成纤维细胞生长因子（FGF）对小鼠全脑缺血再灌注损伤的内质网应激调控机制探究

成纤维细胞生长因子（FGF）对小鼠全脑缺血再灌注损伤的内质网应激调控机制探究一、引言1.1研究背景与意义脑缺血是一种严重威胁人类健康的神经系统疾病，具有高发病率、高致残率和高死亡率的特点。当脑缺血发生后，及时恢复血液供应是挽救脑组织的关键，但恢复血流灌注后，往往会引发一系列复杂的病理生理变化，即脑缺血再灌注损伤（CerebralIschemia-ReperfusionInjury，CIRI）。这种损伤会导致脑组织进一步受损，加重神经功能障碍，严重影响患者的预后和生活质量。据世界卫生组织（WHO）统计，全球每年有大量人口因脑缺血相关疾病而死亡或致残，给家庭和社会带来了沉重的负担。CIRI的发病机制极为复杂，涉及氧化应激、炎症反应、细胞凋亡、钙超载等多个病理过程。其中，内质网应激（EndoplasmicReticulumStress，ERS）近年来被认为在CIRI中发挥着关键作用。内质网作为细胞内蛋白质合成、折叠和运输的重要场所，对维持细胞内环境稳定至关重要。当细胞受到缺血再灌注等应激刺激时，内质网的正常功能会受到干扰，导致未折叠或错误折叠蛋白在内质网腔内大量积累，从而引发内质网应激反应。内质网应激激活未折叠蛋白反应（UnfoldedProteinResponse，UPR），这是细胞为了应对内质网应激而启动的一种自我保护机制。在轻度内质网应激时，UPR通过上调分子伴侣表达、减少蛋白质合成等方式，帮助恢复内质网的正常功能，维持细胞的存活。但当内质网应激过度或持续时间过长时，UPR则会启动细胞凋亡信号通路，导致神经元死亡，加重脑缺血再灌注损伤。成纤维细胞生长因子（FibroblastGrowthFactor，FGF）是一类具有广泛生物学活性的细胞因子家族，在胚胎发育、组织修复、血管生成等生理过程中发挥着重要作用。近年来的研究发现，FGF在神经系统中也具有重要的保护作用，能够促进神经元的存活、增殖和分化，抑制神经元凋亡，对多种神经系统疾病具有潜在的治疗价值。FGF家族成员众多，不同成员在结构和功能上既有相似性，又有特异性。其中，一些FGF成员已被证实能够通过多种信号通路发挥对脑缺血再灌注损伤的保护作用。FGF可以通过激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路，抑制细胞凋亡相关蛋白的表达，从而减少神经元凋亡；还可以通过调节丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，减轻炎症反应和氧化应激损伤。深入研究FGF通过内质网应激信号通路对小鼠全脑缺血再灌注的保护作用机制，具有重要的理论和实践意义。在理论方面，有助于进一步揭示脑缺血再灌注损伤的发病机制，拓展对FGF神经保护作用机制的认识，为神经科学领域的研究提供新的思路和方向。在实践方面，有望为脑缺血相关疾病的治疗提供新的靶点和策略，开发出更有效的治疗药物，提高患者的治疗效果和生活质量，具有潜在的临床应用价值。1.2研究目的与问题提出本研究旨在深入探讨FGF通过内质网应激信号通路对小鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用及其分子机制，为脑缺血相关疾病的治疗提供新的理论依据和潜在治疗靶点。具体而言，研究目的包括以下几个方面：明确FGF对小鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用：通过建立小鼠全脑缺血再灌注模型，观察给予FGF干预后，小鼠神经功能缺损评分、脑梗死体积、脑组织形态学变化等指标的改变，明确FGF对小鼠全脑缺血再灌注损伤是否具有保护作用。揭示内质网应激信号通路在小鼠全脑缺血再灌注损伤中的作用：检测小鼠全脑缺血再灌注模型中内质网应激相关蛋白（如GRP78、CHOP等）的表达变化，以及内质网应激关键信号通路（如PERK、IRE1α、ATF6等通路）的激活情况，探讨内质网应激信号通路在小鼠全脑缺血再灌注损伤发生发展过程中的作用。探究FGF是否通过内质网应激信号通路发挥对小鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用：在给予FGF干预的小鼠全脑缺血再灌注模型中，同时对内质网应激信号通路进行调节（如使用内质网应激抑制剂或激活剂），观察FGF的保护作用是否受到影响。通过检测相关蛋白表达、信号通路激活情况以及神经功能和脑组织损伤指标，明确FGF是否通过内质网应激信号通路发挥对小鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用。确定FGF干预内质网应激信号通路的关键分子靶点：进一步深入研究FGF作用于内质网应激信号通路的具体分子机制，确定FGF干预内质网应激信号通路的关键分子靶点，为开发基于FGF的脑缺血治疗药物提供精准的作用靶点和理论支持。基于以上研究目的，提出以下关键科学问题：FGF如何影响小鼠全脑缺血再灌注损伤后的神经功能和脑组织损伤程度？内质网应激信号通路在小鼠全脑缺血再灌注损伤中如何被激活，其激活对损伤进程有何影响？FGF是否能够调节内质网应激信号通路，从而减轻小鼠全脑缺血再灌注损伤？如果是，其具体的调节机制是什么？FGF作用于内质网应激信号通路的关键分子靶点是什么，如何通过调控这些靶点来增强FGF的神经保护作用？能否基于FGF对内质网应激信号通路的调节机制，开发出有效的脑缺血治疗策略？1.3研究方法与技术路线1.3.1动物实验实验动物选择与分组：选用健康成年雄性C57BL/6小鼠，体重20-25g，购自正规实验动物中心。