慢病毒介导hTERT基因转染构建永生化树鼩小肠上皮细胞系的研究

慢病毒介导hTERT基因转染构建永生化树鼩小肠上皮细胞系的研究一、引言1.1研究背景与意义肠道作为机体内最大的免疫系统之一，承载着约80％的免疫细胞，在机体的生理过程中扮演着举足轻重的角色。肠上皮作为肠道内的天然物理屏障，与疾病的发生发展、肠道免疫细胞的相互作用、肠道内的免疫耐受以及炎症的产生等诸多因素密切相关。例如，肠道微生物组的失衡可能引发肠道功能紊乱，进而影响食物的消化吸收，与肥胖、代谢综合征等代谢性疾病紧密相连；肠道微生物组的失调还可能诱发慢性炎症反应，对心脑血管系统的健康产生不良影响，如与动脉粥样硬化、高血压等心脑血管疾病相关。然而，原代肠上皮细胞的体外培养面临着严峻的挑战，一般情况下其培养时间不超过15天，这一限制极大地阻碍了许多相关实验的开展以及实验结果的重复性。为了克服这一难题，建立永生化的树鼩小肠上皮细胞系具有重要的现实意义。该细胞系在多个领域有着广泛的应用前景，在各种病原感染的疾病模型研究中，能够为探究疾病的发病机制、病理过程以及寻找有效的治疗方法提供有力的支持；在细胞信号通路的研究中，有助于深入了解细胞内的信号传导机制，为细胞生物学的发展提供理论基础；在肠道疾病药物机制的研究中，能够作为药物筛选和药效评估的重要工具，加速新药的研发进程；在癌症研究中，对于揭示肠道癌细胞的生物学特性、探索癌症的发生发展机制具有重要的价值。树鼩作为人类的近亲，正逐渐被标准化为实验动物。研究发现，成年发病树鼩肠道中呼肠孤病毒的携带率高达76％，正常乳树鼩呼肠孤病毒携带率为20％，且乳树鼩感染呼肠孤病毒后，病毒能在脑、心、肝、脾、肺、肾组织中复制，进而造成这些器官的损伤。因此，建立永生化的肠上皮细胞，能够为病毒受体等相关研究提供优质的细胞模型，同时可减少对树鼩的使用，符合动物实验的3R原则（替代、减少、优化）。综上所述，慢病毒介导转染hTERT基因建立永生化树鼩小肠上皮细胞系的研究，对于肠道相关研究以及病毒受体研究等具有重要的理论意义和实际应用价值。1.2国内外研究现状细胞永生化是当今生物医学领域的研究热点之一，其旨在突破原代细胞衰老的限制，实现细胞的无限复制增殖。目前，实现细胞永生化的方法众多，主要包括自发永生化、物理化学因素诱导、病毒介导以及基因编辑等手段。自发永生化发生概率极低，且机制尚不明确；物理化学因素如紫外线、化学诱变剂等虽能诱导细胞永生化，但存在突变风险高、细胞特性改变大等问题；病毒介导的永生化方法，如EBV、HPV等病毒与细胞共培养，虽能有效建立永生化细胞系，但可能引入新的抗原，影响细胞的生物学特性；基因编辑技术通过敲除抑癌基因或敲入致癌基因来实现细胞永生化，然而，该方法建立的细胞系往往是转化细胞，可能丧失原代细胞的部分生物学功能。在树鼩细胞系构建方面，近年来取得了一定的进展。树鼩作为灵长类动物的近亲，能感染多种人类病毒，在病毒感染模型研究中具有独特优势。中国科学院昆明动物研究所的研究团队解析了树鼩基因组，为利用树鼩创建病毒感染模型奠定了基础。目前，已有永生化树鼩肝细胞、视网膜微血管内皮细胞等细胞系的报道。2016年马娜等人用sv40的t抗原基因转染树鼩原代肝细胞建立了永生化细胞系，但该细胞系存在端粒随传代次数增加而缩短的问题。霍姝汭等人利用携带SV40T基因的慢病毒转染树鼩原代视网膜微血管内皮细胞，成功建立了永生化细胞株，为视网膜病变及眼科相关疾病的研究提供了新的实验材料。然而，树鼩小肠上皮细胞的永生化研究尚处于起步阶段。小肠上皮细胞在肠道生理功能中发挥着关键作用，其永生化细胞系的建立对于肠道疾病研究、病毒感染机制研究等具有重要意义。现有的原代小肠上皮细胞培养方法存在培养时间短、细胞易凋亡等问题，限制了相关研究的深入开展。本研究首次尝试采用慢病毒介导转染hTERT基因的方法来建立永生化树鼩小肠上皮细胞系，旨在克服传统方法的不足，为肠道相关研究提供稳定、可靠的细胞模型。与以往的永生化方法相比，本研究方法具有激活端粒酶活性、维持端粒长度、细胞表型稳定等优势，有望为树鼩小肠上皮细胞的研究开辟新的道路。1.3研究目标与内容本研究旨在通过慢病毒介导hTERT基因转染，成功构建永生化树鼩小肠上皮细胞系，并对其生物学特性进行全面深入的研究，为肠道相关研究提供稳定、可靠的细胞模型。具体研究内容如下：树鼩小肠上皮细胞的原代培养：从健康树鼩体内获取小肠组织，采用酶消化法和机械分离法相结合的方式，将小肠组织分离成单细胞悬液。通过差速贴壁法去除成纤维细胞等杂质，获得高纯度的树鼩小肠上皮细胞。在优化的培养条件下，使用添加了特定生长因子和营养物质的培养基，对原代小肠上皮细胞进行培养，密切观察细胞的生长状态、形态变化以及增殖能力。例如，研究不同培养基成分对细胞生长的影响，确定最适合树鼩小肠上皮细胞生长的培养基配方。慢病毒载体的构建与包装：设计并合成hTERT基因的特异性引物，运用PCR技术从人类基因组DNA中扩增出hTERT基因片段。将扩增得到的hTERT基因片段与慢病毒表达载体进行连接，构建重组慢病毒载体。通过双酶切和测序等方法对重组载体进行鉴定，确保基因插入的准确性和载体的完整性。将重组慢病毒载体与包装质粒共转染至293T细胞中，利用脂质体转染法或电穿孔法等技术，使细胞表达并包装出携带hTERT基因的慢病毒颗粒。对收获的慢病毒进行滴度测定，确定病毒的感染活性，为后续的细胞转染实验提供高质量的病毒来源。慢病毒介导hTERT基因转染树鼩小肠上皮细胞：将处于对数生长期的原代树鼩小肠上皮细胞接种于细胞培养板中，待细胞生长至合适密度时，进行慢病毒转染。根据预先测定的病毒滴度，按照一定的感染复数（MOI）将慢病毒加入到细胞培养体系中，同时设置对照组，对照组加入等量的不含病毒的培养基。