铅锌矿区优势植物根际土促生菌的分离、筛选及鉴定研究

铅锌矿区优势植物根际土促生菌的分离、筛选及鉴定研究ISOLATION,SCREENINGANDIDENTIFICATIONOFPLANTGROWTHPROMOTINGRHIZOBACTERIAFROMDOMINANTPLANTSINLEAD-ZINCMININGAREATOC\o"1-3"\h\u2201摘要 铅锌矿区优势植物根际土促生菌的分离、筛选及鉴定研究学生：刘爽指导老师：肖云花(湖南农业大学生物科学技术学院，长沙410128)摘□要：目前我国耕地重金属污染严重，影响粮食品质，进而会危害人体健康，耕地土壤重金属修复迫在眉睫。微生物-植物协同修复重金属因为其绿色友好的修复特点受到广大研究者的重视。其中，高效的植物促生菌具有促进植物生长，强化植物富集重金属的能力，能够实现对重金属污染土壤的修复。本实验从湖南省花垣县铅锌矿区采集了五种优势植物的根际土，从中分离纯化得到22株细菌，并对它们依次进行分泌吲哚乙酸（IAA）、产ACC脱氨酶活性、产铁载体、溶磷、固氮、解钾等促生能力测定，复筛出具有高效促生作用的菌株，包括MS3、PS3、ZS1、ZS3、ZS4、TS8，经分子鉴定，MS3，PS3为Serratiamarcescens，ZS4，ZS1，TS8是Klebsiellaoxytoca，ZS3是Bacterium属。其中，TS8的促生效能最强。通过本次实验可以对细菌促生作用加深了解以及为生物修复提供新的思路。关键词：铅锌矿区优势植物；根际促生细菌；吲哚乙酸；ACC脱氨酶；铁载体；溶磷；固氮；解钾Isolation,

Screening

and

Identification

of

plantgrowthpromotingrhizobacteria

from

dominantplantsinlead-zincminingareaStudent:LiuShuangTutor:XiaoYunhua(CollegeofBiotechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China)Abstract:Nowadays,Chinaisfullofcultivatedlandpollutedbyheavymetals,andthequalityoffoodhasbecomeworse,leadingtotheweakeningofhumanbody.Asagreenandfriendlymeansofremediation,themicrobial-plantcooperativeremediationofheavymetalshasattractedtheattentionofmanyresearchers.Amongthem,highlyeffectiveplantprobioticbacteriacanpromoteplantgrowth,strengthenplantenrichmentofheavymetals,soastoachieveheavymetalpollutionremediation.Thisexperimentthroughcountylead-zincmineareawascollectedfromHunanprovinceandfiveadvantageplantrhizospheresoil,whichscored22strainsofbacteria,isolationandpurificationofsecretionandtheyinturnareindoleaceticacid(IAA),produceACCdeaminaseactivity,producingironcarrier,solublephosphorus,nitrogenfixation,theabilitytodeterminethegrowth,suchasbetweencompoundsieveoutaneffectiveroleinthegrowthofstrains,includingMS3,PS3,ZS1,theZS3,ZS4,TS8,viamolecularappraisal,MS3,PS3(identificationtospecies)isaSerratiamarcescens,ZS4,ZS1,TS8isKlebsiellaoxytoca,andZS3isBacterium.Amongthem,theeffectofTS8canbethestrongest.Throughthisexperiment,wecanstrengthenthecomprehensionofthegrowth-promotinginfluenceofbacteriaandaffordnewideasformicrobialrepair.

