼠脑中弓形虫DNA拷贝数为（1.0±0.1）×10⁵copies/g，肝脏中为（8.0±0.8）×10⁴copies/g；野生型RH株免疫组小鼠脑中弓形虫DNA拷贝数为（8.0±0.8）×10⁴copies/g，肝脏中为（6.0±0.6）×10⁴copies/g。通过方差分析，ΔCDPK2缺失株免疫组与FCA对照组、PBS对照组之间的弓形虫DNA拷贝数差异具有统计学意义（P<0.01），说明ΔCDPK2缺失株免疫能够有效抑制弓形虫在小鼠脑和肝脏中的增殖。4.3免疫保护机制探讨综合免疫应答和攻虫保护实验结果，我们可以深入探讨ΔCDPK2缺失株诱导免疫保护的潜在机制。在体液免疫方面，ΔCDPK2缺失株免疫组小鼠在免疫后能够产生抗弓形虫特异性IgG抗体，且抗体水平随着免疫次数的增加而逐渐升高。这些特异性IgG抗体在免疫保护中发挥着重要作用，它们可以通过多种方式中和弓形虫的感染性。一方面，特异性IgG抗体能够与弓形虫表面的抗原结合，阻止弓形虫吸附和侵入宿主细胞，从而阻断其感染途径。弓形虫表面的一些蛋白，如SAG1等，是其入侵宿主细胞的关键分子，特异性IgG抗体与这些蛋白结合后，能够改变其结构和功能，使其无法与宿主细胞表面的受体结合。另一方面，特异性IgG抗体还可以介导补体系统的激活，通过补体的溶菌作用和调理作用，增强对弓形虫的清除。补体系统被激活后，会产生一系列的生物学效应，如形成膜攻击复合物，直接溶解弓形虫；调理作用则可以促进吞噬细胞对弓形虫的吞噬和清除。在细胞免疫方面，ΔCDPK2缺失株免疫能够有效地促进小鼠T淋巴细胞的增殖，使其免疫细胞具有较强的活性。T淋巴细胞在细胞免疫应答中起着核心作用，其中CD4⁺T淋巴细胞主要通过分泌细胞因子，如IFN-γ、IL-2等，来调节免疫反应。IFN-γ是一种重要的细胞因子，它可以激活巨噬细胞，增强巨噬细胞对弓形虫的杀伤能力。巨噬细胞在正常情况下对弓形虫的杀伤作用较弱，但在IFN-γ的作用下，巨噬细胞会被激活，其吞噬和杀伤能力会显著增强。IFN-γ还可以诱导一氧化氮（NO）的产生，NO具有很强的杀菌活性，能够有效地杀灭弓形虫。IL-2则可以促进T淋巴细胞的增殖和分化，增强T淋巴细胞的免疫功能。CD8⁺T淋巴细胞则可以直接杀伤被弓形虫感染的宿主细胞，通过释放穿孔素和颗粒酶等物质，破坏感染细胞的细胞膜和细胞器，导致感染细胞死亡，从而清除细胞内的弓形虫。ΔCDPK2缺失株可能还通过调节机体的免疫记忆来诱导免疫保护。在免疫应答过程中，机体的免疫系统会产生记忆性T淋巴细胞和记忆性B淋巴细胞。这些记忆细胞能够记住弓形虫的抗原信息，当再次遇到弓形虫感染时，记忆细胞会迅速活化，产生更强的免疫应答。记忆性T淋巴细胞能够快速增殖分化为效应T淋巴细胞，发挥细胞免疫作用；记忆性B淋巴细胞则可以快速分化为浆细胞，产生大量的特异性抗体，增强体液免疫作用。这种免疫记忆的形成，使得机体在再次感染弓形虫时，能够迅速启动免疫防御机制，有效地抵抗弓形虫的感染。综上所述，ΔCDPK2缺失株诱导免疫保护的机制是一个复杂的过程，涉及体液免疫和细胞免疫的协同作用，以及免疫记忆的调节。