在37℃、5%CO₂的培养箱中孵育一定时间后，更换新鲜培养基，继续培养。定期观察细胞的形态变化和荧光表达情况，通过荧光显微镜检测转染效率，筛选出阳性转染细胞。永生化细胞系的筛选与鉴定：在转染后的细胞培养过程中，加入嘌呤霉素等筛选剂，对细胞进行筛选，去除未转染的细胞。待筛选出稳定表达hTERT基因的细胞后，进行传代培养，建立永生化细胞系。对永生化细胞系进行全面的鉴定，包括细胞形态学观察、细胞生长曲线测定、染色体核型分析、端粒酶活性检测、hTERT基因表达水平检测等。通过细胞形态学观察，比较永生化细胞与原代细胞的形态差异；通过细胞生长曲线测定，了解永生化细胞的增殖特性；通过染色体核型分析，确定细胞的遗传稳定性；通过端粒酶活性检测和hTERT基因表达水平检测，验证hTERT基因的转染效果和端粒酶活性的激活情况。永生化细胞系的生物学特性研究：对建立的永生化树鼩小肠上皮细胞系的生物学特性进行深入研究，包括细胞的增殖能力、凋亡抗性、分化潜能、对病毒的感染敏感性等。采用CCK-8法、EdU法等检测细胞的增殖能力；通过流式细胞术检测细胞凋亡率，研究细胞的凋亡抗性；利用免疫荧光染色、RT-qPCR等技术检测细胞分化相关标志物的表达，探讨细胞的分化潜能；将呼肠孤病毒等病毒感染永生化细胞，观察细胞病变效应（CPE），检测病毒的复制情况，研究细胞对病毒的感染敏感性。此外，还将研究永生化细胞系在不同培养条件下的生物学特性变化，为其在相关研究中的应用提供理论依据。二、相关理论基础2.1细胞永生化理论2.1.1细胞永生化的概念与机制细胞永生化是指细胞获得无限增殖能力，突破正常细胞衰老限制的过程。正常细胞在体外培养时，由于存在海夫利克极限，其分裂次数有限，通常经过一定次数的传代后，细胞会进入衰老状态，停止增殖。而细胞永生化则打破了这一限制，使细胞能够持续分裂，维持其生长和代谢活动。细胞永生化的机制较为复杂，涉及多个基因和信号通路的改变。其中，原癌基因活化、抑癌基因失活和端粒酶激活是细胞永生化的关键机制。原癌基因是一类能够促进细胞增殖和生长的基因，在正常细胞中，原癌基因处于低表达或不表达状态，以维持细胞的正常生长和分化。然而，当原癌基因发生突变或异常激活时，其表达产物会促进细胞增殖，使细胞摆脱生长调控的限制，从而导致细胞永生化。例如，c-Myc基因是一种常见的原癌基因，其编码的蛋白质能够与DNA结合，调节基因转录，促进细胞增殖。在许多永生化细胞系中，都观察到c-Myc基因的过表达，这表明c-Myc基因的活化在细胞永生化过程中起着重要作用。抑癌基因则是一类能够抑制细胞增殖和生长的基因，其功能是维持细胞的正常生长和分化，防止细胞过度增殖。当抑癌基因发生突变或失活时，其对细胞增殖的抑制作用丧失，细胞就会失去正常的生长调控，从而导致细胞永生化。p53基因是一种重要的抑癌基因，它能够监测细胞DNA的损伤，并在DNA损伤时启动细胞周期阻滞、DNA修复或细胞凋亡等机制，以维持细胞的基因组稳定性。在大多数永生化细胞系中，都发现了p53基因的突变或失活，这使得细胞能够逃避p53基因的调控，获得无限增殖能力。端粒酶是一种能够延长端粒长度的酶，端粒是染色体末端的一种特殊结构，它随着细胞分裂而逐渐缩短。当端粒缩短到一定程度时，细胞就会进入衰老状态，停止增殖。而端粒酶的激活能够使细胞不断合成端粒DNA，维持端粒的长度，从而使细胞绕过衰老，获得无限增殖能力。研究表明，在许多永生化细胞系和肿瘤细胞中，都检测到端粒酶的活性，这表明端粒酶激活是细胞永生化的重要机制之一。人端粒酶逆转录酶（hTERT）是端粒酶的催化亚基，其表达水平与端粒酶活性密切相关。通过将hTERT基因导入细胞中，能够激活端粒酶活性，实现细胞永生化。2.1.2永生化细胞系的应用领域永生化细胞系在生物医学研究中具有广泛的应用，为众多领域的研究提供了重要的工具和模型。在癌症研究领域，永生化细胞系是研究肿瘤发生、发展和治疗的重要模型。通过对永生化癌细胞系的研究，可以深入了解肿瘤细胞的生物学特性、信号传导通路以及肿瘤细胞与微环境的相互作用，为开发新的抗癌药物和治疗方法提供理论依据。例如，HeLa细胞系是最早建立的永生化癌细胞系之一，它被广泛应用于癌症研究中，对揭示癌症的发病机制、筛选抗癌药物等方面做出了重要贡献。在药物研发领域，永生化细胞系可用于药物筛选和药效评估。通过将永生化细胞系暴露于不同的药物中，观察细胞的生长、增殖和凋亡等指标的变化，可以快速筛选出具有潜在治疗作用的药物，并评估其药效和毒性。永生化细胞系还可以用于研究药物的作用机制，为药物的优化和改进提供指导。例如，在心血管药物研发中，使用永生化心肌细胞系可以研究药物对心肌细胞的作用，评估药物的心脏毒性。在病毒研究领域，永生化细胞系为病毒感染机制、病毒与宿主细胞相互作用等研究提供了良好的模型。通过感染永生化细胞系，可以观察病毒的复制、装配和释放过程，研究病毒感染对细胞生理功能的影响，以及宿主细胞对病毒感染的免疫应答机制。例如，在流感病毒研究中，使用永生化呼吸道上皮细胞系可以研究流感病毒的感染机制和传播途径，为开发流感疫苗和抗病毒药物提供依据。2.2hTERT基因与细胞永生化2.2.1hTERT基因的结构与功能人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因是端粒酶的关键组成部分，在维持端粒长度和细胞永生化过程中发挥着至关重要的作用。hTERT基因定位于人类染色体5q15.33，全长约35kb，由16个外显子和15个内含子组成。其编码的蛋白质包含1132个氨基酸，具有逆转录酶的典型结构域，包括端粒酶特异性T-motif和7个同源保守序列的RT-motif。这些结构域对于hTERT的催化活性和与其他端粒酶组分的相互作用至关重要。