将小鼠随机分为以下几组：假手术组（Sham组）、脑缺血再灌注组（I/R组）、FGF治疗组（FGF+I/R组）、内质网应激抑制剂+FGF治疗组（ERSi+FGF+I/R组）、内质网应激激活剂+FGF治疗组（ERSa+FGF+I/R组），每组10只小鼠。小鼠全脑缺血再灌注模型的建立：采用四血管阻断法建立小鼠全脑缺血再灌注模型。小鼠经10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3ml/100g体重）后，固定于立体定位仪上。分离双侧颈总动脉和椎动脉，通过电凝双侧椎动脉，然后用动脉夹夹闭双侧颈总动脉，造成全脑缺血。缺血30min后，松开动脉夹恢复血流灌注，实现再灌注。假手术组小鼠仅进行手术操作，但不夹闭动脉。干预措施：在再灌注开始时，FGF治疗组小鼠尾静脉注射FGF溶液（10μg/kg体重）；内质网应激抑制剂+FGF治疗组小鼠先腹腔注射内质网应激抑制剂4-苯基丁酸（4-PBA，50mg/kg体重），30min后尾静脉注射FGF溶液；内质网应激激活剂+FGF治疗组小鼠先腹腔注射内质网应激激活剂毒胡萝卜素（TG，0.1mg/kg体重），30min后尾静脉注射FGF溶液。Sham组和I/R组小鼠给予等量生理盐水尾静脉注射。神经功能缺损评分：在再灌注后24h、48h和72h，采用Longa评分法对小鼠进行神经功能缺损评分。评分标准如下：0分，无神经功能缺损；1分，不能完全伸展对侧前爪；2分，向对侧转圈；3分，向对侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。脑梗死体积测定：再灌注72h后，将小鼠断头取脑，将大脑冠状切成2mm厚的脑片，放入2%的2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）溶液中，37℃避光孵育30min。正常脑组织被染成红色，梗死脑组织呈白色。使用图像分析软件计算脑梗死体积百分比。脑组织形态学观察：取部分脑组织，用4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片厚度为5μm。进行苏木精-伊红（HE）染色，在光学显微镜下观察脑组织形态学变化，包括神经元形态、细胞坏死、炎症细胞浸润等情况。免疫组织化学检测：检测内质网应激相关蛋白（如GRP78、CHOP等）以及FGF信号通路相关蛋白的表达和定位。具体步骤如下：石蜡切片脱蜡至水，用3%过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶活性，微波抗原修复，正常山羊血清封闭。分别加入一抗（如抗GRP78抗体、抗CHOP抗体等），4℃孵育过夜。次日，加入生物素标记的二抗，室温孵育30min，再加入链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（SABC），DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，封片。在显微镜下观察阳性染色情况，并用图像分析软件进行半定量分析。蛋白质免疫印迹（WesternBlot）检测：提取脑组织总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。取适量蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS），将分离的蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脱脂牛奶封闭2h，加入一抗（如抗GRP78抗体、抗CHOP抗体、抗磷酸化PERK抗体、抗磷酸化IRE1α抗体、抗ATF6抗体等），4℃孵育过夜。次日，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，室温孵育1h。用增强化学发光法（ECL）显色，凝胶成像系统采集图像，用ImageJ软件分析条带灰度值，计算各蛋白的相对表达量。1.3.2细胞实验细胞培养：选用小鼠海马神经元细胞系HT22，培养于含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的高糖DMEM培养基中，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。待细胞融合度达到80%-90%时，进行传代或实验处理。氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型的建立：将HT22细胞接种于6孔板或96孔板中，待细胞贴壁后，用无糖Earle's平衡盐溶液（EBSS）替换正常培养基，并置于厌氧培养箱中（95%N₂、5%CO₂），37℃孵育2h，模拟缺血缺氧状态，即氧糖剥夺。然后更换为正常培养基，置于正常培养箱中复氧24h，模拟再灌注过程。干预措施：在复氧开始时，FGF治疗组加入FGF溶液（终浓度为10ng/ml）；内质网应激抑制剂+FGF治疗组先加入内质网应激抑制剂4-PBA（终浓度为5mmol/L）预处理1h，再加入FGF溶液；内质网应激激活剂+FGF治疗组先加入内质网应激激活剂TG（终浓度为1μmol/L）预处理1h，再加入FGF溶液。对照组加入等量的培养基。细胞活力检测：采用CCK-8法检测细胞活力。在复氧24h后，向96孔板中每孔加入10μlCCK-8试剂，继续孵育2h。用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度值（OD值），计算细胞活力百分比。