Keywords:dominantplantsoflead-zincminingarea；Plantrhizospherebacteria；indoleaceticacid；ACCdeaminase；siderophore；phosphorussolubilizing；nitrogenaseactivity；dissolvepotassium1前言1.1重金属污染的严重性类似于Cd、Pb等含有严重毒性且不能被降解的重金属，会通过转换形态、分离或者富集继续存在。为了推动经济发展和获取能源，矿产资源和化石燃料一直处在被开采的状态，而且在农业方面农民为了方便高效，滥用农药和化肥。，使得生态环境遭到严重破坏，土壤重金属污染尤为严重。土壤重金属污染具有隐蔽性，不可逆性，长期性和危害大的特点[1]。它会使得农作物生长缓慢，减少其产量，甚至有毒重金属会积累在作物中被送上餐桌，进入人体，在体内囤积，有些重金属会损害神经系统的机能甚至致癌。不仅如此，它对生态环境，耕地质量和粮食安全，社会发展等都是极其不利的因素[2]。所以修复土壤重金属污染迫在眉睫。为了寻找经济绿色且不会造成二次污染的修复方法，研究者们做了很多的研究，结果探究到生存在重金属污染土壤中的PGPR有些不仅对植物有良好的促生性能，而且自身具备多种重金属耐性，甚至可以帮助植物修复污染土壤。因此植物——微生物联合修复成为土壤重金属修复的热门研究[3]。1.2矿区优势植物的生物特性和土壤修复价值矿区会有很大程度重金属污染，植物的生长条件相对恶劣，生长发育势必受到影响。。因此在矿区生长的植物抗环境胁迫能力强，生长条件简单，多是草本植物。在长期的自然选择下，矿区生长占优势的植物会产生对重金属毒害的防卫机制，其中有些优势植物对重金属具有一定耐性，同时具有吸收富集污染土壤中的重金属能力，它们就可以作为植物修复的资源。由于不同植物对重金属吸收和富集方式不同，可以概括为三种分别是是富集型植物、根囤积植物和规避型植物。富集型植物吸收重金属能力很强，它们会把植物根吸收的重金属向上转移，积累在植物地上部分。。根囤积型植物同样可以吸收大量重金属，但是都储存在根部，不会向上转移。规避型植物在高浓度重金属地区生长，只能少量吸收重金属[4]。富集型植物和根囤积型植物对土壤修复效果更好。其中，修复能力较为突出的优势植物有芒草、东南景天、金丝草等。芒草生长快且生物量大，适应性极强，能够适应各种气候和土壤环境，在正常的土壤下不要肥料也能生长，生命力旺盛。它的水分利用率和光合效率明显高于其他作物[5-7]。芒草同时也具有较强的重金属耐性，所以它们在修复重金属污染土壤方面也是强于其他植物。在2002年的时候就有关于野外芒草对重金属耐性的报道。，韦朝阳[8]等通过对两个中国典型砷矿区的调查发现，中国芒对砷具有极强的耐性，其地上部砷的累积可达760mg/kg。据统计，芒草以其适应性强和耐重金属的优势在我国二十多个矿区顽强生长。研究发现，芒属植物不管是应对单一重金属还是多种重金属的高浓度胁迫环境，都能表现出很好的耐性。，但是不同的芒属植物的耐性存在差异，五节芒在Cd含量为320mg/kg矿区土壤上仍可以正常生长，荻却不可以[9]。东南景天是一类重金属超积累植物，对土壤中的镉具有良好的修复能力。Xiong等人比较了矿区和非矿区生长的东南景天对土壤中镉修复性能的区别。矿区东南景天所能够承受的最大镉浓度为非矿区东南景天的四倍[10]。东南景天同时也能超富集锌，对矿区土壤高浓度锌表现出良好的耐性。金丝草（Pogonatherumcrinitum）是多年草本生植物，它也是一种超富集植物，在铅锌矿区超富集铅。它可以在土壤Pb含量小于20000mg/kg的环境中正常生长，对Pb有强的耐性和富集能力[11]。它们这些植物在植物修复上有广泛的应用前景。并且研究表明矿区优势植物耐重金属的原因大多是根系代谢能力强，具有较强抗氧化和光合作用能力并且根际存在多种有益微生物[12]。所以为了能更好地了解植物耐重金属特性以及更好地利用其修复重金属土壤，研究矿区优势植物根际土促生菌是很有价值的。本实验选取的材料是湖南花垣县铅锌矿区的五种优势植物，分别是五节芒、艾草、婆婆纳、唐菖蒲、苎麻。花垣县资源丰富，有二十多种矿产，铅锌矿储量在湖南甚至全国都是排在前列。它被誉为“有色金属之乡”。选择此处矿区的优势植物非常有代表性。五节芒是芒草的一个品种，是多年生的禾本科植物；艾草和婆婆纳都是草本植物，艾草多年生，婆婆纳一年至二年生；草本植物；唐菖蒲是鸢尾科的一个种，大多半野生；苎麻则是一种亚灌木或灌木植物。它们在矿区生长状况良好，生长旺盛，是优良的研究材料，对探究矿区优势植物在植物——微生物联合修复中起的作用很有意义。1.3植物根际促生菌及研究进展在植物根际土壤中生活着大量微生物，它们在土壤生态系统起着推动能量流动和物质循环的作用，，参与了土壤中多种元素的流动，例如C、N、P等，而且还参与了有机物的分解[13]。不同的微生物群落存在于不同植物的根际，与植物相互作用。有一部分对植物生长有害，而另外一类能够促进植物生长发育，防止植物被病毒微生物伤害，从而增加产量的微生物被称作植物根际促生菌(plantgrowthpromotingrhizobacteria，简称PGPR)。