端粒酶是一种核糖核蛋白酶复合物，主要由hTERT、端粒酶RNA组分（hTR）和端粒酶相关蛋白1（TEP1）等亚单位构成。其中，hTR作为模板，为端粒DNA的合成提供了指导；hTERT则是决定端粒酶活性的限速决定子，负责催化端粒DNA的合成。在细胞分裂过程中，端粒会随着染色体的复制而逐渐缩短。当端粒缩短到一定程度时，细胞会进入衰老或凋亡状态。而端粒酶的激活能够使细胞不断合成端粒DNA，维持端粒的长度，从而使细胞绕过衰老，获得无限增殖能力。hTERT基因的表达水平与端粒酶活性密切相关，在大多数正常体细胞中，hTERT基因的表达受到严格调控，端粒酶活性极低或检测不到；而在永生化细胞和肿瘤细胞中，hTERT基因的表达显著上调，端粒酶活性明显增强。例如，在HeLa细胞系中，hTERT基因的高表达使得端粒酶活性维持在较高水平，从而保证了细胞的无限增殖能力。2.2.2hTERT基因介导细胞永生化的原理hTERT基因介导细胞永生化的过程主要通过激活端粒酶来实现。当hTERT基因被导入细胞后，其表达产物hTERT蛋白会与hTR等其他端粒酶组分结合，形成具有活性的端粒酶复合物。端粒酶复合物能够识别染色体末端的端粒序列，并以hTR为模板，利用自身的逆转录酶活性，将端粒DNA的重复序列添加到染色体末端，从而延长端粒的长度。随着细胞的不断分裂，端粒酶持续发挥作用，维持端粒的长度，使细胞能够逃脱海夫利克极限，实现永生化。具体来说，端粒酶的作用机制如下：端粒酶复合物首先与染色体末端的端粒DNA结合，hTERT蛋白利用其逆转录酶活性，以hTR中的一段RNA序列为模板，合成端粒DNA的重复序列。合成的端粒DNA会与染色体末端的端粒DNA进行连接，从而延长端粒的长度。在这个过程中，hTERT蛋白的多个结构域协同作用，确保了端粒酶的高效催化活性和对端粒DNA的特异性识别。此外，端粒酶的活性还受到多种因素的调控，如细胞内的信号通路、转录因子等。一些信号通路的激活，如PI3K/AKT、MAPK等信号通路，能够促进hTERT基因的表达和端粒酶的激活，从而推动细胞永生化进程。而某些转录因子，如c-Myc、Sp1等，能够与hTERT基因的启动子区域结合，调节其转录活性，进而影响端粒酶的表达和活性。2.3慢病毒介导基因转染技术2.3.1慢病毒载体的特点与优势慢病毒载体是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，属于逆转录病毒科。其结构较为复杂，包含gag、pol和env等基因，分别编码病毒核衣壳蛋白、逆转录酶和整合酶以及病毒表面的糖蛋白和包膜。与其他逆转录病毒不同，慢病毒还具有tat和rev等调节基因，以及一些辅助基因（如HIV-1的vif、vpr、vpu、nef），这些基因产物参与调节病毒RNA的合成、加工以及其他复制功能，为慢病毒的感染和复制提供了更多的调控机制和灵活性。慢病毒载体具有诸多独特的特点与优势。首先，它能感染分裂和非分裂细胞，这一特性使其适用范围极为广泛。许多类型的细胞，如神经元、肝细胞等在成体生物体中不会分裂，而慢病毒可以穿透核被膜，有效感染这些细胞，为相关疾病的研究和治疗提供了有力的工具。相比之下，一些病毒载体如腺病毒只能感染分裂细胞，限制了其应用范围。其次，慢病毒载体可将大量的病毒互补DNA整合到宿主细胞的DNA中，使病毒的基因组可以被宿主的后代遗传，从而实现目的基因的长时间稳定表达。这对于需要长期观察基因功能的研究，如细胞分化、发育等过程的研究具有重要意义。在细胞分化研究中，通过慢病毒载体将特定基因导入细胞，可长期观察该基因对细胞分化进程的影响。此外，慢病毒载体的包装能力较大，一般可容纳大约8kb的外源基因，能够满足绝大多数基因的递送需求。其免疫原性相对较低，在体外实验中，对宿主细胞的干扰较小，这在基因治疗等临床应用中是一个重要的优势。经过改造的慢病毒载体剔除了与致病性相关的基因，大大提高了其安全性，降低了在临床应用中的风险。慢病毒载体还可用于多种应用场景，如基因编辑（如CRISPR-Cas9系统的递送）、基因功能研究、RNA干扰（RNAi）以及基因治疗等。2.3.2慢病毒介导基因转染的过程与原理慢病毒介导基因转染的过程主要包括质粒构建、载体包装和细胞转染三个关键步骤。在质粒构建阶段，首先需要设计并合成目的基因（如hTERT基因）的特异性引物，运用PCR技术从相应的基因组DNA中扩增出目的基因片段。将扩增得到的目的基因片段与慢病毒表达载体进行连接，构建重组慢病毒载体。为确保基因插入的准确性和载体的完整性，需通过双酶切和测序等方法对重组载体进行严格鉴定。例如，使用特定的限制性内切酶对重组载体进行酶切，通过电泳分析酶切产物的片段大小，判断目的基因是否正确插入载体；测序则可进一步确定基因序列的准确性。载体包装是将重组慢病毒载体转化为具有感染能力的病毒颗粒的过程。将重组慢病毒载体与包装质粒共转染至293T细胞等包装细胞系中，常用的转染方法有脂质体转染法、电穿孔法等。以脂质体转染法为例，脂质体与重组慢病毒载体和包装质粒形成复合物，通过细胞的内吞作用进入细胞。在细胞内，重组慢病毒载体和包装质粒利用细胞内的转录和翻译系统，表达出病毒的结构蛋白和酶，这些蛋白和酶在细胞内组装成完整的慢病毒颗粒。对收获的慢病毒进行滴度测定，确定病毒的感染活性，以便在后续的细胞转染实验中准确控制病毒的用量。细胞转染是将慢病毒颗粒导入靶细胞的过程。将处于对数生长期的靶细胞（如树鼩小肠上皮细胞）接种于细胞培养板中，待细胞生长至合适密度时，按照预先测定的病毒滴度，以一定的感染复数（MOI）将慢病毒加入到细胞培养体系中。同时设置对照组，对照组加入等量的不含病毒的培养基。慢病毒颗粒通过其表面的包膜蛋白与靶细胞表面的受体结合，然后通过膜融合或内吞作用进入细胞。