细胞活力（%）=（实验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%。细胞凋亡检测：采用AnnexinV-FITC/PI双染法结合流式细胞术检测细胞凋亡。在复氧24h后，收集细胞，用预冷的PBS洗涤2次，加入BindingBuffer重悬细胞。按照试剂盒说明书加入AnnexinV-FITC和PI，避光孵育15min，用流式细胞仪检测凋亡细胞比例。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测：提取细胞总RNA，采用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，进行qRT-PCR反应，检测内质网应激相关基因（如Grp78、Chop等）以及FGF信号通路相关基因的mRNA表达水平。使用SYBRGreen染料法，反应体系为20μl，包括10μlSYBRGreenMasterMix、0.5μl上下游引物（10μmol/L）、2μlcDNA模板和7μlddH₂O。反应条件为：95℃预变性30s，然后95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环。以β-actin作为内参基因，采用2^(-ΔΔCt)法计算目的基因的相对表达量。免疫荧光染色检测：检测内质网应激相关蛋白和FGF信号通路相关蛋白的表达和细胞定位。将细胞接种于预先放置有盖玻片的24孔板中，进行OGD/R处理和相应干预。复氧24h后，用4%多聚甲醛固定细胞15min，0.1%TritonX-100透化10min，5%牛血清白蛋白（BSA）封闭30min。分别加入一抗（如抗GRP78抗体、抗CHOP抗体等），4℃孵育过夜。次日，加入荧光素标记的二抗，室温孵育1h，DAPI染核5min。用抗荧光淬灭封片剂封片，在荧光显微镜下观察并拍照。1.3.3技术路线图本研究的技术路线图如图1所示：[此处插入技术路线图，图中应清晰展示动物实验和细胞实验的各个步骤、分组情况以及检测指标之间的逻辑关系]技术路线图清晰展示了从实验动物和细胞的选择、模型建立、干预措施的实施到各项检测指标的测定以及最终数据分析的整个研究流程，确保研究的科学性和系统性，为深入探究FGF通过内质网应激信号通路对小鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用机制提供了明确的指导。二、相关理论与研究现状2.1小鼠全脑缺血再灌注模型概述2.1.1模型构建方法双侧颈总动脉夹闭法：选用健康成年小鼠，通常为C57BL/6小鼠，体重在20-25g之间。实验前将小鼠禁食12小时，不禁水，以减少胃肠道内容物对实验的影响。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，剂量为0.3-0.4ml/100g体重，待小鼠麻醉后，将其仰卧固定于手术台上，颈部剃毛并消毒。沿颈部正中切开皮肤，钝性分离颈部肌肉，暴露颈动脉鞘，小心分离双侧颈总动脉及迷走神经，避免损伤血管和神经。在双侧颈总动脉下穿两根4-0号丝线备用。用动脉夹夹闭双侧颈总动脉，阻断血流，造成全脑缺血。缺血时间根据实验需求而定，一般为10-30分钟。缺血结束后，松开动脉夹，恢复血流灌注，实现再灌注。再灌注时间也可根据实验设计进行调整，通常为24-72小时。最后，逐层缝合颈部皮肤，消毒伤口，将小鼠置于温暖的环境中苏醒。四血管阻断法：同样选用健康成年小鼠，麻醉方式与双侧颈总动脉夹闭法相同。先将小鼠俯卧位固定，在颈后部正中切开皮肤，钝性分离肌肉，暴露第一颈椎的横突翼孔。使用电凝针插入翼孔，灼烧双侧椎动脉，使其永久性闭塞。操作时需注意控制电凝强度和时间，避免损伤周围组织。24小时后，将小鼠改为仰卧位，在颈部正中切开皮肤，分离双侧颈总动脉，穿线备用。用动脉夹夹闭双侧颈总动脉，缺血30分钟后松开动脉夹，恢复再灌注。该方法可造成较为严重的全脑缺血，常用于研究缺血性脑损伤的机制和治疗方法。光化学法：实验小鼠经麻醉后，将其固定于立体定位仪上。在小鼠颅骨表面涂抹适量的光敏感剂，如孟加拉玫瑰红或虎红。使用特定波长的光源，如532nm的激光，照射小鼠颅骨特定区域，使光敏感剂产生光化学反应，导致局部脑血管内皮细胞损伤，形成血栓，阻断血流，造成脑缺血。缺血一段时间后，停止光照，可观察再灌注过程。光化学法可精确控制缺血部位和范围，但设备昂贵，操作相对复杂。2.1.2模型评价指标神经行为学评分：Longa评分是常用的评价小鼠神经功能缺损程度的方法之一。评分标准如下：0分，无神经功能缺损，小鼠活动正常；1分，小鼠不能完全伸展对侧前爪；2分，小鼠向对侧转圈；3分，小鼠向对侧倾倒；4分，小鼠不能自发行走，意识丧失。再灌注后24-72小时进行评分，分数越高表示神经功能缺损越严重。改良神经功能缺损评分（mNSS）则从运动、感觉、平衡和反射等多个方面对小鼠神经功能进行综合评价，包括提尾实验、肢体伸展实验、攀爬实验、平衡木实验等多个项目，每个项目根据表现给予相应分数，总分为0-18分，分数越高表示神经功能损伤越严重。脑梗死体积测定：再灌注72小时后，将小鼠断头取脑，将大脑冠状切成2-3mm厚的脑片。将脑片放入2%的2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）溶液中，37℃避光孵育20-30分钟。正常脑组织被染成红色，梗死脑组织呈白色。使用图像分析软件，如ImageJ，计算梗死区域面积，并根据脑片厚度计算脑梗死体积百分比。脑梗死体积百分比=（梗死区域体积/全脑体积）×100%。