从1978年Burr等研究者报道出对马铃薯有促生作用的PGPR以来，在这30多年里国内外的学者和科学家对PGPR进行了不断地研究，现在分离培养出的PGPR的种类主要有假单孢菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、农杆菌属(Agrobacterium)、埃文氏菌属(Eriwinia)、黄杆菌属(Flavobacterium)等[14-17]。王光华[18]等从大豆根际土壤分离到一株可以抵抗七种病原微生物的芽孢杆菌BRF-1。康贻军[19]等从江苏扬州、盐城等地土壤样品筛选出14株PGPR,包括假单胞菌、类芽抱杆菌属等，具有体外抑菌、产NH3、产IAA、解磷、固氮以及产抗生素等多种促生能力。吴皓琼[20]等分离筛选的ASP－15克雷伯氏菌(Klebsilla)，兼具解磷、固氮及抑制病原真菌生长的功能。PGPR可以促进植物对矿物元素的吸收，获得营养物质。同时PGPR能够产生促进植物生长的代谢产物，调节植物的激素浓度，达到对植物直接地促生效果；其间接促生方式主要是抑制病原微生物生长、诱导植物产生系统抗性等[21]。直接和间接作用共同的结果就是促进植物生长发育。同时研究发现，从重金属污染土壤分离出来的，对多种重金属具有较高耐受性PGPR，具有促进植物生长，增加修复植物生物量，提高植物修复重金属的效率的作用。2014年，Ahmad[22]发现在重金属污染条件下，接种PGPRKlebsiellasp.CIK-502能够增加小麦和玉米生物量，同时显著降低地上部与地下部Cd含量。当前，PGPR的促生机制以及对重金属污染的土壤修复成为了农业、环境保护、生态研究的一大热点。1.4植物根际土促生菌的促生机制1.4.1调节植物激素的浓度对植物生长起作用并且控制植物其他生命活动的植物激素主要有细胞分裂素、吲哚乙酸、赤霉素、乙烯等，尤其是吲哚乙酸IAA被视为最重要的天然生长素。据统计，80%的PGPR具有产生IAA的功能[23]。IAA可以增加植物根的数量，有助于植物根系的生长，扩大根系吸收面积，然后促进根系对重金属和营养物质的吸收，从而增加金属修复量。罗雅[24]从重金属污染土壤分离到一株Pb和Cd耐性菌株（Ochrobactrumsp.J3），盆栽试验结果表明，接种菌株J3的香根草（Vetiveriazizanioides）生物量是不加菌的2.1倍。同时，PGPR也会产生ACC(1-Aminocyclopropane-1-carboxylicacid)脱氨酶调节乙烯的浓度。Sheng[25]从重金属污染土壤生长油菜根系中分离到两株对重金属铅有较强耐受性，且具有分泌ACC脱氨酶能力的植物促生菌PseudomonasfluorescensG10和Microbacteriumsp.G16，在铅污染土壤盆栽试验中，接种菌株G10和G16显著提高了油菜生物量和铅积累量。在正常的情况下，乙烯的作用是帮助打破种子休眠，加速植物生长发育，而且也是防御信号分子。但是在种子萌发和即将成熟的时期会合成大量乙烯，或者在重金属等逆境胁迫下，乙烯浓度会急剧上升，而过量的乙烯会抑制大多数植株根的伸长，损害植物的生长，此时根际促生细菌产生的ACC脱氨酶就发挥作用了，它可以分解合成乙烯的前体ACC，ACC被分解后，乙烯无法合成，进而浓度就会降低，也加强了植物抗性，削弱了环境胁迫对植株的伤害。1.4.2产生铁载体铁元素是植物生长所必需的生长因子，如果植物体内缺乏铁元素会影响叶绿体的合成，植物会得黄叶病。尽管在植物根际中有一大批铁元素，不过基本上是以难溶性的三价铁离子形态出现，不允许直接进入植物体内。此时PGPR会分泌铁载体，铁载体与Fe3+特异性结合形成可溶性铁——嗜铁素复合体，复合体进入植物体内会被水解，被还原成Fe2+，Fe2+则可以被植物高效利用。研究表明，类似Fe等植物生长所需金属元素如果要进入植物的根，大部分是被根表皮细胞吸收然后转运蛋白转运的。这种方式特定且专一。可以将植物体内的金属元素浓度控制在正常范围，防止植物因金属浓度过高被毒害。。Guo[26]等研究发现在Cd污染条件下，接种具有铁载体分泌能力的植物促生菌（Bradyrhizobiumsp.YL-6）能够显著增加大豆叶片里Fe和Mg元素的含量，同时也能增加叶片光合色素含量。也有研究表明，PGPR还有其他的促生作用，因为病原菌生长同样需要铁元素，而PGPR产生的铁载体更容易获得土壤根际的铁，所以它们的生长会受到限制，就可以创造一个相对健康的生长环境，使植物更好地发育。1.4.3溶磷解钾磷元素和钾元素都是植物生长中重要的营养素，磷还参与了植物的蛋白质代谢、脂肪代谢、糖类代谢。在重金属污染的土壤里，重金属元素会与磷酸盐矿物形成难溶性磷酸盐沉淀，有些PGPR会分泌出甲酸、乙酸等有机酸，从而降低根际土壤的PH，使不溶态的无机磷和无机钾的可溶性和有效化提升，变成易于植物吸收的可溶态形式。当磷元素被吸收，磷酸盐分解，重金属元素也会被分离出来，重金属离子的增加就会让植物根系增加对其的吸收、转运。Jiang[27]等人从重金属污染土壤分离得到一株具有溶磷功能的伯克氏菌（Burkholderiasp.J62），将其接种于玉米和番茄的土壤中进行盆栽试验，结果发现这个菌对金属活化能力很强，玉米和番茄中的Pb和Cd含量明显高于未接菌的。