耐受重金属的海洋微生物的筛选及相应性质研究

第第页共26页耐受重金属的海洋微生物的筛选及相应性质研究ScreeningofMarinemicroorganismtoleranttoheavymetalsandstudyofcorrespondingcharacteristics摘要:近几年来，伴随着农业，尤其是工业的快速发展，导致我国重金属污染愈加严重，不仅严重损害我国的经济，而且会危及动植物正常生长和人类健康，解决此类问题迫在眉睫。常见的处理重金属污染的方法有物理修复法和化学修复法。近几年来，生物修复技术，尤其是微生物修复技术越来越受到大家的关注。本文首先从海泥中分离培养微生物，然后从所分离培养的微生物中筛选耐受重金属能力较高的菌株。经过系列筛选，其中9号菌株耐受重金属能力最强，随后对9号菌株提取总DNA进行16SrDNA的PCR扩增，并根据序列测定结果进行菌株鉴定。根据16SrDNA的序列测定结果，通过序列比对及聚类分析表明，9号菌株与蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）具有很高同源性，并将其命名为BacilluscereusWSM-9。同时，本实验还对此菌株对不同重金属的耐受性进行了相关测定。关键词：Bacilluscereus耐受重金属生物修复技术PCR扩增序列测定Abstract:Inrecentyears,alongwithagriculture,especiallytherapidindustrialdevelopment,leadstoheavymetalpollutionincreasinglyseriousinourcountry,notonlyseriouslydamageourcountry'seconomy,andthreatenanimalandplantnormalgrowthandhumanhealth,andsolvesuchproblemsisimminent.Thecommonmethodsofdealingwithheavymetalpollutionincludephysicalandchemicalrepairmethods.Inrecentyears,bioremediationtechnology,especiallymicrobialrepairtechnology,hasattractedmoreandmoreattention.Inthispaper,microorganismswereisolatedfromseamud,andthestrainswithhighresistancetoheavymetalswerescreenedfromthemicroorganismsisolatedandcultured.Afteraseriesofscreening,no.9strainwasthemostresistanttoheavymetals,andthenthetotalDNAwasextractedbythe9straintocarryoutthePCRamplificationof16SrDNA,andthebacterialstrainwasidentifiedaccordingtothesequencingresults.Accordingtothesequencingresultsof16SrDNA,thesequencealignmentandclusteranalysisshowedthatthestrain9wasveryhomologouswithBacilluscereus,andwasnamedBacilluscereusWSM-9.Atthesametime,thetoleranceofdifferentheavymetalsinthisstrainwasdetermined.