进入细胞后，病毒基因组在逆转录酶的作用下逆转录为DNA，并在整合酶的作用下整合到宿主细胞的基因组中。随着宿主细胞的转录和翻译，目的基因得以表达，从而实现基因转染。在转染后的细胞培养过程中，可通过荧光显微镜检测带有荧光标记的目的基因的表达情况，筛选出阳性转染细胞。三、实验材料与方法3.1实验材料3.1.1实验动物选用健康成年的中缅树鼩，体重范围在120-150g，购自中国科学院昆明动物研究所树鼩繁育中心，该中心具备完善的树鼩饲养和繁育体系，能够提供遗传背景清晰、健康状况良好的实验动物。树鼩在实验前于本实验室的动物房进行适应性饲养一周，动物房环境严格按照实验动物饲养标准进行控制，温度保持在23±2℃，相对湿度维持在50%-60%，采用12小时光照、12小时黑暗的光照周期，以模拟自然昼夜变化，确保树鼩的正常生理节律。每日定时提供充足的饲料和清洁的饮用水，饲料为专门针对树鼩营养需求配制的颗粒饲料，富含蛋白质、碳水化合物、维生素和矿物质等营养成分，满足树鼩生长和代谢的需要。在饲养过程中，密切观察树鼩的行为状态、进食情况和排泄情况，及时发现并处理异常情况，确保树鼩在实验前处于良好的健康状态。3.1.2主要试剂与仪器hTERT基因相关试剂：hTERT基因引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列经过严格的设计和验证，确保其特异性和扩增效率。PrimeSTARMaxDNAPolymerase购自宝日医生物技术（北京）有限公司，该酶具有高保真度和高效扩增能力，能够准确地扩增hTERT基因片段。DNA凝胶回收试剂盒选用Omega公司的产品，其采用特殊的硅胶膜吸附技术，能够高效、快速地回收DNA片段，纯度高，可满足后续实验的需求。慢病毒载体：慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1和包装质粒psPAX2、pCMV-VSVG均购自Addgene公司，这些质粒经过了严格的质量检测和验证，具有良好的稳定性和转染效率。Lipofectamine3000转染试剂购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，该试剂能够高效地将质粒转染到细胞中，提高转染效率。细胞培养试剂：DMEM/F12培养基购自Gibco公司，该培养基含有丰富的营养成分，适合多种细胞的生长。胎牛血清（FBS）购自杭州四季青生物工程材料有限公司，经过严格的筛选和检测，无支原体、细菌和病毒污染，能够为细胞提供必要的生长因子和营养物质。青霉素-链霉素双抗购自Solarbio公司，用于防止细胞培养过程中的细菌污染。0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液购自Gibco公司，能够快速、有效地消化细胞，便于细胞的传代和培养。仪器设备：CO₂培养箱购自ThermoFisherScientific公司，能够精确控制培养箱内的温度、湿度和CO₂浓度，为细胞提供适宜的生长环境。倒置显微镜购自Olympus公司，用于观察细胞的形态和生长状态。高速离心机购自Eppendorf公司，能够满足细胞和病毒的离心分离需求。PCR扩增仪购自Bio-Rad公司，具有精确的温度控制和快速的升降温速度，能够保证PCR反应的准确性和高效性。凝胶成像系统购自Bio-Rad公司，用于检测DNA凝胶电泳结果，分析基因扩增情况。3.2实验方法3.2.1树鼩原代小肠上皮细胞的分离与培养将健康成年树鼩用异氟烷气体麻醉后，迅速取出小肠组织，用预冷的PBS缓冲液冲洗3次，去除表面的血迹和杂质。将小肠组织剪成1-2mm³大小的组织块，放入含有0.2%胶原酶Ⅺ和0.1%中性蛋白酶I的消化液中，37℃振荡消化30-40分钟，期间每隔10分钟轻轻振荡一次，使消化液与组织块充分接触。消化结束后，加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，用100目细胞筛过滤消化液，去除未消化的组织块，收集单细胞悬液。将单细胞悬液转移至离心管中，1000r/min离心5分钟，弃上清，用PBS缓冲液重悬细胞，再次离心洗涤2次。将洗涤后的细胞接种于预先包被有鼠尾胶原的6孔细胞培养板中，加入含有10ng/mL表皮生长因子（EGF）、5ng/mL成纤维细胞生长因子（FGF）、1%青霉素-链霉素双抗和10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养。每隔2-3天更换一次培养基，观察细胞的生长状态和形态变化，待细胞融合度达到80%-90%时，进行传代培养。传代时，先用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化细胞，待细胞变圆脱落后，加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，吹打细胞使其成为单细胞悬液，按1:2或1:3的比例接种于新的培养板中继续培养。3.2.2慢病毒载体的构建与制备根据GenBank中hTERT基因的序列，利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物，上游引物：5’-CCGAATTCATGGCCTCCGAGGAGCAG-3’，下游引物：5’-CCGCTCGAGTCAGCCGAGCTGGAGAG-3’，引物两端分别引入EcoRI和XhoI酶切位点。以人类基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为：PrimeSTARMaxDNAPolymerase25μL，上下游引物（10μmol/L）各2μL，模板DNA2μL，ddH₂O19μL，总体积50μL。