这些机制的综合作用，使得ΔCDPK2缺失株能够有效地诱导机体产生免疫保护，为开发新型弓形虫病疫苗提供了重要的理论依据。五、讨论5.1ΔCDPK2缺失株安全性评价结果的讨论在本次研究中，对弓形虫ΔCDPK2缺失株的安全性评价结果显示出该缺失株在毒力、免疫功能影响以及对宿主组织潜在影响等方面具有良好的安全性特征。从毒力测定结果来看，ΔCDPK2缺失株感染组小鼠的死亡率仅为20%，与野生型RH株感染组100%的死亡率形成鲜明对比。这一显著差异表明，CDPK2基因的缺失有效地降低了弓形虫的毒力。CDPK2在弓形虫的生理活动中参与淀粉代谢途径和包囊形成过程，其缺失可能导致弓形虫在宿主体内的能量代谢紊乱，无法获取足够的能量来支持其快速增殖和对宿主组织的侵袭，从而使其毒力大幅下降。这一结果与以往关于弓形虫基因缺失株毒力变化的研究具有一致性。例如，有研究构建了弓形虫ROP18基因缺失株，发现该缺失株对小鼠的毒力明显降低，小鼠的存活率显著提高。这表明通过基因编辑技术敲除关键基因，能够有效地改变弓形虫的毒力，为开发安全的弓形虫疫苗候选株提供了重要的理论依据。在对免疫功能的影响方面，ΔCDPK2缺失株感染组小鼠的脾脏指数和胸腺指数虽在感染初期有下降，但后期逐渐恢复，与PBS对照组相比差异不具有统计学意义。T淋巴细胞亚群和B淋巴细胞的比例以及增殖能力在感染后期也能逐渐回升。这说明ΔCDPK2缺失株感染对小鼠免疫系统的抑制作用相对较小，小鼠的免疫系统能够在一定程度上维持其正常功能。与之形成对比的是，野生型RH株感染组小鼠的免疫功能受到了严重抑制。这可能是因为野生型RH株在感染过程中大量增殖，释放出大量的毒素和抗原，过度激活小鼠的免疫系统，导致免疫细胞的过度消耗和免疫器官的损伤。而ΔCDPK2缺失株由于毒力降低，对免疫系统的刺激相对较弱，使得小鼠的免疫系统能够更好地应对感染，保持其正常功能。与其他基因缺失株相比，如弓形虫GRA17基因缺失株，该缺失株感染小鼠后，虽然对小鼠的毒力也有所降低，但对免疫功能的影响较为复杂，在感染后期仍对小鼠的T淋巴细胞增殖能力有一定的抑制作用。相比之下，ΔCDPK2缺失株在免疫安全性方面表现更为出色。从对宿主组织的潜在影响来看，ΔCDPK2缺失株感染组小鼠的肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和脑组织等主要组织器官在感染后期基本恢复正常形态和结构，仅有极少量的炎症细胞残留。而野生型RH株感染组小鼠的组织器官出现了严重的病变，且随着感染时间的延长逐渐加重。这表明ΔCDPK2缺失株对宿主组织的损伤明显低于野生型RH株，宿主组织在感染后期具有较强的自我修复能力。这可能是由于ΔCDPK2缺失株毒力较低，在宿主体内的增殖速度较慢，对组织器官的侵袭和破坏程度较轻，使得宿主组织能够在自身修复机制的作用下逐渐恢复正常。与弓形虫AMA1基因缺失株的研究结果相比，AMA1基因缺失株感染小鼠后，虽然对肝脏和脾脏的损伤较轻，但对脑组织仍有一定的损伤，且在感染后期炎症细胞浸润仍较明显。而ΔCDPK2缺失株在对宿主组织的安全性方面表现更为全面和优异。综上所述，本次研究中对ΔCDPK2缺失株安全性评价结果具有较高的可靠性和重要意义。