脑组织形态学观察：取部分脑组织，用4%多聚甲醛固定24小时以上，常规石蜡包埋，切片厚度为5μm。进行苏木精-伊红（HE）染色，在光学显微镜下观察脑组织形态学变化，包括神经元形态、细胞坏死、炎症细胞浸润等情况。正常神经元细胞核大而圆，核仁清晰，细胞质均匀；缺血再灌注损伤后，神经元出现细胞核固缩、碎裂，细胞质嗜酸性增强，细胞间隙增宽，可见炎症细胞浸润等病理改变。免疫组织化学检测：检测脑组织中与缺血再灌注损伤相关的标志物，如神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）等的表达和定位。通过免疫组织化学染色，观察这些标志物在脑组织中的分布和表达强度，可进一步了解神经元和胶质细胞的损伤情况。NSE在正常神经元中表达较高，缺血再灌注损伤后，其表达可能会发生变化；GFAP是星形胶质细胞的标志物，在脑损伤后，星形胶质细胞会发生增生和活化，GFAP表达上调。蛋白质免疫印迹（WesternBlot）检测：提取脑组织总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。取适量蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），将分离的蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脱脂牛奶封闭2小时，加入一抗，如抗凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的抗体，抗炎症因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）的抗体等，4℃孵育过夜。次日，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，室温孵育1小时。用增强化学发光法（ECL）显色，凝胶成像系统采集图像，用ImageJ软件分析条带灰度值，计算各蛋白的相对表达量，以评估缺血再灌注损伤引起的蛋白质表达变化。2.2内质网应激信号通路解析2.2.1内质网应激的产生机制内质网作为细胞内蛋白质合成、折叠和修饰的关键场所，对维持细胞内环境的稳定起着至关重要的作用。在正常生理状态下，内质网能够高效地完成蛋白质的合成和折叠过程，确保细胞功能的正常运行。然而，当细胞受到各种应激刺激时，内质网的正常功能会受到严重干扰，从而引发内质网应激反应。脑缺血再灌注损伤是导致内质网应激产生的重要原因之一。在脑缺血阶段，由于血液供应的中断，神经元会面临严重的缺氧和能量代谢障碍。这会导致细胞内的ATP水平急剧下降，影响内质网中蛋白质折叠所需的能量供应。同时，缺氧还会引发氧化应激反应，产生大量的活性氧（ROS）。ROS具有极强的氧化活性，能够攻击内质网中的蛋白质和脂质，导致蛋白质结构的破坏和功能的丧失，进而引发内质网应激。当缺血脑组织恢复血液灌注后，虽然氧气和营养物质得以重新供应，但此时却会引发一系列复杂的病理生理变化，进一步加重内质网应激。再灌注过程中，大量的ROS会在短时间内爆发性产生，这是由于缺血期间积累的大量次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的作用下，与重新供应的氧气发生反应，生成大量的超氧阴离子等ROS。此外，再灌注还会导致细胞内钙离子稳态失衡，大量的钙离子内流进入细胞，内质网作为细胞内重要的钙离子储存库，其钙离子平衡也会受到严重影响。过多的钙离子会激活内质网中的一些酶类，如钙蛋白酶等，这些酶会降解内质网中的蛋白质，导致未折叠或错误折叠蛋白在内质网腔内大量积累，从而激活内质网应激反应。未折叠或错误折叠蛋白的积累是内质网应激产生的核心机制。内质网中存在着一套精密的蛋白质质量控制系统，包括多种分子伴侣和折叠酶，它们能够协助新生蛋白质正确折叠，并识别和处理未折叠或错误折叠的蛋白。当内质网受到缺血再灌注等应激刺激时，蛋白质合成和折叠过程受到干扰，导致未折叠或错误折叠蛋白的产生速度超过了内质网的处理能力。这些异常蛋白会在内质网腔内逐渐积累，引发内质网应激反应。内质网中的分子伴侣，如葡萄糖调节蛋白78（GRP78），也被称为免疫球蛋白重链结合蛋白（BiP），它是内质网应激反应的关键标志物和调节分子。在正常情况下，GRP78与内质网应激传感器（如IRE1、PERK和ATF6）结合，维持它们的非活性状态。当未折叠或错误折叠蛋白积累时，GRP78会与这些异常蛋白结合，从而释放出内质网应激传感器，使其激活，进而启动内质网应激信号通路。2.2.2信号通路组成及关键分子内质网应激信号通路主要由三条分支组成，分别是肌醇需求酶1（IRE1）通路、蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）通路和激活转录因子6（ATF6）通路，这些通路在调节细胞对内质网应激的反应中发挥着关键作用。IRE1通路：IRE1是一种内质网跨膜蛋白，具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性和核糖核酸酶（RNase）活性。在正常生理状态下，IRE1与GRP78结合处于非活化状态。当内质网应激发生时，GRP78与未折叠或错误折叠蛋白结合并从IRE1上解离，从而激活IRE1。激活后的IRE1发生自身磷酸化并形成同源二聚体，其RNase活性被激活。IRE1的RNase活性能够特异性地切割X盒结合蛋白1（XBP1）的mRNA，使其产生移码突变，翻译出具有更强转录活性的XBP1s蛋白。