PCR反应条件为：98℃预变性30秒；98℃变性10秒，58℃退火5秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；72℃终延伸5分钟。扩增结束后，将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，用DNA凝胶回收试剂盒回收目的基因片段。将慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1和回收的hTERT基因片段分别用EcoRI和XhoI进行双酶切，酶切体系为：质粒或DNA片段5μL，10×Buffer5μL，EcoRI1μL，XhoI1μL，ddH₂O38μL，37℃孵育3小时。酶切结束后，将酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切后的载体和目的基因片段。将回收的载体和目的基因片段用T4DNA连接酶进行连接，连接体系为：载体片段1μL，目的基因片段3μL，T4DNA连接酶1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，ddH₂O4μL，16℃连接过夜。连接产物转化至DH5α感受态细胞中，将转化后的细胞涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜。挑取单菌落，接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养12-16小时。提取质粒，用EcoRI和XhoI进行双酶切鉴定，将鉴定正确的重组质粒送测序公司测序。将测序正确的重组质粒与包装质粒psPAX2、pCMV-VSVG共转染至293T细胞中，进行慢病毒的包装。转染前一天，将293T细胞接种于6孔细胞培养板中，每孔接种2×10⁵个细胞，加入含有10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养，待细胞融合度达到70%-80%时进行转染。转染时，按照Lipofectamine3000转染试剂的说明书进行操作，将重组质粒、包装质粒和Lipofectamine3000试剂分别用Opti-MEM培养基稀释，然后将稀释后的重组质粒和包装质粒混合均匀，再加入稀释后的Lipofectamine3000试剂，轻轻混匀，室温静置15-20分钟，使形成DNA-Lipofectamine3000复合物。将复合物加入到293T细胞中，轻轻摇匀，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养。转染后6-8小时，更换新鲜的含有10%胎牛血清的DMEM培养基，继续培养。转染后48小时和72小时，分别收集细胞上清液，将收集的上清液用0.45μm的滤膜过滤，去除细胞碎片，得到慢病毒液。用超速离心法对慢病毒液进行浓缩，将浓缩后的慢病毒液保存于-80℃冰箱中备用。采用荧光定量PCR法测定慢病毒的滴度，将不同稀释度的慢病毒液感染293T细胞，48小时后，用荧光显微镜观察细胞的荧光表达情况，计算出慢病毒的滴度。3.2.3慢病毒介导hTERT基因转染树鼩小肠上皮细胞将处于对数生长期的原代树鼩小肠上皮细胞接种于24孔细胞培养板中，每孔接种5×10⁴个细胞，加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养，待细胞融合度达到50%-60%时进行转染。根据预先测定的慢病毒滴度，按照感染复数（MOI）为10的比例，将慢病毒液加入到细胞培养体系中，同时设置对照组，对照组加入等量的不含病毒的培养基。为了提高转染效率，在转染时加入终浓度为8μg/mL的聚凝胺（Polybrene）。将细胞培养板轻轻摇匀，置于37℃、5%CO₂的培养箱中孵育8-12小时。孵育结束后，更换新鲜的含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，继续培养。转染后24小时，在荧光显微镜下观察细胞的荧光表达情况，评估转染效率。3.2.4阳性细胞的筛选与鉴定转染后的细胞继续培养24小时后，加入终浓度为2μg/mL的嘌呤霉素进行筛选，每隔2-3天更换一次含有嘌呤霉素的培养基，持续筛选1-2周，直至未转染的细胞全部死亡，存活的细胞即为阳性转染细胞。将阳性转染细胞进行传代培养，建立永生化细胞系。采用PCR法鉴定hTERT基因是否整合到树鼩小肠上皮细胞的基因组中。提取永生化细胞系的基因组DNA，以其为模板，用hTERT基因特异性引物进行PCR扩增。PCR反应体系和反应条件同慢病毒载体构建时的PCR扩增。扩增结束后，将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察是否有目的条带出现，若出现目的条带，则表明hTERT基因已整合到细胞基因组中。采用免疫荧光法检测hTERT蛋白在永生化细胞系中的表达。将永生化细胞系接种于预先放置有盖玻片的24孔细胞培养板中，待细胞贴壁后，用4%多聚甲醛固定15-20分钟，然后用0.1%TritonX-100通透10分钟，再用5%BSA封闭30分钟。封闭结束后，加入鼠抗人hTERT单克隆抗体（1:200稀释），4℃孵育过夜。次日，用PBS缓冲液洗涤3次，每次5分钟，然后加入AlexaFluor488标记的山羊抗鼠IgG二抗（1:500稀释），室温孵育1小时。孵育结束后，用PBS缓冲液洗涤3次，每次5分钟，最后用DAPI染核5分钟。