1.4.4固氮大自然中最常见的的固氮方式是生物固氮。氮气是空气的主要组成成分，生物固氮的机理就是通过固氮微生物吸收空气中氮气并将它转化成氨。由于植物不能直接利用空气中的氮气作为氮源，但是氮素又是必需的元素，所以固氮作用对它们的生长大有影响。生物固氮包括共生固氮、非共生固氮和联合固氮[28]。根际细菌参与固氮的形式主要是共生固氮和非共生固氮。很多豆科植物生根时根瘤菌入侵根部形成根瘤与植物共生，植物给根瘤菌运输营养物质，根瘤菌通过固氮作用帮助植物获得其所需的氮素，这就是共生固氮。非共生固氮就是非豆科植物根际土壤中的PGPR释放固氮酶，将较高价态的N2还原成NH3，再利用土壤中的硝化细菌转换成硝酸根，然后以离子形式被吸收。在缺氮环境下，PGPR比其他菌存活得更好并且对植物生长有很大的促生效果。1.5论文的主要内容及研究意义本论文的主要内容是对湖南花垣县铅锌区优势植物的根际土促生细菌进行研究。通过实验，分析这些细菌的促生性能和耐重金属性，选出优良的根际促生细菌。在本实验的研究后，经过盆栽试验依然能表现出优良的促生能力和耐重金属特性的菌株如果可以投入到实际栽培，与植物联合修复重金属污染的土壤，同时利用PGPR的促生功能促进植物生长。例如，投入到重金属污染的矿区中，可以吸收矿区重金属，恢复矿区的生态环境，保持当地的水土，提高矿区的植被覆盖率。如果运用到耕地，这些细菌可以作为一种绿色肥料，起到部分农药，化肥的作用，但是又不会像农药化肥因为过度使用而留下残留物毒害作物。它们可以吸收有毒物质，改善耕地土壤质量；提高作物在面对土壤污染等环境胁迫下的抗性；产生的IAA、ACC脱氨酶和铁载体等生长因子直接地促进作物的生长，提高作物的产量。虽然这只是我的猜想，植物根际促生细菌还未实现产业化发展，大量生产应用于实际，但是本研究的筛菌工作丰富了PGPR的菌株库，为开展植物根际促生菌株资源调查和特性研究，探究与植物交互作用等工作做出了贡献，为菌肥的生产提供了理论依据。2材料和方法2.1试验材料采集位于湖南省花垣县铅锌矿区的优势植物五节芒、艾、唐菖蒲、苎麻、婆婆纳，将完整植株以及植株距离地面5cm下的土壤和根系铲出装入密封袋低温保存带回实验室做样品。2.2培养基LB培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠NaCl10g，1000ml去离子水，pH7.2。DF培养基：磷酸二氢钾4.0g，七水硫酸镁0.2g，磷酸氢二钠6.0g，葡萄糖酸钠2.0g，柠檬酸0.2g，葡萄糖2.0g，硫酸铵2.0g，pH7.2。ADF培养基：磷酸二氢钾4.0g，磷酸氢二钠6.0g，七水硫酸镁0.2g，葡萄糖酸钠2.0g，柠檬酸0.2g，葡萄糖2.0g，硫酸铵2.0g，ACC3g，pH7.2ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>秦宝军</Author><Year>2012</Year><RecNum>7</RecNum><DisplayText>[3]</DisplayText><record><rec-number>7</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xr29wsz5fa0f0qes05f5r2f8vzs5pvp0xeas"timestamp="1571969266">7</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>秦宝军</author><author>罗琼</author><author>高淼</author><author>胡海燕</author><author>徐晶</author><author>周义清</author><author>孙建光</author></authors></contributors><titles><title>小麦内生固氮菌分离及其ACC脱氨酶测定</title><secondary-title>中国农业科学</secondary-title></titles><periodical><full-title>中国农业科学</full-title></periodical><pages>1066-1073</pages><volume>45</volume><number>6</number><dates><year>2012</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>。Ashby培养基：购自索莱宝公司，产品编号LA6960。PDA培养基：购自索莱宝公司，产品编号PA831。改良马丁培养基：蛋白胨5.0g，酵母提取物2.0g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，1000ml去离子水，pH6.6。