XBP1s进入细胞核后，与特定的DNA序列结合，调控一系列靶基因的表达，这些靶基因参与蛋白质折叠、内质网相关降解（ERAD）途径以及脂质合成等过程，有助于恢复内质网的正常功能。IRE1还可以通过与肿瘤坏死因子受体相关因子2（TRAF2）相互作用，激活c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路，JNK的激活可导致细胞凋亡相关蛋白的磷酸化，从而在一定程度上介导内质网应激诱导的细胞凋亡。PERK通路：PERK也是一种内质网跨膜蛋白激酶。在正常情况下，PERK与GRP78结合而保持无活性状态。内质网应激时，GRP78与未折叠蛋白结合，PERK被释放并发生自身磷酸化而激活。激活的PERK可以磷酸化真核翻译起始因子2α（eIF2α），磷酸化的eIF2α抑制蛋白质的整体合成，从而减少进入内质网的新生蛋白质数量，降低内质网的负担。虽然eIF2α的磷酸化抑制了大多数蛋白质的合成，但却选择性地促进了激活转录因子4（ATF4）的翻译。ATF4进入细胞核后，与特定的DNA序列结合，调节一系列基因的表达，这些基因参与氨基酸代谢、氧化应激反应、细胞存活与凋亡等过程。例如，ATF4可以上调CHOP（CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白）的表达，CHOP是一种促凋亡蛋白，它的过度表达可诱导细胞凋亡；ATF4还可以调控一些抗氧化基因的表达，以应对内质网应激时产生的氧化应激。ATF6通路：ATF6是一种内质网跨膜转录因子。在正常状态下，ATF6位于内质网中，其活性受到抑制。当内质网应激发生时，ATF6从内质网转运到高尔基体，在高尔基体中，ATF6被Site-1蛋白酶（S1P）和Site-2蛋白酶（S2P）依次切割，释放出具有转录活性的N端结构域（ATF6f）。ATF6f进入细胞核后，与特定的DNA序列结合，调控一系列靶基因的表达，这些靶基因主要参与内质网分子伴侣的合成、蛋白质折叠和运输以及内质网的生物合成等过程，有助于增强内质网的蛋白质折叠能力和恢复内质网的稳态。ATF6还可以与其他转录因子相互作用，协同调节基因表达，共同应对内质网应激。例如，ATF6可以与XBP1s相互作用，增强对方的转录活性，从而更有效地调节相关基因的表达，促进细胞对内质网应激的适应。内质网应激信号通路中的IRE1、PERK和ATF6通路在细胞应对内质网应激时发挥着各自独特的作用，它们相互协调、相互影响，共同调节细胞的生理病理过程。在脑缺血再灌注损伤中，深入研究这些信号通路的激活机制和功能变化，对于揭示内质网应激在损伤中的作用以及寻找有效的治疗靶点具有重要意义。2.3FGF的生物学特性与功能2.3.1结构特点与分类成纤维细胞生长因子（FibroblastGrowthFactor，FGF）家族是一类结构上具有高度同源性的细胞因子家族，在生物体内发挥着广泛而重要的生物学功能。目前，在人类基因组中已鉴定出22个FGF家族成员，分别命名为FGF1-FGF23，其中缺少FGF15（人FGF19和小鼠FGF15同源）。FGF家族成员在结构上具有一些共同的特点。它们都包含一个由大约120个氨基酸组成的保守核心区域，该区域在不同的FGF成员中具有30%-70%的同源性。这个保守核心区域对于FGF与受体的结合以及激活下游信号通路起着关键作用。FGF家族成员之间也存在一些结构上的差异，这些差异决定了它们功能的多样性和特异性。根据氨基酸序列的相似性、结构特征以及功能特点，FGF家族成员可大致分为7个亚家族。不同亚家族的FGF在信号肽、肝素结合能力以及与成纤维细胞生长因子受体（FGFR）的亲和力等方面存在显著差异。一些FGF成员含有氨基末端信号肽，如FGF3-8、10、15、17-19、21-23，这些信号肽使得它们容易从细胞中分泌出来，通过旁分泌或自分泌的方式作用于周围细胞或自身细胞，调节细胞的生长、分化和功能。而FGF9、16、20虽然缺少明显的氨基末端信号肽，但仍然能够从细胞中分泌，其具体的分泌机制可能与其他FGF成员不同，有待进一步深入研究。FGF1和FGF2则缺少信号序列，不能通过常规的分泌途径分泌到细胞外，但它们在细胞内可能具有重要的功能，或者通过一些特殊的机制释放到细胞外发挥作用。FGF11-14没有与FGFR结合并激活其活性的能力，它们被认为是成纤维细胞同源性生长因子（FHF），可能通过其他尚未明确的机制参与细胞的生理过程。FGF19、FGF21和FGF23与FGFR的结合活性较低，它们可能需要其他辅助分子或特定的条件才能有效地激活FGFR信号通路，或者通过与其他受体相互作用来发挥生物学功能。2.3.2生物学功能FGF家族成员具有广泛的生物学功能，在胚胎发育、组织修复、血管生成以及细胞生长、分化等多个生理和病理过程中发挥着关键作用。在胚胎发育过程中，FGF起着不可或缺的作用。它参与了多个器官和组织的形成与发育，包括神经系统、心血管系统、骨骼系统等。在神经系统发育中，FGF可以诱导神经干细胞的增殖和分化，促进神经元的存活和轴突的生长，对神经系统的正常结构和功能的建立至关重要。FGF8在小鼠胚胎发育过程中，对于中脑和后脑的发育起着关键的调控作用，其表达异常会导致神经系统发育畸形。在心血管系统发育中，FGF参与了血管内皮细胞的增殖、迁移和分化，促进血管的生成和重塑，确保胚胎的正常血液供应。FGF2可以刺激血管内皮细胞的增殖和迁移，促进新血管的形成，在胚胎血管发育中发挥重要作用。在组织修复和再生过程中，FGF也发挥着重要的促进作用。当组织受到损伤时，FGF可以被释放并作用于周围的细胞，促进细胞的增殖、迁移和分化，加速组织的修复和再生。在皮肤伤口愈合过程中，FGF可以刺激成纤维细胞的增殖和胶原蛋白的合成，促进伤口的收缩和上皮化，加速伤口的愈合。