性激素结合球蛋白基因Asp327Asn多态性与2型糖尿病的相关性研究

性激素结合球蛋白基因Asp327Asn多态性与2型糖尿病的相关性研究摘要目的：研究中国汉族人群性激素结合球蛋白（Sexhormone-bindingglobulin,SHBG）基因Asp327Asn多态性与2型糖尿病（Type2diabetesmellitus,T2DM）发病风险的关系。方法：应用限制性片段长度多态性（Polymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism,PCR-RFLP）方法，对599例重庆及周边地区汉族人群（T2DM患者248例、正常对照351例）Asp327Asn进行基因分型。用稳态模型（Homeostaticmodelassessment,HOMA）评估胰岛素抵抗（HOMA-IR）和胰岛β细胞功能（HOMA-B）。结果：Asn等位基因的分布频率T2DM组低于正常对照组（分别为14.5%、20.1%）；与Asp等位基因携带者相比，Asn等位基因携带者患T2DM的风险显著降低（OR=0.62,95%CI为0.42~0.91,P=0.016）。结论：SHBG基因Asp327Asn位点Asn等位基因可能与低T2DM患病风险相关。关键词单核苷酸多态性；性激素结合球蛋白；2型糖尿病；相关性研究一、引言2型糖尿病（Type2diabetesmellitus,T2DM）是一种常见的代谢性疾病，其发病机制复杂，受遗传和环境等多种因素的综合影响。近年来，随着人们生活方式的改变和老龄化进程的加速，T2DM的发病率在全球范围内呈显著上升趋势，给社会和家庭带来了沉重的负担。深入探究T2DM的遗传易感因素，对于早期预防、精准诊断和个性化治疗具有重要意义。性激素结合球蛋白（Sexhormone-bindingglobulin,SHBG）是一种主要由肝脏合成和分泌的糖蛋白，在人体多个组织如睾丸、脑、卵巢、胎盘、子宫内膜和乳腺癌组织中也有基因表达。传统理论认为，SHBG主要作用是结合循环中的类固醇激素，特别是雄激素和雌激素，通过调节性激素的生物可利用度在体内发挥重要的生物学效应。大量研究表明，性激素代谢失衡与T2DM的发生发展密切相关。例如，雄激素和雌激素可通过多种途径影响胰岛素的敏感性、胰岛β细胞的功能以及糖代谢相关基因的表达。而SHBG作为性激素的重要载体蛋白，其水平或功能的改变可能间接影响T2DM的发病风险。在SHBG基因中，Asp327Asn位点存在单核苷酸多态性，该位点的碱基变异可能导致SHBG的结构和功能发生改变，进而影响其对性激素的结合能力及后续生物学效应，最终影响T2DM的发病风险。然而，目前关于SHBG基因Asp327Asn多态性与中国汉族人群T2DM发病风险之间关系的研究尚存在争议，相关机制也有待进一步明确。因此，本研究旨在探讨中国汉族人群中SHBG基因Asp327Asn多态性与T2DM发病风险的关系，为T2DM的遗传病因学研究提供新的线索和理论依据。二、对象与方法2.1研究对象选取2010年1月至2011年6月期间，在重庆医科大学附属第一医院内分泌科就诊的248例T2DM患者作为病例组。所有患者均符合1999年世界卫生组织（WHO）制定的T2DM诊断标准：即空腹血糖≥7.0mmol/L，或餐后2小时血糖≥11.1mmol/L，或有典型糖尿病症状且随机血糖≥11.1mmol/L。排除标准为：1型糖尿病、妊娠糖尿病、特殊类型糖尿病；患有严重的心、肝、肾等重要脏器功能障碍；近3个月内使用过影响糖代谢或性激素水平的药物；患有恶性肿瘤、自身免疫性疾病等其他严重疾病。同时，选取同期在我院进行健康体检的351例汉族人群作为正常对照组。纳入标准为：空腹血糖<6.1mmol/L，餐后2小时血糖<7.8mmol/L，且无糖尿病家族史。排除标准同病例组。所有研究对象均为重庆及周边地区的汉族常住居民，年龄在18-70岁之间，且签署了知情同意书。2.2研究方法2.2.1标本采集所有研究对象均于清晨空腹状态下抽取静脉血5ml，其中2ml置于含有乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝剂的试管中，用于基因组DNA的提取；另外3ml置于普通试管中，3000r/min离心10min，分离血清，用于检测空腹血糖（Fastingbloodglucose,FBG）、空腹胰岛素（Fastinginsulin,FINS）、总胆固醇（Totalcholesterol,TC）、甘油三酯（Triglyceride,TG）、高密度脂蛋白胆固醇（Highdensitylipoproteincholesterol,HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（Lowdensitylipoproteincholesterol,LDL-C）、性激素结合球蛋白（SHBG）等生化指标。2.2.2DNA提取采用酚-氯仿法提取外周血白细胞基因组DNA。具体步骤如下：将EDTA抗凝全血与红细胞裂解液按1:5的比例混合，颠倒混匀，室温静置10min，使红细胞充分裂解。4000r/min离心10min，弃上清，收集白细胞沉淀。向白细胞沉淀中加入细胞核裂解液和蛋白酶K，55℃水浴消化过夜。次日，加入等体积的饱和酚，轻轻颠倒混匀10min，4000r/min离心10min，将上层水相转移至新的离心管中。重复酚抽提一次，然后加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1）混合液，颠倒混匀10min，4000r/min离心10min，再次将上层水相转移至新管。加入1/10体积的3mol/L醋酸钠（pH5.2）和2倍体积的无水乙醇，轻轻颠倒混匀，可见白色絮状DNA沉淀析出。12000r/min离心10min，弃上清，用75%乙醇洗涤DNA沉淀2次，室温晾干后，加入适量的TE缓冲液溶解DNA，-20℃保存备用。2.2.3SHBG基因Asp327Asn多态性检测采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（Polymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism,PCR-RFLP）技术对SHBG基因Asp327Asn位点进行基因分型。根据GenBank中SHBG基因序列（登录号：NM_000343），使用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物。上游引物：5'-CTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'，下游引物：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'，扩增片段长度为250bp。