蒙金娜（PKO）无机培养基：七水硫酸镁0.3g，葡萄糖10.0g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，磷酸钙2.0g，氯化钾0.3g，一水合硫酸锰0.03g，绿矾0.036g，1000ml去离子水，琼脂20g。亚历山大硅酸盐培养基：磷酸氢二钠2.0g，七水硫酸镁0.5g，碳酸钙0.1g，六水合氯化铁0.005g，蔗糖5.0g，钾长石粉1.0g，1000ml去离子水，琼脂20.0g。CAS培养基：将A液倒入B液中混匀。A液：60.5mgCAS溶于50ml去离子水中，再与10ml1mM六水合氯化铁混合后，加入到72.9mg十六烷基三甲基溴化铵（HDTMA）与10ml水的混合溶液中。115℃灭菌20min，保温至50℃。B液：七水合磷酸氢二钠12.8g，磷酸二氢钾0.3g，氯化钠0.5g,氯化铵1g，0.1mol/L硫酸镁200ul，0.1mol/L氯化钙100ul，100ml去离子水，稀释10倍。在75ml超纯水中加入10mlMM9，3.024gPIPES，0.6g氢氧化钠溶解，高温灭菌保温50℃，加入2ml20％葡萄糖和100ul0.2mol/L盐酸硫铵，得B液。2.3根际细菌的分离、纯化将湖南花垣铅锌矿区优势植物根际附着的松散大颗粒土抖落，取10g土样置于锥形瓶中，使用灭菌超纯水充分冲洗植物根际土，静置10min，收集悬浊液，取1ml悬浊液进行梯度稀释，取10-4~10-6梯度的悬浊液0.1ml涂布接种于LB固体培养基，在30℃恒温培养2d，得到植物根际土细菌。2d后，根据菌株的生长情况，挑选大小，颜色及形态各异的菌落，将它们接于LB固体培养基上，划线纯化，得到的菌株即是纯菌株，将纯菌株利用甘油保藏法置于超低温（-80℃）冰箱中备用。2.4菌株促生特性测定2.4.1产IAA能力测定为了测定菌株IAA的含量，本实验采用Salkowski比色法，每种菌吸取1ml菌悬液放入含有100mg·L-1L-色氨酸的LB液体培养基中，30℃、180r·min-1条件下摇床培养1d。用移液枪取50uL菌悬液滴加到于白瓷板上，取完后滴加50uLSalkowski’s比色液到每份菌液，同时设置对照组，即在白瓷板上滴加50uLIAA（50mg•L-1），然后加入50uL比色液混合。在室温下，将白瓷板放到避光处静放置30min，观察混合液体的颜色，颜色能够变红的菌液说明这个菌株可以产IAA。将反应液变红的菌株记录下来，然后按照记录吸取每种菌的菌悬液1ml，将菌悬液放进离心机，10000rpm离心10min后，取0.5ml上清液加入两倍体积的Salkowski显色剂充分混合后放到于暗处反应30min，后使用紫外分光光度计检测反应液OD530nm。IAA进行梯度稀释后制做标准曲线，OD值代入标准曲线就能得出每种菌株分泌IAA量。每组实验重复三次。Salkowski’s比色液：35%的高氯酸和0.5mol/L的氯化铁按体积比50:1配制混匀，现配现用。2.4.2产ACC脱氨酶活性测定取1mlLB培养基中的菌液接种到100mlDF培养基，在30℃，180r/min条件下培养1d，从中取1ml菌悬液加入100mlADF培养基中，30℃，180r/min培养1~2d，吸取ADF培养基中生长的菌株进行ACC脱氨酶活性测定。ACC脱氨酶活性参照HONMA[29]等方法，上述能生长的菌株在LB液体培养基中活化1d，设置3组重复，4℃离心，用不含（NH4）2SO4的DF培养基洗涤3次，重悬于ADF培养基培养1d后，4℃离心收集菌体，0.1mol/LTris-HCl(PH=7.6)洗涤三次，重悬于600μL0.1mol/LTris-HCl(PH=8.5)中，加入30μL甲苯，涡旋震荡仪震荡30s，100μL细胞提取液使用考马斯亮蓝测定蛋白浓度。取200μL细胞提取液加入20μL0.5mol/LACC，同时再此设置对照即空试管中加0.5mol/LACC，置于30℃水浴加热15min，添加1mL2mol/LHCl，12000r/min离心5min，取上清液1mL，添加800μL0.56mol/LHCl和300μL在2mol/LHCl中溶解的0.2%2,4-二硝基苯肼溶液，30℃保温30min，加入2mLNaOH,540nm测吸光度值。α-丁酮酸标准曲线的制定[30]：用0.1mol/L（PH8.5）的Tris-HCl缓冲液配制α-丁酮酸梯度稀释液，每管分别加入300μl0.2%的2,4-二硝基苯肼，混匀后于30ºC水浴30min，加入2ml2mol/L的NaOH溶液显色，稳定后测其OD540，以Tris-HCl（PH=8.5）溶液做空白对照。OD540测吸光度。以α-丁酮酸浓度（0,0.2,0.4,0.6,0.8,1μmol）为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线。蛋白质标准曲线的制定：0.01g牛血清白蛋白(BSA),定容至100ml，0.1mg/ml。取蛋白质标准液（0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6,1.8,2.0ml）加水至5ml，加入5ml考马斯亮蓝G250，OD595测吸光度。