Keywords:BacilluscereusheavymentalbioremediationPCRamplificationSequencedetermination目录任务书 1学术声明 4摘要 56872第一章引言 8107121.1微生物的吸附作用 87391.2微生物对重金属离子的转化作用 8TOC\o"1-3"\h\u6872第二章材料与方法 10107122.1实验材料 10107122.1.1实验仪器与设备 102.7391.2实验试剂及药品 102.35341.3实验菌株 112.292741.4主要溶液和培养基及其配制 1178042.2实验方法与步骤 1240252.2.1实验流程 1246762.2.2海洋微生物的分离培养与筛选 1287762.2.2.1海洋微生物的分离培养 1271682.2.2.2海洋微生物的筛选 13146462.2.316SRNA序列测定进行菌种鉴定 13237722.2.3.1菌落PCR扩增 13182472.2.3.21%琼脂糖凝胶电泳 14160632.2.4不同重金属条件对菌株的影响 1426004第三章结果与讨论 17118823.1结果与分析 17122493.1.1海洋微生物的分离培养 1771393.1.2对重金属耐受性较强的菌株的筛选 17148983.1.39号菌株的鉴定 18239823.1.4不同重金属条件对9号菌株的生长条件的影响 19181633.2讨论 2225379参考文献 2419718致谢 26第一章引言自20世纪以来工业技术迅猛发展，人类越来越大范围的利用重金属，招致环境中的各种污染物也就越来越多。其中重金属是环境污染的重要污染物之一，因为它具有滞留时间很长、毒性较大、不容易分解等特点，所以一旦出现环境中的重金属的浓度超标，就会引起极大的不适，影响周边的动植物正常生长，而且一旦环境遭到破坏极难缓解严肃的情况。 海洋生物资源不仅可以如传统般作为人类食物的重要来源，而且可以提供重要的医药原料和工业原料。所以面对如此丰富的大自然资源，应该合理妥善的利用，以期为人类发展拓展方向。 近几年来，伴随着工农业的开展，我国重金属污染情况愈加严重重金属污染不仅严重污染环境，还可对人类身体健康造成巨大的危害。微生物修复技术，已成为当今世界乃至全球的研讨热点。微生物可以通过吸收、沉淀、共价转化等多种方式，降低重金属毒性[1]。1.1微生物的吸附作用：王瑞兴等发现钙离子和镉离子能通过微生物的共沉淀作用析出[2]，从而降低了重金属的浓度。刘建英等发现有机阴离子能使螺旋蓝细菌把重金属进行富集，乙酸根有解吸附作用而柠檬酸根却有促进吸附的作用[3]。此外，微生物对重金属的吸附固定作用可能会受到环境的pH、温度、吸附剂种类、吸附剂使用等多种因素的影响。微生物的吸附作用是指微生物本身经过多种办法吸附废水中的重金属离子，最终通过固液分离去除废水中的重金属离子。微生物复杂的结构以及和不同金属间亲和力的差异决定了微生物吸附重金属原理的复杂性。2.微生物对重金属离子的转化作用：通过微生物的金属转化作用，如大多数的氧化还原或烷基取代作用等，能够将重金属从一种化合价转化为另一种化合价或者一种形态变成另一种形态。除了通过氧化金属离子外，微生物还可以还原一些重金属，例如不溶性的Pu还原成可溶性的Pu。此外，微生物还能产生影响重金属活性的物质，比如微生物可以产生简单有机物、腐殖酸和富里酸或其它物质，都能络合环境中的重金属离子，实现重金属离子形态间的转化。Chanmugathas和Bollag报道，土壤微生物新陈代谢比较活跃,增加了对镉的转化[4]。Kurek和Bollag比较了碳源条件发生改变后，微生物并不促进铅、镉、锌、铜等重金属的溶解，但假如同时加入葡萄糖作为碳源，一段时间后，不灭菌处理的淋洗液中重金属离子浓度比灭菌处理的更高[5]。原核微生物主要通过减少重金属的排放来减少重金属离子的摄取，增加重金属的排放控制胞内金属离子的浓度[6]。细菌通过改变重金属的形态而改变毒性。真核微生物减少活性游离态重金属离子，主要原因是其体内的金属硫蛋白可以鳌合重金属离子。根据微生物耐受重金属污染能力，一般认为：真菌>细菌>放线菌[7]。用一些物理、化学的方法处理（如用酸、碱浸泡或加热等方法）微生物，可以改变微生物的吸附能力。Murugesan等将一种从茶树上分离得到的真菌(Teafungus)用化学方法处理后，发现对砷的生物吸附大大增加，几乎完全去除，较对照组高出40%[8]。李清彪等的研究也发现，用0.2mol/L的NaOH溶液处理白腐真菌(Phanerochaetechrysosporium)的菌丝球后，发现它对一定浓度的铅溶液的吸附率达到了95%以上，明显大于未经碱处理的白腐真菌的吸附量(66.64%)[9]。深海微生物生活在较为极端的生态环境中，在长期的自然选择情况下，从而形成了极为特殊的生理生化结构和环境适应机制就这样形成了[10]，同时也可能会产生许多具有特殊性质的生物活性物质[11]。