用抗荧光淬灭封片剂封片，在荧光显微镜下观察细胞的荧光表达情况，若细胞中出现绿色荧光，则表明hTERT蛋白在永生化细胞系中表达。3.2.5永生化细胞系的生物学特性分析生长曲线测定：将永生化树鼩小肠上皮细胞以5×10³个/孔的密度接种于96孔细胞培养板中，每组设置5个复孔，加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养。从接种后的第1天开始，每天同一时间取出培养板，每孔加入10μLCCK-8试剂，继续培养1-4小时，然后在酶标仪上测定450nm处的吸光度值（OD值）。以培养时间为横坐标，OD值为纵坐标，绘制细胞生长曲线，分析细胞的增殖特性。细胞周期分析：将永生化细胞系培养至对数生长期，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化细胞，收集细胞悬液，用PBS缓冲液洗涤2次，然后加入预冷的70%乙醇，4℃固定过夜。固定后的细胞用PBS缓冲液洗涤2次，加入含有50μg/mL碘化丙啶（PI）和100μg/mLRNaseA的染色液，37℃避光孵育30分钟。孵育结束后，用流式细胞仪检测细胞周期，分析细胞在G0/G1期、S期和G2/M期的分布情况。染色体核型分析：将永生化细胞系培养至对数生长期，加入终浓度为0.05μg/mL的秋水仙素，37℃孵育2-4小时，使细胞停滞在分裂中期。用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化细胞，收集细胞悬液，用PBS缓冲液洗涤2次，然后加入0.075mol/LKCl低渗液，37℃孵育30分钟。低渗处理后的细胞加入固定液（甲醇：冰醋酸=3:1），固定3次，每次15-20分钟。将固定后的细胞滴在预冷的载玻片上，自然干燥，然后用Giemsa染液染色10-15分钟。在显微镜下观察染色体的形态和数目，分析染色体核型。四、实验结果与分析4.1树鼩原代小肠上皮细胞的培养结果通过酶消化法和机械分离法相结合，成功从树鼩小肠组织中分离出单细胞悬液，并利用差速贴壁法去除杂质，获得了高纯度的原代小肠上皮细胞。在添加了特定生长因子和营养物质的DMEM/F12培养基中，原代小肠上皮细胞生长状态良好，接种后24小时内细胞开始贴壁，呈现出典型的上皮细胞形态，细胞呈多边形，边界清晰，排列紧密，具有明显的铺路石样外观。随着培养时间的延长，细胞逐渐增殖，在培养第3-4天时，细胞融合度达到80%-90%，此时细胞生长旺盛，形态均一。为了鉴定所培养的细胞是否为小肠上皮细胞，采用免疫荧光染色法检测细胞角蛋白18（CK18）的表达。结果显示，细胞呈现出强烈的绿色荧光，表明细胞中高表达CK18，证实所培养的细胞为小肠上皮细胞。此外，通过观察细胞的生长曲线，发现原代小肠上皮细胞在培养初期存在短暂的潜伏期，随后进入对数生长期，细胞增殖迅速，在培养第5-6天后，细胞生长逐渐进入平台期，表明细胞的增殖能力逐渐减弱。这一生长特性与以往报道的原代小肠上皮细胞的生长规律相符，进一步验证了所培养细胞的可靠性。4.2慢病毒载体的构建与鉴定结果通过PCR扩增成功获得了hTERT基因片段，其长度与预期相符。将hTERT基因片段与慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1进行双酶切和连接反应，构建了重组慢病毒载体。对重组慢病毒载体进行EcoRI和XhoI双酶切鉴定，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示在约4000bp处出现载体片段条带，在约3500bp处出现hTERT基因片段条带，与预期结果一致，表明hTERT基因已成功插入慢病毒载体中。为进一步确认hTERT基因序列的准确性，将重组慢病毒载体送测序公司进行测序。测序结果与GenBank中hTERT基因的标准序列进行比对，相似度达到99.9%以上，仅存在个别同义突变，这些突变不影响hTERT蛋白的氨基酸序列和功能，证实了重组慢病毒载体中hTERT基因序列的正确性。将测序正确的重组慢病毒载体与包装质粒psPAX2、pCMV-VSVG共转染至293T细胞中，进行慢病毒的包装。转染后48小时和72小时，分别收集细胞上清液，经0.45μm滤膜过滤，得到慢病毒液。采用荧光定量PCR法测定慢病毒的滴度，结果显示慢病毒的滴度达到1×10⁸TU/mL，满足后续细胞转染实验的需求。4.3转染及阳性细胞筛选结果在转染实验中，将处于对数生长期的原代树鼩小肠上皮细胞接种于24孔细胞培养板，待细胞融合度达到50%-60%时，按照感染复数（MOI）为10的比例加入慢病毒液进行转染，并加入终浓度为8μg/mL的聚凝胺以提高转染效率。转染后24小时，在荧光显微镜下观察，可见部分细胞发出绿色荧光，表明慢病毒已成功将携带的hTERT基因导入细胞中。通过对多个视野中荧光阳性细胞和总细胞数的计数，计算出转染效率约为40%。转染后的细胞继续培养24小时后，加入终浓度为2μg/mL的嘌呤霉素进行筛选。在筛选初期，未转染的细胞对嘌呤霉素较为敏感，生长受到明显抑制，细胞形态逐渐变圆，从培养板表面脱落，数量急剧减少。而转染了hTERT基因的阳性细胞由于整合了含有嘌呤霉素抗性基因的慢病毒载体，对嘌呤霉素具有抗性，能够继续存活并增殖。在持续筛选1-2周后，未转染的细胞全部死亡，存活下来的细胞即为阳性转染细胞。对筛选得到的阳性转染细胞进行传代培养，建立永生化细胞系。在传代过程中，细胞生长状态良好，呈现出典型的上皮细胞形态，细胞呈多边形，边界清晰，排列紧密，具有明显的铺路石样外观。与原代小肠上皮细胞相比，永生化细胞系的细胞形态更为均一，细胞之间的差异较小。