酶活力比=生成丁酮酸物质的量/[总蛋白质含量（mg）*测定酶活所用体积（μl）*酶活反应时间（min）/测总蛋白质所用的体积（μl）][31]。2.4.3产铁载体能力测定将单菌落点接到CAS平板上，每个平板3个重复，30℃培养5-7d后，观察CAS平板是否产生橙黄色透明晕圈，如果产生了，说明这个菌可以分泌铁载体。后期将初筛出具有产铁载体能力的菌株接种到LB液体培养基中30℃培养2d后,放到离心机离心10min，设置转速为10000r/min。取出后吸取上清液，加水稀释10倍，加入等体积CAS检测液并混合，静置60min后于用紫外分光光度计630nm检测吸光度A。取培养基加水稀释10倍，与CAS等体积混匀测得吸光度Ar。铁载体活性单位(siderophoreunit,SU)=[(Ar-A)/Ar]×100。2.4.4产酸能力测定营养培养基培养筛选菌株于30℃，180rpm条件下培养5天，每24小时测定一次PH值并记录。2.4.5固氮菌株筛选吸取100μl菌液均匀点接到Ashby培养基的三处，形成类似等边三角形的形状，即三点接种法，每种菌株重复三次，在30℃的恒温培养箱中培养3d，观察菌落生长情况，生长的则为固氮菌。2.4.6溶磷菌株筛选吸取100μl菌液均匀点接到PKO无机培养基的三处，形成类似等边三角形的形状，即三点接种法，每种菌株重复三次，在30℃恒温培养箱中培养3d，观察菌株形态，以透明圈作为判断标准，如果出现了就说明这个菌株可以溶磷。然后测量菌株直径d1和透明圈直径D1，菌株溶磷能力=透明圈直径(D1)/菌落直径(d1)。2.4.7解钾菌株筛选同样使用三点接种法将菌液点接到亚历山大硅酸盐培养基上，每种菌株重复三次，30℃恒温培养箱中培养3d，观察菌株形态，以透明圈作为判断标准，如果出现了就说明这个可以解钾。然后测量菌株直径d2和透明圈直径D2，菌株解钾能力=透明圈直径(D2)/菌落直径(d2)。2.4.8根际土壤细菌的鉴定形态学鉴定：在载玻片上滴加少量无菌水再滴加10μl菌液，酒精灯蒸干，结晶紫染色1min，冲洗，碘液染色1min，冲洗，无水乙醇脱色，番红复染1min，蒸馏水冲洗。干燥，镜检。分子生物学鉴定：菌株DNA提取步骤按照细菌基因组DNA提取试剂盒(TiangenDP302)进行，利用细菌通用引物27F和1492R扩增细菌的16SrDNA片段。PCR反应体系（50μL）：正向引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和反向引物1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')各1μL，DNA模板1μL，ddH2O22μL，2×TaqPlusMasterMixⅡ（DyePlus）（VazymeP213-01）25μL。反应条件:95℃5min(95℃45s,55℃45s，72℃1min)×35个循环，72℃延伸10min，4℃保温。琼脂糖凝胶电泳：1.2g琼脂糖溶于120ml1×TAEBuffer，微波炉（中火）加热溶解，中途取出摇匀至透明，清亮。冷却至50℃（不烫手）加入5μlEB，倒入插有梳子胶槽，冷凝。将胶置于核酸电泳槽，倒入1×TAEBuffer。胶槽中加入5μl含有loadingbuffer的PCR产物，DNAmarker5μl单独加入一个胶孔。120V,45min。凝胶呈像仪呈像。PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将测序得到的结果进行拼接，在NCBI网站进行序列对比，确定与已知序列的关系，相似度达97%以上即为一个种。2.5优良菌株耐Cd能力测定将实验结果进行比较，挑选出促生性能较为优良的菌株，接种到含有不同Cd浓度平板上。测定其生长曲线。2.6数据处理使用Microsoftexcel2010和SPSS20统计软件进行数据处理。3结果和分析3.1菌株筛选通过第一步的分离纯化，从五种优势植物根际土壤样品中一共筛选出22株植物根际细菌，将其编号为TS1-TS8，PS1-PS5，AS1-AS2，ZS1-ZS4，MS1-MS3，接下来的研究便是选择这22株菌进行的。3.2产IAA能力观察白瓷板上反应液的变色情况来判断22株被测菌株是否能产生IAA，结果（图1）发现这22株根际土细菌中有10株菌有分泌IAA的促生性能。它们分别是TS3、TS7、TS8、ZS1、ZS3、ZS4、PS3、PS5、MS3、AS1。颜色越深表示分泌IAA能力越强。对具有产IAA能力的菌株进行定量实验，IAA的含量根据标准曲线（y=54.871x-3.9959R²=0.9969）计算。从定量结果（图2）表明菌株TS8与ZS3产IAA能力最强，分别为65.75mg/L和74.21mg/L，PS5产IAA的能力最弱，其余菌株的产IAA含量在1.38~15.90mg/L之间，并且相对于TS8和ZS3来说，分泌IAA的量还是有很大的差异的。说明TS8和ZS3具有较强的促生性能。