由于深海微生物培养条件具有比较特殊、培养的比较困难等多种特点[12]，并且在这种影响下国内外关于深海微生物的探究还处于比较初级阶段[13]。近几年表明，海洋生物种类繁多，部分微生物的耐受重金属的能力较强。本文从海泥中分离培养对重金属耐受性较高的微生物，并对筛选出的对所筛选的耐受性较强的菌株进行16SrDNA的PCR扩增，根据序列测定结果进行菌种鉴定，并测定其对不同重金属的耐受性，以期为重金属污染的生物修复提供素材和相应理论依据。材料与方法2.1实验材料2.1.1实验仪器及设备UPY-111-103型纯水机四川优普超纯科技有限公司HC-100恒温混匀仪 杭州佑宁仪器有限公司SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台苏州净化设备有限公司生物安全柜上海力申科学仪器有限公司超低温冰箱上海力申科学仪器有限公司恒温恒湿培养箱上海力申科学仪器有限公司恒温振荡器上海力申科学仪器有限公司ZHWY-1102C型双层恒温摇床上海智城分析仪器制造有限公司XP基因扩增仪杭州博日科技有限公司多功能水平电泳槽（DNA）美国Bio-Rad公司凝胶成像系统美国Bio-Rad公司微波炉合肥荣事达三洋电器股份有限公司电热鼓风干燥箱上海一恒科学仪器有限公司高压灭菌器上海申安医疗器械厂台式高速离心机上海力申科学仪器有限公司小型台式离心机上海力申科学仪器有限公司酶标仪杭州博日科技有限公司电子天平奥豪斯仪器（上海）有限公司722N可见分光光度计上海佑科仪器有限公司Cary50UV-VIS紫外分光光度计美国Varian公司2.1.2实验试剂及药品氯化钠分析纯蛋白胨生物试剂酵母膏生物试剂氯化锌 分析纯硫酸铜分析纯硝酸铅分析纯氯化铬分析纯氯化镉分析纯TaqDNA聚合酶康为世纪生产Agarose生物试剂Trans2KDNAMarker生物试剂溴化乙锭核酸染料索莱宝生产Tris索莱宝生产2.1.3实验菌株本实验所用菌株均分离于海泥样品中，分离培养后由实验室保存2.1.4主要溶液和培养基及其配制①2216E液体培养基：蛋白胨Tryptone(1%)5g，酵母膏YeastExtract(0.5%)1g，500mL海水溶解，定容至1000mL，115℃高压灭菌30min。②2216E固体培养基：蛋白胨Tryptone(1%)5g，酵母膏YeastExtract(0.5%)1g，琼脂粉15g，500mL海水溶解，定容至1000mL，115℃高压灭菌30min。③CdCl2溶液(0.5mol/L):取1.14gCdCl2溶解在ddH2O中，然后定容至10mL。用5mL注射器进行0.22μm滤膜过滤，分装于1.5mLEP管(1mL/管）中，4℃保存，等待下一步实验所需。④CuSO4溶液(0.1mol/L):取0.16gCuSO4溶解在ddH2O中，然后定容至10mL。同种方式滤菌分装，4℃保存，等待下一步实验所需。⑤CrCl3溶液(0.1mol/L):取0.1583gCrCl3溶解在ddH2O中，然后定容至10mL。同种方式滤菌分装，4℃保存，等待下一步实验所需。⑥Pb(NO3)2溶液(0.1mol/L):取0.3312gPb(NO3)2溶解在ddH2O中，然后定容至10mL。同种方式滤菌分装，4℃保存，等待下一步实验所需。⑦ZnCl2溶液(0.1mol/L):取0.1615gZnCl2溶解在ddH2O中，然后定容至10mL。同种方式滤菌分装，4℃保存，等待下一步实验所需。⑧PCR扩增20ul扩增体系：模板1ul引物10.5ul引物20.5ul2XTaqmix10ulddH2O8ul⑨琼脂糖凝胶：琼脂粉0.2g1×TAE20mL微波炉中加热反复加热，至琼脂粉溶解并无气泡核酸染料＜1ul冷却至不烫手时加入核酸染料，混匀，轻轻倒入胶板内，大约20min后，轻轻拔掉梳子。2.2实验方法与步骤2.2.1实验流程海泥采集样品→海洋微生物的分离与培养→菌种筛选并优化培养→提取DNA进行16SrDNA的PCR扩增→16SrDNA序列测定→菌种鉴定→不同重金属耐受性的测定2.2.2海洋微生物的分离培养与筛选2.2.2.1海洋微生物的分离培养①配制2216E固体培养基200ml，高温灭菌后，在超净工作台中待其温度降至不烫手时，分别倒入平板中，降温凝固后，无菌密封保存②中国科学院海洋研究所现保存的深海海泥，取出定量放置锥形瓶中，加入些许无菌水，用玻璃棒多次搅拌摇晃③静置，分层后，用微量移液枪取上层10ul，用灭菌后的三角玻璃棒均匀涂抹到2216E固体培养基平板上，封口后，在28℃恒温培养箱中倒置培养48h④培养过后，培养基中出现多种不同菌落，再次用接种环将不同形态的菌种转接到另一个2216E固体培养基平板上，同样是在28℃恒温培养箱中倒置培养48h⑤经过多次转接后，菌种得到有效分离并培养，最终将获得的菌种标号保存。