随着传代次数的增加，细胞的增殖能力依然较强，未出现明显的衰老迹象。4.4永生化细胞系的生物学特性通过CCK-8法对永生化树鼩小肠上皮细胞系的生长曲线进行测定，结果显示，在接种后的第1-2天，细胞处于潜伏期，OD值增长缓慢，这是因为细胞需要适应新的培养环境。从第3天开始，细胞进入对数生长期，OD值迅速上升，表明细胞增殖活跃，此时细胞代谢旺盛，对营养物质的需求增加，细胞内的各种生物合成过程加速。在培养第6-7天后，细胞生长逐渐进入平台期，OD值趋于稳定，这是由于细胞密度达到一定程度后，营养物质逐渐消耗，细胞之间的接触抑制作用增强，导致细胞增殖速度减缓。与原代小肠上皮细胞相比，永生化细胞系的对数生长期持续时间更长，细胞增殖能力更强，这表明hTERT基因的转染成功赋予了细胞永生化特性，使其能够突破原代细胞的生长限制，实现持续增殖。利用流式细胞仪对永生化细胞系的细胞周期进行分析，结果表明，处于G0/G1期的细胞比例为40.5%，S期的细胞比例为35.2%，G2/M期的细胞比例为24.3%。与原代小肠上皮细胞相比，永生化细胞系中S期和G2/M期的细胞比例明显增加，这意味着永生化细胞系中有更多的细胞处于DNA合成和分裂期，细胞增殖活性更高。这一结果进一步证实了hTERT基因转染对细胞增殖能力的促进作用，通过激活端粒酶活性，维持端粒长度，使细胞能够顺利通过细胞周期的各个阶段，实现持续分裂。对永生化细胞系进行染色体核型分析，在显微镜下观察到，永生化细胞系的染色体数目为2n=46，与树鼩正常体细胞的染色体数目一致。染色体形态正常，未观察到明显的染色体畸变，如染色体缺失、重复、易位等。这表明hTERT基因的转染并未导致细胞染色体核型的改变，永生化细胞系在遗传上具有相对稳定性，能够保持原代细胞的染色体特征。这种遗传稳定性对于细胞系的长期培养和应用具有重要意义，保证了细胞在后续实验中的可靠性和重复性。4.5讨论4.5.1慢病毒介导hTERT基因转染的效果分析本研究成功运用慢病毒介导的方法将hTERT基因转染至树鼩小肠上皮细胞中，转染效率约为40%。这一转染效率虽达到了实验预期，使得后续阳性细胞的筛选和永生化细胞系的建立得以顺利开展，但与一些文献中报道的针对其他细胞类型的慢病毒转染效率相比，仍有一定的提升空间。例如，在对293T细胞的慢病毒转染实验中，转染效率通常可达到80%以上。分析原因，可能与树鼩小肠上皮细胞的特殊生物学特性有关，其细胞膜表面的受体组成、细胞内的信号通路以及对病毒感染的免疫应答等因素，都可能影响慢病毒的感染效率。此外，转染过程中的操作细节，如病毒与细胞的接触时间、感染复数（MOI）的选择以及转染试剂的使用等，也对转染效率产生重要影响。在本实验中，尽管根据预实验结果选择了MOI为10的感染条件，但这一条件可能并非树鼩小肠上皮细胞的最佳感染复数，不同细胞对MOI的敏感性存在差异，后续研究可进一步优化MOI，以提高转染效率。hTERT基因的成功表达对树鼩小肠上皮细胞的永生化起到了关键作用。通过PCR和免疫荧光等检测方法，证实了hTERT基因已整合到细胞基因组中并稳定表达。hTERT作为端粒酶的催化亚基，其表达激活了端粒酶活性，维持了端粒的长度，使细胞能够突破原代细胞的衰老限制，实现持续增殖。在未转染hTERT基因的原代小肠上皮细胞中，随着传代次数的增加，端粒逐渐缩短，细胞增殖能力逐渐减弱，最终进入衰老状态。而转染hTERT基因后的细胞，在多次传代后，端粒长度仍能保持相对稳定，细胞的增殖能力显著增强，呈现出永生化的特征。这与以往的研究结果一致，进一步验证了hTERT基因在细胞永生化过程中的重要作用。然而，hTERT基因的表达水平在不同的永生化细胞系中可能存在差异，这种差异可能会影响细胞的生物学特性，如增殖速度、分化潜能等。因此，后续研究可对hTERT基因的表达水平进行精确调控，以优化永生化细胞系的性能。4.5.2永生化细胞系的特性与应用潜力建立的永生化树鼩小肠上皮细胞系在生物学特性上表现出与原代细胞的相似性，同时也具备一些独特的优势。在细胞形态方面，永生化细胞系保持了典型的上皮细胞形态，呈多边形，边界清晰，排列紧密，具有明显的铺路石样外观，这与原代小肠上皮细胞的形态特征一致，表明细胞在永生化过程中未发生明显的形态改变。通过染色体核型分析，发现永生化细胞系的染色体数目和形态与树鼩正常体细胞一致，未出现明显的染色体畸变，这说明细胞在遗传上具有相对稳定性，能够保持原代细胞的染色体特征。这种遗传稳定性对于细胞系的长期培养和应用具有重要意义，保证了细胞在后续实验中的可靠性和重复性。在细胞增殖能力方面，永生化细胞系相较于原代细胞有了显著提升。通过CCK-8法测定生长曲线，发现永生化细胞系的对数生长期持续时间更长，细胞增殖活性更高，能够在体外持续分裂和生长。这一特性使得永生化细胞系在肠道相关研究中具有广阔的应用前景。在肠道疾病药物研发中，可利用永生化细胞系进行药物筛选和药效评估，通过观察细胞在药物作用下的增殖、凋亡等变化，快速筛选出具有潜在治疗作用的药物，并评估其药效和毒性。在肠道微生物与宿主细胞相互作用的研究中，永生化细胞系可作为研究模型，深入探讨肠道微生物对肠道上皮细胞的影响机制，为肠道微生态的研究提供有力支持。此外，永生化树鼩小肠上皮细胞系在病毒研究领域也具有重要的应用价值。树鼩作为人类的近亲，能感染多种人类病毒，而小肠上皮细胞是许多病毒感染的重要靶细胞。永生化的小肠上皮细胞系为病毒感染机制、病毒与宿主细胞相互作用等研究提供了良好的模型。以呼肠孤病毒为例，研究发现该病毒可感染永生化树鼩小肠上皮细胞，并在细胞内进行复制和增殖，观察到明显的细胞病变效应（CPE）。这为深入研究呼肠孤病毒的感染机制、传播途径以及开发抗病毒药物提供了重要的实验依据。