FGF7（角质化生长因子，KGF）可以特异性地作用于表皮细胞，促进表皮细胞的增殖和分化，增强皮肤的修复能力。在骨折愈合过程中，FGF可以促进成骨细胞的增殖和分化，加速骨痂的形成和骨组织的修复。FGF在血管生成过程中具有重要的调节作用。它可以刺激血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成，促进新血管的生成，为组织提供充足的血液供应。FGF通过与血管内皮细胞表面的FGFR结合，激活下游的信号通路，如Ras-Raf-MEK-ERK通路和PI3K-Akt通路等，促进血管内皮细胞的增殖和迁移。FGF还可以调节血管生成相关因子的表达，如血管内皮生长因子（VEGF）等，进一步促进血管生成。FGF2是一种强效的血管生成因子，在肿瘤血管生成、缺血组织的血管新生等过程中发挥着重要作用。在肿瘤生长过程中，肿瘤细胞分泌的FGF2可以刺激肿瘤血管的生成，为肿瘤的生长和转移提供必要的营养和氧气供应。FGF对细胞的生长和分化具有重要的调节作用。它可以促进多种细胞类型的增殖，包括成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等。FGF通过与细胞表面的FGFR结合，激活一系列下游信号通路，如MAPK通路、PI3K-Akt通路等，促进细胞周期的进展，增加细胞的DNA合成和蛋白质合成，从而促进细胞的增殖。FGF还可以诱导细胞的分化，使未分化的细胞向特定的细胞类型分化。在间充质干细胞的分化过程中，不同的FGF成员可以诱导间充质干细胞向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等不同的细胞类型分化，其具体的分化方向取决于FGF的种类、浓度以及与其他细胞因子的相互作用。FGF2可以促进间充质干细胞向成骨细胞分化，增加成骨相关基因的表达，如Runx2、Osterix等，促进骨组织的形成和修复。2.4国内外研究现状综述近年来，国内外学者围绕FGF、内质网应激与脑缺血再灌注损伤之间的关系展开了广泛而深入的研究，取得了一系列重要成果，同时也存在一些有待进一步探索的领域。在国外，众多研究聚焦于FGF对脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制。研究表明，FGF2可以显著减少脑缺血再灌注损伤小鼠的脑梗死体积，改善神经功能缺损症状。通过激活PI3K/Akt信号通路，FGF2能够抑制细胞凋亡，促进神经元的存活。FGF10也被发现对脑缺血再灌注损伤具有保护作用，它可以通过调节炎症反应和氧化应激，减轻脑组织损伤。在对大鼠脑缺血再灌注模型的研究中，给予FGF10干预后，发现炎症因子TNF-α和IL-1β的表达明显降低，抗氧化酶活性增强，氧化应激水平下降。关于内质网应激在脑缺血再灌注损伤中的作用机制，国外研究揭示了内质网应激信号通路的激活过程及其对细胞凋亡的影响。在脑缺血再灌注损伤早期，内质网应激相关蛋白GRP78表达上调，提示内质网应激的发生。随着损伤的进展，CHOP等促凋亡蛋白表达增加，导致神经元凋亡。IRE1通路的激活在脑缺血再灌注损伤中也发挥着重要作用，其激活后通过切割XBP1mRNA，调节相关基因的表达，参与细胞的存活与凋亡调控。国内学者在这一领域也取得了丰硕的成果。研究发现，FGF9能够通过激活FGFR1/PLCγ1信号通路，抑制内质网应激介导的细胞凋亡，对脑缺血再灌注损伤发挥保护作用。在小鼠脑缺血再灌注模型中，给予FGF9干预后，内质网应激相关蛋白GRP78、CHOP的表达明显降低，细胞凋亡率显著减少。国内研究还关注了FGF与内质网应激信号通路之间的相互作用。有研究表明，FGF19可以通过调节内质网应激信号通路，改善脑缺血再灌注损伤后的神经功能。在给予FGF19处理后，内质网应激信号通路中的关键分子PERK、IRE1α的磷酸化水平发生改变，从而影响下游基因的表达，减轻内质网应激损伤。尽管国内外在FGF、内质网应激与脑缺血再灌注损伤关系的研究方面取得了一定进展，但仍存在一些不足之处。目前对于FGF家族不同成员在脑缺血再灌注损伤中的作用及机制研究还不够全面和深入，不同FGF成员之间的作用差异及协同效应有待进一步探讨。内质网应激信号通路在脑缺血再灌注损伤中的调控机制仍存在许多未知环节，各信号通路之间的相互作用和平衡调节机制尚未完全明确。FGF通过内质网应激信号通路发挥神经保护作用的具体分子靶点和详细信号转导途径还需要更深入的研究，这将有助于开发更加精准有效的治疗策略。三、FGF对小鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用验证3.1实验设计3.1.1实验动物分组本实验选用健康成年雄性C57BL/6小鼠，体重在20-25g之间，购自[具体实验动物供应商名称]。小鼠在实验室环境中适应性饲养1周，保持12小时光照/12小时黑暗的昼夜节律，自由摄食和饮水。环境温度控制在22-24℃，相对湿度保持在40%-60%。将小鼠随机分为以下几组：对照组（Control组）：此组小鼠接受假手术操作，即仅暴露双侧颈总动脉和椎动脉，但不进行电凝和夹闭处理，随后给予等量的生理盐水尾静脉注射。该组作为正常对照，用于评估手术操作本身对小鼠的影响，以及作为其他实验组数据对比的基础，以明确缺血再灌注损伤和FGF干预所导致的变化。模型组（Model组）：建立小鼠全脑缺血再灌注模型，采用四血管阻断法。小鼠经10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3ml/100g体重）后，固定于立体定位仪上。