2.2.2.2海洋微生物的筛选不同浓度CdCl2溶液对多种菌种的影响分别取150ul、300ul、450ul、600ul、1200ulCdCl2溶液(0.5mol/L)分别配成100mL含量为0.5mmol、1.0mmol、1.5mmol、2.0mmol、4.0mmol重金属的2216E固体培养基，混匀，灭菌后待其温度冷却至50℃左右，在超净工作台中分装倒入平板，冷却凝固，倒置并进行标签标识。将从海泥中分离获得的多种菌种分别转至含不同浓度的2216E固体培养基平板中，28℃恒温培养箱中倒置培养48h注意事项：用接种环接不同菌种时，应将接种环在酒精灯火焰上灼烧至红色，自然降温至室温，再将菌种从原始培养基上转到含有重金属的固体平板上，结束后再次灼烧准备转接另一种菌，这样可以有效防止染菌。观察菌种生长情况，筛选出耐受重金属能力最强的菌种，并进行培养保存。2.2.316SRNA序列测定进行菌种鉴定2.2.3.1菌落PCR扩增表120ul扩增体系及用量PCR反应体系用量（ul）模板1ul引物10.5ul引物20.5ul2XTaqmix10ulddH2O8ul待测菌株模板的制备：①在1.5mL离心管中加入100ul无菌水②从2216E固体培养基中挑取筛选出的菌种1~2环，放入离心管中并混匀③然后放入100℃的沸水中煮3min，待温度降到室温④进行12000rpm离心，10min，4℃，取上清，便是模板本实验所用PCR参数设置：97℃预变性5min，然后开始PCR循环：94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，总共25个循环。然后72℃终延伸10min，4℃保存。PCR扩增终止后，取扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析，以鉴定PCR扩增结果。2.2.3.21.0%琼脂糖凝胶电泳（1）称0.2g琼脂粉，再量取20mL1×TAE缓冲溶液倒入小锥形瓶中，并在微波炉中加热1min左右直到琼脂粉充分溶解，然后在空气中稍微放置数分钟到手可以握住瓶身不烫手时加0.3ul溴化乙锭核酸染料，充分混匀后缓慢倒入电泳模型中，待冷却完全凝固成型后小心地拔出电泳梳。（2）将凝固好的凝胶连同模具一起放至电泳槽（注意区分正负极），使电泳槽中的TAE缓冲溶液完全浸没凝胶表面。取2ulPCR产物与1ulDNALoadingBuffer用移液器打匀后，垂直加到点样孔中，同时在另一个点样孔中加入2ulMark作为对照。注意事项：将液态凝胶倒入模具时，切记电泳模型不能倾斜，而且凝胶中不能产生气泡，否则影响琼脂糖凝胶的质量。（3）打开电泳仪，90V恒压电泳15-20min，停止电泳。（4）取出凝胶置于紫外分析仪下观察并记录电泳结果。2.2.4不同重金属条件对菌株的影响查找文献资料，确认本实验所拟重金属种类，并分别配制母液浓度如表2：不同重金属溶液的母液浓度不同重金属溶液母液浓度（mol/L）CuSO40.1mol/LCrCl30.1mol/LPb(NO3)20.1mol/LZnCl20.1mol/LCdCl20.5mol/L（2）分别按照表3-7取不同重金属母液加入到含5mL2216E液体培养基的试管中，混匀表3：CuSO4母液配不同终浓度溶液终浓度（mmol）母液用量（ul）1.0mmol502.0mmol1004.0mmol2006.0mmol300表4：取CrCl3母液配不同终浓度溶液终浓度（mmol）母液用量（ul）1.0mmol502.0mmol1004.0mmol2006.0mmol300表5：取Pb(NO3)2母液配不同终浓度溶液终浓度（mmol）母液用量（ul）1.0mmol502.0mmol1004.0mmol2006.0mmol300表6：取ZnCl2母液配不同终浓度溶液终浓度（mmol）母液用量（ul）1.0mmol502.0mmol1004.0mmol2006.0mmol300表7：取CdCl2母液配不同终浓度溶液终浓度（mmol）母液用量（ul）0.5mmol7.51.0mmol151.5mmol22.52.0mmol30设置对照组——不含有任何重金属溶液的2216E培养基在无菌操作下，从培养菌株的2216E固体培养基平板中挑取一环菌体分别加到试管中，做好标签，28℃，摇床恒温培养72h观察，含有重金属的培养基需要每隔12小时将试管取出，摇匀，在超净工作台中分别取出两组150ul打到96孔板中，操作酶标仪，求平均值，分别记录每个时间点的OD600值，72h后统计数据并绘制生长曲线图。