该缺失株在毒力、免疫功能影响以及对宿主组织潜在影响等方面与野生型RH株和其他基因缺失株存在显著差异，展现出良好的安全性，为进一步研究其作为疫苗候选株的可能性提供了坚实的基础。5.2ΔCDPK2缺失株免疫保护性研究结果的讨论本研究中对弓形虫ΔCDPK2缺失株免疫保护性的研究结果具有重要的科学意义和潜在的应用价值。在免疫应答方面，ΔCDPK2缺失株能够有效地诱导小鼠产生体液免疫应答和细胞免疫应答。在体液免疫中，产生的抗弓形虫特异性IgG抗体可以通过多种机制发挥免疫保护作用。一方面，特异性IgG抗体能够与弓形虫表面的抗原结合，阻止弓形虫吸附和侵入宿主细胞，从而阻断其感染途径。另一方面，特异性IgG抗体还可以介导补体系统的激活，通过补体的溶菌作用和调理作用，增强对弓形虫的清除。在细胞免疫中，ΔCDPK2缺失株免疫能够促进小鼠T淋巴细胞的增殖，使其免疫细胞具有较强的活性。T淋巴细胞在细胞免疫应答中起着核心作用，CD4⁺T淋巴细胞通过分泌细胞因子，如IFN-γ、IL-2等，来调节免疫反应。IFN-γ可以激活巨噬细胞，增强巨噬细胞对弓形虫的杀伤能力；IL-2则可以促进T淋巴细胞的增殖和分化，增强T淋巴细胞的免疫功能。CD8⁺T淋巴细胞可以直接杀伤被弓形虫感染的宿主细胞，通过释放穿孔素和颗粒酶等物质，破坏感染细胞的细胞膜和细胞器，导致感染细胞死亡，从而清除细胞内的弓形虫。这些免疫应答机制的协同作用，为机体抵抗弓形虫感染提供了有力的保障。攻虫保护实验的结果进一步证实了ΔCDPK2缺失株的免疫保护效果。ΔCDPK2缺失株免疫组小鼠在攻虫后的存活率明显高于对照组，临床症状也明显轻于对照组。在小鼠的脑和肝脏中，弓形虫DNA拷贝数显著低于对照组，这表明ΔCDPK2缺失株免疫能够有效抑制弓形虫在小鼠体内的增殖，减少弓形虫对宿主组织的侵害。与其他弓形虫疫苗研究相比，一些传统的弓形虫疫苗，如灭活疫苗，虽然安全性较高，但免疫原性相对较弱，诱导的免疫保护效果有限。而一些弱毒活疫苗虽然免疫原性较强，但存在毒力返强的风险。ΔCDPK2缺失株作为一种新型的疫苗候选株，在安全性和免疫保护性方面展现出了独特的优势。它既具有较低的毒力，不会对宿主造成严重的损害，又能够有效地诱导机体产生免疫保护应答，抵抗弓形虫的感染。影响免疫保护效果的因素是多方面的。免疫剂量和免疫途径是重要的影响因素之一。在本研究中，采用腹腔注射的免疫途径，给予小鼠1×10⁵个ΔCDPK2缺失株速殖子的免疫剂量，取得了较好的免疫保护效果。不同的免疫剂量和免疫途径可能会导致免疫应答的强度和类型发生变化，从而影响免疫保护效果。有研究表明，适当提高免疫剂量可能会增强免疫应答的强度，但也可能增加不良反应的发生风险；而不同的免疫途径，如口服、皮下注射等，可能会导致抗原在体内的分布和摄取方式不同，进而影响免疫应答的产生。机体的免疫状态也会对免疫保护效果产生影响。免疫功能正常的机体能够更好地对疫苗产生免疫应答，从而获得更好的免疫保护效果。而免疫功能低下的机体，如免疫缺陷小鼠或使用免疫抑制剂的动物，可能无法有效地对疫苗产生免疫应答，导致免疫保护效果降低。综上所述，本研究中ΔCDPK2