图1菌株IAA定性测定Fig1qualitativedeterminationofIAAstrain图2菌株产IAA定量实验结果P<0.05Fig2quantitativetestresultsofIAAproductionbystrainP<0.053.3产ACC脱氨酶能力前面已经筛选出10株具有分泌IAA功能的根际土促生细菌，接下来通过对这些细菌的ACC脱氨酶的活性测定来选出同时具有产ACC脱氨酶能力的优良菌株。主要以每小时形成1μmolα-丁酮酸的活性作为ACC脱氨酶的单位活性。从结果（图3）可以看出这10株菌都具备产ACC脱氨酶的性能。不过还是有能力高低之分的。分析得出这些菌的ACC脱氨酶的活性范围是在0.1249~1.4122μmolα-Kb/h·mg，依然是TS8的ACC脱氨酶活性最高，然后是PS5，排在最后的是MS3，且TS8显著高于其他菌（P<0.05）。图3菌株ACC脱氨酶活性实验结果Fig3experimentalresultsofdeaminaseactivityofACCstrain3.4产铁载体能力测定测定根际细菌产铁载体的能力主要是使用CAS平板法。通过观察蓝色的CAS平板是否产生橙黄色透明圈鉴定性能。结果（图4）表明在上个实验筛选出的10株菌中剩有6株能够产生铁载体，分别是MS3、PS3、TS8、ZS1、ZS3、ZS4。再对这6株菌进行定量检测，铁载体活性单位(siderophoreunit,SU)=[(Ar-A)/Ar]×100。SU数值越大，说明铁载体活性越强，这株菌的促生性能也越强。从（图5）不难看出，这6株菌中ZS4产铁载体的能力很高，SU达到了39.47%，其他菌就稍微弱了些。SU的总体范围是39.48~14.03%之间。图4铁载体定性实验Fig4qualitativeexperimentofironcarrier图5铁载体定量实验Fig5quantitativeexperimentofironcarrier3.5固氮溶磷解钾能力通过观察Asbby培养基上菌落的生长情况可以选出能固氮的根际促生菌。而要选出具有溶磷能力的菌株就是要能够在PKO无机培养基产生透明光圈，选出具有解钾能力的菌株就是要能够在亚历山大硅酸盐培养基上产生透明光圈。然后将6株菌进行测定，如（图6）所示，TS8、ZS1、ZS3、ZS4、PS3、MS3都能够固氮。从（图7）看到，具有溶磷功能的有5株，TS8不能溶磷，其他菌株可以。而具有解钾功能的是（图8）4株，分别是ZS1、ZS4、TS8。定量分析得到各自的固氮溶磷解钾能力可以在（表1）上体现。PS3固氮最厉害，为2.66。MS3的溶磷最厉害，为3.39，TS8的解钾最厉害，为2.33。图6菌株固氮能力实验结果Fig6experimentalresultsofnitrogenfixationcapacityofstrain图7菌株溶磷能力实验结果Fig7experimentalresultsofphosphorousdissolutionofstrain图8菌株解钾能力实验结果Fig8experimentalresultsofpotassiumdecomposingabilityofstrain表1固氮，溶磷，解钾能力研究结果Table1Theresultsofnitrogenfixation,phosphorusdissolutionandpotassiumdissolution固氮能力溶磷能力解钾能力ZS11.9633±0.153081.5233±0.013651.9667±0.38109ZS31.9967±0.342692.1100±0.19053-ZS41.3033±0.046192.6333±0.202071.9600±0.40596MS31.3600±0.121243.3900±0.67179-PS32.6633±0.565252.2433±0.21362-TS8-1.6667±0.288682.3333±0.57735注：“-”表示不具有响应的功能3.6产酸能力在植物根际土壤中，部分根际细菌具有产酸的能力，能够降低土壤的PH，增加不溶矿物的溶解性和金属元素的有效性。通过观察记录5天里这6株菌的PH，结果（图9）显示菌株TS8、MS3、PS3具有产酸功能，其余3株并不能产酸。其中PS3产酸能力最高，TS8和MS3的能力差不多。图9产酸能力测定Fig9determinationofacidproductioncapacity3.7细菌鉴定通过筛选最终选出了6株具有产IAA，产ACC脱氨酶，产铁载体三项主要功能的菌株，镜检结果如图10。经测序后，在Genbank数据库进行序列分析和相似性比较，MS3，PS3为Serratiamarcescens（相似性100%），ZS4，ZS1，TS8是Klebsiellaoxytoca（相似性98%），ZS3是Bacterium属（相似性99%）。图10菌株形态学鉴定结果Fig10morphologicalidentificationresultsofstrain3.8生长曲线测定从实验结果分析，TS8在产IAA、ACC脱氨酶两方面最厉害，产铁载体含量较多，并且具有固氮和解钾能力，所以综合考虑，决定选取TS8进行平皿试验，将其接种在Cd浓度分别为0ppm，10ppm，20ppm，30ppm，40ppm，50ppm，60ppm，70ppm的培养基上，测得TS8在36h下的生长曲线如（图11），实验结果表明TS8在没有Cd的培养基中生长能力强，但在含有大于10ppmCd的培养基中，它的生长受到抑制，且随着镉浓度升高，抑制作用越明显。