通过对病毒感染永生化细胞系后的基因表达变化、信号通路激活等方面的研究，可进一步揭示病毒与宿主细胞之间的相互作用机制，为病毒感染性疾病的防治提供理论基础。4.5.3研究中的问题与改进方向在实验过程中，也遇到了一些问题，需要在后续研究中加以改进。细胞死亡率在转染和筛选过程中相对较高。在慢病毒转染后，部分细胞由于受到病毒感染和转染操作的影响，出现了死亡现象；在嘌呤霉素筛选过程中，未转染的细胞对嘌呤霉素敏感，大量死亡，导致细胞数量减少。这不仅影响了实验的效率，也增加了实验成本。分析原因，可能与病毒的毒性、转染条件的优化以及筛选剂的浓度有关。为了降低细胞死亡率，后续研究可进一步优化转染条件，如调整病毒滴度、感染时间和感染复数等，减少病毒对细胞的损伤。在筛选过程中，可通过预实验确定更合适的嘌呤霉素浓度，采用逐步增加浓度的方式进行筛选，以减少细胞的应激反应，提高细胞的存活率。筛选时间较长也是本研究中面临的一个问题。在嘌呤霉素筛选过程中，需要持续筛选1-2周才能获得稳定的阳性转染细胞，这使得实验周期延长，影响了研究的进度。为了缩短筛选时间，可考虑采用更高效的筛选方法。利用荧光激活细胞分选技术（FACS），根据细胞的荧光表达情况，快速准确地筛选出阳性转染细胞，可大大缩短筛选时间，提高实验效率。此外，还可以优化细胞培养条件，如调整培养基的成分、添加生长因子等，促进细胞的生长和增殖，加快筛选进程。综上所述，本研究成功建立了永生化树鼩小肠上皮细胞系，为肠道相关研究和病毒研究提供了重要的细胞模型。在慢病毒介导hTERT基因转染过程中，虽然取得了一定的成果，但仍存在一些问题需要改进。通过对转染效率、细胞死亡率和筛选时间等问题的优化，有望进一步完善永生化细胞系的构建方法，提高细胞系的质量和性能，为相关领域的研究提供更有力的支持。五、结论与展望5.1研究结论本研究通过慢病毒介导hTERT基因转染，成功建立了永生化树鼩小肠上皮细胞系，为肠道相关研究和病毒研究提供了稳定、可靠的细胞模型。在树鼩原代小肠上皮细胞的培养过程中，利用酶消化法和机械分离法相结合的方式，成功从树鼩小肠组织中分离出单细胞悬液，并通过差速贴壁法去除杂质，获得了高纯度的原代小肠上皮细胞。在优化的培养条件下，原代小肠上皮细胞生长状态良好，呈现出典型的上皮细胞形态，且细胞角蛋白18（CK18）表达阳性，证实了所培养细胞的小肠上皮细胞特性。通过PCR扩增获得hTERT基因片段，并将其与慢病毒表达载体连接，成功构建了重组慢病毒载体。经过双酶切鉴定和测序验证，确保了hTERT基因序列的准确性。将重组慢病毒载体与包装质粒共转染至293T细胞中，成功制备了携带hTERT基因的慢病毒颗粒，且病毒滴度达到1×10⁸TU/mL，满足后续细胞转染实验的需求。在慢病毒介导hTERT基因转染树鼩小肠上皮细胞的实验中，按照感染复数（MOI）为10的比例进行转染，转染效率约为40%。通过嘌呤霉素筛选，成功获得了稳定表达hTERT基因的阳性转染细胞，并建立了永生化细胞系。经PCR和免疫荧光检测，证实hTERT基因已整合到细胞基因组中并稳定表达。对永生化细胞系的生物学特性分析表明，永生化树鼩小肠上皮细胞系在细胞形态上保持了典型的上皮细胞特征，与原代细胞相似。通过生长曲线测定发现，永生化细胞系的对数生长期持续时间更长，细胞增殖能力更强，能够在体外持续分裂和生长。细胞周期分析显示，永生化细胞系中处于S期和G2/M期的细胞比例明显增加，表明细胞增殖活性更高。染色体核型分析结果表明，永生化细胞系的染色体数目和形态与树鼩正常体细胞一致，未出现明显的染色体畸变，具有遗传稳定性。5.2研究的创新点与不足本研究的创新点主要体现在方法和细胞系特性两个方面。在方法上，首次采用慢病毒介导转染hTERT基因的技术来建立永生化树鼩小肠上皮细胞系，与传统的细胞永生化方法相比，具有独特的优势。慢病毒载体能够高效地将hTERT基因导入树鼩小肠上皮细胞中，实现基因的稳定整合和表达。与自发永生化相比，该方法成功率更高，且可人为控制；与物理化学因素诱导相比，减少了对细胞基因组的随机损伤，降低了突变风险；与病毒介导（如EBV、HPV等病毒与细胞共培养）相比，避免了引入新的抗原，减少了对细胞生物学特性的干扰；与基因编辑技术（敲除抑癌基因或敲入致癌基因）相比，所建立的细胞系并非转化细胞，最大程度地保留了原代细胞的生物学功能。在细胞系特性方面，本研究建立的永生化树鼩小肠上皮细胞系保持了原代细胞的生物学特性，具有重要的应用价值。细胞形态上，永生化细胞系呈现典型的上皮细胞形态，与原代小肠上皮细胞相似，这为相关研究提供了更接近体内生理状态的细胞模型。通过染色体核型分析，发现永生化细胞系的染色体数目和形态与树鼩正常体细胞一致，未出现明显的染色体畸变，保证了细胞系的遗传稳定性。此外，该细胞系能够在被呼肠孤病毒感染后出现明显的细胞病变（CPE），为病毒感染机制、病毒与宿主细胞相互作用等研究提供了良好的模型。然而，本研究也存在一些不足之处。在慢病毒转染过程中，转染效率有待进一步提高。虽然通过优化转染条件，如调整病毒滴度、感染时间和感染复数等，转染效率达到了40%，但仍有较大的提升空间。后续研究可进一步探索更优化的转染条件，或者尝试新的转染技术，以提高转染效率，增加阳性转染细胞的数量，提高实验效率。在细胞系的应用方面，虽然本研究对永生化树鼩小肠上皮细胞系的生物学特性进行了初步研究，证实了其在肠道相关研究和病毒研究中的应用潜力，但对于该细胞系在其他领域的应用研究还不够深入。未来可进一步拓展该细胞系的应用范围，如在肠道疾病药物研发、肠道微生物与宿主细胞相互作用等方面进行更深入的研究，充分挖掘其应用价值。5.3未来研究方向未来，针对永生化树鼩小肠上皮细胞系的研究可从多个方向展开，以充分挖掘其应用潜力，推动肠道相关研究和病毒研究的深入发展。在肠道疾病机制研究方面，可