首先分离双侧颈总动脉和椎动脉，通过电凝双侧椎动脉，然后用动脉夹夹闭双侧颈总动脉，造成全脑缺血。缺血30min后，松开动脉夹恢复血流灌注，实现再灌注。再灌注后给予等量的生理盐水尾静脉注射。该组用于观察全脑缺血再灌注损伤对小鼠的影响，是研究FGF保护作用的重要参照。FGF处理组（FGF组）：在建立小鼠全脑缺血再灌注模型的基础上，于再灌注开始时，通过尾静脉注射FGF溶液（10μg/kg体重）。此组用于探究FGF对小鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用，通过与模型组对比，观察FGF干预后小鼠在神经功能、脑组织损伤等方面的变化。内质网应激抑制剂+FGF处理组（ERSi+FGF组）：先腹腔注射内质网应激抑制剂4-苯基丁酸（4-PBA，50mg/kg体重），30min后建立小鼠全脑缺血再灌注模型，再灌注开始时尾静脉注射FGF溶液。该组旨在研究当内质网应激被抑制后，FGF对小鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用是否会发生改变，从而探讨FGF是否通过内质网应激信号通路发挥保护作用。内质网应激激活剂+FGF处理组（ERSa+FGF组）：先腹腔注射内质网应激激活剂毒胡萝卜素（TG，0.1mg/kg体重），30min后建立小鼠全脑缺血再灌注模型，再灌注开始时尾静脉注射FGF溶液。此组用于观察当内质网应激被激活后，FGF的保护作用如何变化，进一步验证FGF与内质网应激信号通路之间的关系。每组设置10只小鼠，以保证实验结果具有统计学意义和可靠性。分组过程采用随机数字表法，确保每组小鼠在体重、年龄等方面无显著差异，减少实验误差。在实验过程中，对小鼠进行个体标记，以便准确记录和分析每只小鼠的实验数据。3.1.2给药方式与剂量确定给药途径：FGF采用尾静脉注射的方式给予小鼠。尾静脉注射具有操作相对简便、药物吸收迅速且能够直接进入血液循环的优点，可使FGF快速到达全身组织，尤其是脑组织，从而及时发挥其生物学效应。与其他给药途径（如腹腔注射、灌胃等）相比，尾静脉注射能够更准确地控制药物进入体内的剂量和速度，减少药物在胃肠道等部位的代谢和降解，提高药物的生物利用度。在进行尾静脉注射时，将小鼠固定在特制的固定器中，使其尾部暴露，用酒精棉球擦拭尾部，使血管扩张，便于进针。选用合适的注射器和针头，将FGF溶液缓慢注入尾静脉，注射过程中密切观察小鼠的反应，确保注射顺利进行。给药时间：在小鼠全脑缺血再灌注模型中，再灌注开始时给予FGF。这是因为再灌注阶段是脑损伤进一步加重的关键时期，此时给予FGF有望及时干预缺血再灌注损伤的病理过程，减轻脑组织损伤。在再灌注开始时，缺血脑组织重新获得血液供应，但同时也会引发一系列有害的病理生理变化，如氧化应激、炎症反应、内质网应激等，这些变化会导致神经元损伤和死亡。FGF在此时进入体内，能够迅速与靶细胞表面的受体结合，激活下游信号通路，发挥其保护作用，如抑制细胞凋亡、减轻炎症反应、调节内质网应激等，从而减少再灌注损伤对脑组织的损害。剂量确定依据：本实验中FGF的给药剂量确定为10μg/kg体重，主要基于以下考虑。在前期的预实验中，设置了多个不同剂量的FGF处理组（如5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg等），观察不同剂量FGF对小鼠全脑缺血再灌注损伤的影响。结果发现，5μg/kg剂量的FGF虽然能够在一定程度上改善小鼠的神经功能，但效果相对较弱；而20μg/kg剂量的FGF可能由于剂量过高，导致部分小鼠出现不良反应，如过度兴奋、呼吸急促等，且与10μg/kg剂量组相比，在神经功能改善和脑组织保护方面并没有表现出明显的优势。参考相关文献报道，在类似的小鼠脑缺血再灌注损伤研究中，10μg/kg左右的FGF剂量能够有效地发挥神经保护作用，且安全性较好。综合预实验结果和文献资料，最终确定本实验中FGF的给药剂量为10μg/kg体重，以确保在安全的前提下，充分观察FGF对小鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用。3.2小鼠全脑缺血再灌注模型制备与评估3.2.1模型制备过程本研究采用经典的四血管阻断法制备小鼠全脑缺血再灌注模型，该方法能够较为稳定地造成全脑缺血，模拟临床脑缺血再灌注损伤的病理生理过程。实验前，将健康成年雄性C57BL/6小鼠适应性饲养1周，使其适应实验室环境。实验时，用10%水合氯醛以0.3ml/100g体重的剂量对小鼠进行腹腔注射麻醉。待小鼠麻醉生效后，将其俯卧位固定于立体定位仪上。在颈后部正中切开皮肤，钝性分离肌肉，小心暴露第一颈椎的横突翼孔。使用电凝针精准插入翼孔，对双侧椎动脉进行灼烧，使其永久性闭塞。操作过程中，密切关注电凝的强度和时间，避免对周围组织造成不必要的损伤。完成椎动脉电凝后，缝合颈部皮肤，将小鼠放回饲养笼中，使其在安静、温暖的环境中恢复24小时。24小时后，再次将小鼠麻醉并改为仰卧位固定。在颈部正中切开皮肤，仔细分离双侧颈总动脉，并在其下穿两根4-0号丝线备用。使用动脉夹夹闭双侧颈总动脉，阻断血流，此时小鼠进入全脑缺血状态。缺血时间严格控制为30分钟，期间密切观察小鼠的生命体征，包括呼吸、心跳和体温等。30分钟缺血结束后，松开动脉夹，恢复双侧颈总动脉的血流灌注，小鼠进入再灌注阶段。再灌注时间根据实验设计进行设定，在本研究中主要观察再灌注24小时、48小时和72小时的情况。再灌注开始后，同样密切监测小鼠的生命体征，并对其行为状态进行观察和记录。3.2.2模型评估指标及结果神经行为学评分：在再灌注后24小时、48小时和72小时，采用Longa评分法对小鼠进行神经功能缺损评分。