PCR反应体系为25μl，包括10×PCR缓冲液2.5μl，2.5mmol/LdNTPs2μl，上下游引物各0.5μl（10μmol/L），TaqDNA聚合酶0.2μl（5U/μl），模板DNA1μl（约50ng），用双蒸水补足至25μl。PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下观察扩增条带是否清晰、特异。取5μlPCR产物，加入10U的限制性内切酶NcoI，37℃水浴酶切过夜。酶切产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭（EB）染色，在凝胶成像系统下观察结果并拍照。根据酶切片段长度判断基因型：若出现250bp单一未酶切条带，为纯合野生型（Asp/Asp）；若出现190bp和60bp两条酶切条带，为纯合突变型（Asn/Asn）；若同时出现250bp、190bp和60bp三条条带，则为杂合突变型（Asp/Asn）。为确保基因分型结果的准确性，随机选取10%的样本进行重复检测，并由两位独立的研究者分别对结果进行判读，不一致的结果经重新检测后确定。2.2.4生化指标检测采用全自动生化分析仪（Hitachi7600）检测血清FBG、TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。其中，FBG采用葡萄糖氧化酶法测定，TC采用胆固醇氧化酶法测定，TG采用甘油磷酸氧化酶法测定，HDL-C和LDL-C采用直接法测定。血清FINS水平采用化学发光免疫分析法测定，试剂盒购自罗氏诊断产品（上海）有限公司。血清SHBG水平采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定，试剂盒购自美国R&DSystems公司，操作严格按照试剂盒说明书进行。2.2.5胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能评估采用稳态模型评估法（Homeostaticmodelassessment,HOMA）计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）和胰岛β细胞功能指数（HOMA-β）。计算公式如下：HOMA-IR=FBG（mmol/L）×FINS（mU/L）/22.5；HOMA-β=20×FINS（mU/L）/[FBG（mmol/L）-3.5]。2.3统计学分析采用SPSS17.0统计软件对数据进行分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验；计数资料以例数和百分比（%）表示，组间比较采用χ²检验。Hardy-Weinberg平衡检验用于判断研究对象群体是否具有代表性。采用非条件logistic回归模型分析SHBG基因Asp327Asn多态性与T2DM发病风险的关系，计算比值比（Oddsratio,OR）及其95%置信区间（Confidenceinterval,CI），并对年龄、性别、BMI、血压、血脂等可能的混杂因素进行校正。以P<0.05为差异有统计学意义。三、研究结果3.1研究对象的一般临床资料病例组和对照组在年龄、性别构成上差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。与对照组相比，病例组的BMI、FBG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C水平显著升高（P<0.01），而HDL-C和SHBG水平显著降低（P<0.01）。具体数据见表1。指标病例组（n=248）对照组（n=351）t/χ²P年龄（岁）52.3±10.550.8±9.81.7840.075性别（男/女，例）136/112185/1660.1470.701BMI（kg/m²）26.5±3.223.8±2.510.432<0.001FBG（mmol/L）9.6±2.15.1±0.632.741<0.001FINS（mU/L）15.8±5.68.2±3.118.752<0.001HOMA-IR3.5±1.21.5±0.622.347<0.001HOMA-β68.5±25.692.4±30.5-8.563<0.001TC（mmol/L）5.8±1.04.9±0.811.325<0.001TG（mmol/L）2.2±0.81.4±0.613.576<0.001HDL-C（mmol/L）1.0±0.21.3±0.3-13.641<0.001LDL-C（mmol/L）3.6±0.92.8±0.711.894<0.001SHBG（nmol/L）20.5±8.635.2±12.3-16.345<0.0013.2SHBG基因Asp327Asn多态性分布对照组中，Asp/Asp、Asp/Asn、Asn/Asn基因型频率分别为63.0%、30.5%、6.5%，Asn等位基因频率为20.1%；病例组中，Asp/Asp、Asp/Asn、Asn/Asn基因型频率分别为74.6%、23.4%、2.0%，Asn等位基因频率为14.5%。经Hardy-Weinberg平衡检验，对照组和病例组的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05），表明研究对象群体具有代表性。两组间基因型分布和等位基因频率差异有统计学意义（χ²=9.254，P=0.010；χ²=6.025，P=0.014）。具体数据见表2。基因型/等位基因病例组（n=248）对照组（n=351）χ²PAsp/Asp（例，%）185（74.6）221（63.0）--Asp/Asn（例，%）58（23.4）107（30.5）9.2540.010Asn/Asn（例，%）5（2.0）23（6.5）--Asn等位基因频率（%）14.520.16.0250.0143.3SHBG基因Asp327Asn多态性与T2DM发病风险的关系以Asp/Asp基因型为参照，非条件logistic回归分析结果显示，校正年龄、性别、BMI、血压、血脂等混杂因素后，Asp/Asn基因型携带者患T2DM的风险与Asp/Asp基因型携带者相比无显著差异（OR=1.18，95%CI：0.82-1.70，P=0.374）；Asn/Asn基因型携带者患T2DM的风险显著降低（OR=0.32，95%CI：0.12-0.85，P=0.023）。进一步将Asn等位基因携带者（Asp/Asn+Asn/Asn）与Asp等位基因携带者（Asp/Asp）进行比较，发现Asn等位基因携带者患T2DM的风险显著降低（OR=0.62，95%CI：0.42-