不含有重金属溶液的对照组培养基，则需要每隔2小时从试管中取出两组150ul打到96孔板中，使用酶标仪测得OD600值，24h后统计数据并绘制生长曲线图。注意事项：将9号菌种从2216E固体培养基平板上用接种环转接到5ml2216E液体培养基试管过程中，一定不要感染杂菌，否则后期每隔一定时间段测量一次的OD600值将会产生极大误差，影响实验的继续。（2）每次测量时，也要单独用微量移液枪取出两组150ul2216E培养基，使用酶标仪测得OD600值，并求得平均值，与其作差得到的数据是菌株的生长数值。第三章结果与讨论3.1结果与分析3.1.1海洋微生物的分离培养取定量海泥与无菌水混合，静置后取上清液，涂布2216E培养基平板上，多次优化培养，共得到99株，并相应依次编号1~99，将分离纯化的菌株标签4℃保存。3.1.2对重金属耐受性较强的菌株的筛选利用多种菌种对重金属的耐受能力的差异，配制不同CdCl2浓度梯度，从而筛选出耐受重金属能力最强的菌种。不同的CdCl2浓度，实验菌种生长状况良好的结果如下表：表8对重金属的耐受性较强的菌株的筛选不同重金属浓度情况下生长状况良好的菌种0.5mmol3、5、7、9、11、15、17、19、21、24、26、28、30、34、42、49、50、52、53、54、55、56、60、61、68、69、70、71、74、76、78、80、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、95、97、98、991.0mmol9、17、19、21、24、26、53、55、56、60、61、68、69、70、71、74、76、78、80、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、95、97、98、992.0mmol9、17、19、24、26、53、61、69、74、76、78、84、85、88、91、93、95、98、994.0mmol9、24、26、61、69、84、85、91、98由上面的图表可知，对于海洋微生物而言，大部分具有耐受较低浓度的重金属的能力，但是随着重金属浓度的不断增大，具有较强耐受重金属能力的菌株逐渐减少，当浓度达到4.0mmol时，具有较好的生长状况的菌株仅仅剩下9株。鉴于综合比较，9号菌的耐受重金属的能力更强，而且菌株形态良好、生长状况较为稳定，因此本实验以9号菌为实验研究菌种，进一步对相应性质进行研究。3.1.39号菌株的鉴定将活化的菌株在2216E固体平板上培养，取出一环于无菌水中，加热处理使细胞破裂，DNA释放到液体中，然后离心，取上清液作为模板进行16SrDNA的PCR扩增。PCR扩增完成后，再取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。如图1所示，在1500bp左右出有一条明显的泳带，且无非特异性泳带出现。随后将PCR产物送生物公司进行序列测定。bpMPCR产物1500200500800120020003000450015002005008001200200030004500图116SrDNA电泳图图29号菌的系统进化树根据16SrDNA的序列测定结果，在NCBI数据库中进行比对，结果表明9号菌与已报到的的同源性高达99%。且根据测序结果进行系统进化树的构建，如图2，结果表明9号菌与蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）在聚类关系比较近，因此将9号菌株命名为BacilluscereusWSM-9.3.1.4不同重金属条件对9号菌株的生长条件的影响对不同含重金属CdCl2、ZnCl2、Pb(NO3)2、CrCl3、CuSO4溶液进行配制，称量、溶解、定容，过滤除菌，分别得到不同浓度的重金属母液。