图11TS8的生长曲线Fig11growthcurveofTS84结论和讨论近年来，化肥的过度使用使农业生态环境遭到破坏，土壤重金属污染严重，此时，修复土壤环境并同时能够促进作物、植物生长的绿色高效可持续肥料迫切被需要。而PGPR与植物相互作用的机制成为生物修复的一个重点。研究发现PGPR的作用方式多样，但是PGPR的菌株特性和对不同生物环境的适应性存在差异限制了的应用，因此筛选更多优良PGPR菌株就显得十分迫切。所以在重金属污染严重的环境下更容易筛选出具有重金属抗性的促生细菌。在重金属污染的环境下，PGPR已经形成了耐重金属的特性并且有一套自身的解毒机制。本研究从常年被重金属污染的矿区选择优势生长植物的根际土中筛选具有促生性能的菌株，实验的初筛结果显示，22株筛选出来的细菌中有10株具有促生性能，但是这10株菌的促生能力有强弱之分。有6株菌可以分泌IAA，ACC脱氨酶，铁载体，同时还具备固氮的能力，促生能力比其他4株菌相对更强一些。它们分别是ZS1、ZS3、ZS4、TS8、MS3、PS3。其中部分菌还具有溶磷解钾能力。从各项促生性能的测定的结果比较下，TS8的促生性能应该是最高的，因此挑选了它进行耐性实验，发现虽然受到了Cd的影响但还是具备了耐重金属性。不过，仅仅依靠这些菌在实验室测验的表现就能判定它具有优异的促生能力是远远不够的。因为将菌株接种到实际土壤中，植物的生长不止受菌株的影响，环境中还会有另外成分的干预，利用PGPR与植物一起修复重金属土壤的情况则更为复杂。所以，PGPR在实际中的促生成效才是促生能力的判断依据。在接下来的盆栽试验，要更加关注菌株对植物的实际促生效果。而且，如果将PGPR投入生产，不同的菌株对相同植物或者不同植物的促生效果是否相同也是一个值得研究的问题。因为PGPR主要的菌属如假单胞菌属(Pseudomonas)、布克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、芽孢杆菌属(Bacillus)等，也是植物常见病原菌较为集中的几类菌属[32]。这些菌在实际作用于作物时，对作物的生长是有好处还是坏处，是由作物的种类和菌的产物浓度决定的。但是哪种作物最匹配哪种菌以及菌株产物的最适浓度是多少还未可知。同样的，具有不同功能的菌是否可以作用于同一种作物，达到彼此最好的促生效果同样值得深思。参考文献[1]郭军康,董明芳,丁永祯等.根际促生菌影响植物吸收和转运重金属的研究进展[J].生态环境学报,2015(07):140-146.[2]彭云霄.根际促生细菌提高植物抗重金属能力的研究进展[J].云南化工，201946(02):42-44.[3]韦革宏,马占强.根瘤菌-豆科植物共生体系在重金属污染地修复中的地位、应用及潜力[J].微生物学报,2010,50(11):1421-1430.[4]赵英松,江洪,甘国东,史开举,吕涛.湖南花垣和苏仙矿区重金属污染评价及优势植物富集研究[J].贵州工程应用技术学院学报,2015,33(05):146-155.[5]MoCalmontJP,HastingsA,McNamaraNP,etal.EnvironmentalcoatsandbenefitsofgrowingMiscanthusforbioenergyintheUK.GCBBioenergy,2016,Doi:10.1111/gobb.12294.[6]ChungJH,KimDS.MiscanthusasapotenttialbioenergycropinEastAsia.JournalofGropScienceandBiotech-nology,2012,15:65-77.[7]EckertB,WeberOB,KirchhofG,etal.Azospirillumdoebereineraesp.nov,anitrogen-fixingbacteriumassociatedwiththeC-grassMiscanthus.InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMiscrobiology,2001,51:17-26.[8]韦朝阳,陈同斌.高砷区植物的钙化性特征[J].植物生态报,2002,26（6）：695-700.[9]ZhangJ,YangsY,HuangYJetal.ThetoleranceandaccumulationofMiscanthussacchariflorus(Maxim.)Benth.,anenergyplantspeciestocadmium.InternationalJournalofPhytoremediation,2015,17:538-545.[10]胡杨勇,马嘉伟,叶正钱等.东南景天修复重金属污染土壤的研究进展[J].浙江农林大学学报，2014,31(1):136-144.[11]赵雅曼,陈顺钰,李宗勋,李启艳,侯晓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