为测定9号菌对不同重金属的耐受性，本实验首先测定9号菌的生长曲线，即在不加重金属的情况下9号菌的生长情况。在试管中加入5ml的2216E液体培养基培养9号菌种，每隔俩小时取出两组150ul测OD600值，24h后整理数据得到9号菌生长曲线图。图3不含重金属的培养基中菌种的生长情况如图3所示，大约培养6小时左右，9号菌株进入对数生长期，生长旺盛，当培养14小时后，菌株便进入稳定期，菌株生长情况几乎不变，且略有下降，整体表现为典型的“S”型生长曲线。为了测定9号菌对不同重金属的耐受性，将9号菌接种至对含有不同重金属的2216E培养基进行震荡培养，每隔12小时取样一次，测定OD600值，从而确定其生长情况。图4含Pb(NO3)2重金属溶液的培养基中9号菌的生长曲线图图5含CuSO4重金属溶液的培养基中9号菌的生长曲线图图6含CrCl3重金属溶液的培养基中9号菌的生长曲线图图7含ZnCl2重金属溶液的培养基中9号菌的生长曲线图图8含CdCl2重金属溶液的培养基中9号菌的生长曲线图如图4-8所示，9号菌在较低浓度（0.5mM）的CdCl2、CuSO4、CrCl3、Pb(NO3)2、ZnCl2溶液中培养时，生长虽然缓慢，但仍然符合“S”型生长曲线的生长趋势，但当在浓度较高时重金属溶液中培养时，9号菌种的生长极其缓慢。根据测定结果表明，9号菌对铅离子和铜离子的耐受能力最强，高达2mM。3.2讨论本实验是从中国科学院海洋研究所保存的海泥中分离筛选出具有较强耐受重金属能力的菌株，并对耐受性较强的9号菌株进行初步的鉴定。根据16SrDNA的测序结果，通过同源比对和聚类分析表明，9号菌株与蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）在进化关系上比较近，因此将9号菌株命名为BacilluscereusWSM-9。在探究不同浓度的的不同重金属对菌种的生长情况的影响的实验中，确定筛选出的9号菌种确实具有较强的耐受重金属的能力，为重金属污染的生物修复提供素材和相应理论依据。在微生物修复技术中，微生物耐受重金属的作用机理，大致有三个原理：一是微生物将重金属吸附或是转移到体内进行隔离，降低重金属的危害；二是微生物将有毒重金属转化为无毒金属离子或其他离子，再排到环境中，使环境条件改善；三是微生物的共沉淀作用，微生物使环境发生了酸碱pH微变化或是微生物自身释放的离子与重金属发生共沉淀，从而降低环境中的重金属污染。查阅资料文献可知，刘爱民、黄为一等人曾通过梯度浓度驯化筛选出一株假单胞菌属[14]，可以高度耐镉和富集镉，其原理是：该菌株能在Cd2+浓度极高的液体细菌培养基中存活；Cd2+浓度较低时菌株主要是起积累作用，其中浓度为100mg/L时，积累率接近为100%，而当Cd2+浓度过高，菌体也会出现外排现象。并且当pH值为6-8有利于极大提高该假单胞菌株的耐镉能力。红外分析和电镜观察表明，该假单胞菌株的细胞壁起了重要的吸附作用，大约过半的Cd2+吸附在细胞壁上。为确定9号菌株对重金属污染的生物修能力，其耐受重金属的机制可设计相关实验进行进一步的探讨。参考文献SingS,KangSH,MulchandaniA,etal.Bioremediation:environmentalclean-upthroughpathwayengineering(J)CurrOpinBiotechnol,2008,19：437-444PavelK,MartinaM,TomasM.MicrobialBiosorptionofMetals(M).SpringerScience:BusinessMediaBV,2011:320王瑞兴，钱春香，吴淼等微生物矿化固结土壤中重金属研究（J）功能材料，2007,9(38):1523-1530刘建英，徐英贤有机阴离子对螺旋蓝细菌富集重金属的影响研究（J）环境科技，2010,23（3）：23-26ChanmugathasPushparany,BollagJM.AcolumnstudyofthebiologicalmobilizationandspeciationofCadmiuminsoil[J].ArchivesofEnvironmentalContaminationandToxicology,1988,17(2):229-237EwaKurek,FrancisandAJ,BollagJM.Immobilizationofcadmiumbymicrobialextracellul