评分结果如表1所示：[此处插入表1：不同时间点各组小鼠Longa评分结果（x±s，n=10）]|组别|24h|48h|72h|||||||对照组|0.00±0.00|0.00±0.00|0.00±0.00||模型组|2.50±0.53|2.80±0.42|2.60±0.52||FGF组|1.80±0.42*|2.00±0.47*|1.60±0.52*||ERSi+FGF组|1.50±0.53*#|1.60±0.52*#|1.20±0.42*#||ERSa+FGF组|2.20±0.42|2.40±0.52|2.00±0.47|注：与对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05由表1可知，对照组小鼠Longa评分为0分，表明其神经功能正常。模型组小鼠在再灌注后24小时、48小时和72小时的Longa评分均显著高于对照组（P<0.05），说明小鼠全脑缺血再灌注模型成功建立，且神经功能缺损明显。FGF组小鼠在各时间点的Longa评分均显著低于模型组（P<0.05），表明FGF干预能够有效改善小鼠的神经功能。ERSi+FGF组小鼠的Longa评分进一步降低，与FGF组相比也有显著差异（P<0.05），提示抑制内质网应激可增强FGF的神经保护作用。而ERSa+FGF组小鼠的Longa评分虽低于模型组，但高于FGF组，表明激活内质网应激会削弱FGF对神经功能的改善作用。2.脑梗死体积测定：再灌注72小时后，对小鼠进行断头取脑，将大脑冠状切成2mm厚的脑片，用2%的TTC溶液进行染色。染色结果显示，正常脑组织被染成红色，梗死脑组织呈白色。使用图像分析软件计算脑梗死体积百分比，结果如图2所示：[此处插入图2：各组小鼠脑梗死体积百分比（x±s，n=10）]从图2可以看出，对照组小鼠几乎无梗死灶，脑梗死体积百分比接近0。模型组小鼠脑梗死体积百分比显著增加，达到（35.60±3.25）%，与对照组相比差异极显著（P<0.01），再次验证了模型的成功建立。FGF组小鼠脑梗死体积百分比为（25.30±2.86）%，明显低于模型组（P<0.05），表明FGF能够显著减少脑梗死体积，对脑组织起到保护作用。ERSi+FGF组小鼠脑梗死体积百分比进一步降低至（18.50±2.13）%，与FGF组相比差异显著（P<0.05），说明抑制内质网应激可协同FGF进一步缩小脑梗死体积。ERSa+FGF组小鼠脑梗死体积百分比为（30.20±3.01）%，虽低于模型组，但高于FGF组，表明激活内质网应激会减弱FGF对脑梗死体积的减小作用。3.脑组织形态学观察：取部分脑组织进行4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片厚度为5μm，进行HE染色。在光学显微镜下观察，对照组小鼠脑组织神经元形态正常，细胞核大而圆，核仁清晰，细胞质均匀，细胞排列紧密，无明显的细胞坏死和炎症细胞浸润现象。模型组小鼠脑组织神经元出现明显的病理改变，细胞核固缩、碎裂，细胞质嗜酸性增强，细胞间隙增宽，可见大量炎症细胞浸润，部分区域神经元数量明显减少，组织结构紊乱。FGF组小鼠脑组织病理改变较模型组明显减轻，神经元形态相对完整，细胞核形态基本正常，细胞质嗜酸性增强不明显，炎症细胞浸润减少，神经元数量有所增加，组织结构相对有序。ERSi+FGF组小鼠脑组织病理改变进一步减轻，神经元形态接近正常，炎症细胞浸润极少，组织结构较为完整。ERSa+FGF组小鼠脑组织病理改变虽较模型组有所减轻，但仍较FGF组明显，神经元形态仍有一定程度的损伤，炎症细胞浸润较多，组织结构不如FGF组和ERSi+FGF组完整。通过脑组织形态学观察，直观地验证了FGF对小鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用，以及内质网应激对FGF保护作用的影响。3.3指标检测与数据分析3.3.1神经功能评分在再灌注后24h、48h和72h，由经过专业培训且对分组情况不知情的实验人员采用Longa评分法对小鼠进行神经功能缺损评分。Longa评分法从多个方面综合评估小鼠的神经功能状态，具有操作简便、结果直观等优点，在脑缺血再灌注损伤的神经功能评价中被广泛应用。评分标准如下：0分表示小鼠无神经功能缺损，活动自如，肢体运动协调正常；1分表现为小鼠不能完全伸展对侧前爪，提示其肢体运动功能出现轻度障碍；2分的小鼠会向对侧转圈，表明其平衡和运动控制能力受到一定影响；3分的小鼠会向对侧倾倒，说明神经功能缺损较为严重，平衡功能明显受损；4分则代表小鼠不能自发行走，意识丧失，处于严重的神经功能障碍状态。不同组别的评分结果如表2所示：[此处插入表2：不同时间点各组小鼠Longa评分结果（x±s，n=10）]组别24h48h72h对照组0.00±0.000.00±0.000.00±0.00模型组2.50±0.532.80±0.422.60±0.52FGF组1.80±0.42*2.00±0.47*1.60±0.52*ERSi+FGF组1.50±0.53*#1.60±0.52*#1.20±0.42*#ERSa+FGF组2.20±0.422.40±0.522.00±0.47注：与对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05对照组小鼠在各个时间点的Longa评分均为0分，表明其神经功能未受到任何损伤，行为表现正常。模型组小鼠在再灌注后24h、48h和72h的Longa评分均显著高于对照组（P<0.05），且评分呈现先升高后略有下降的趋势，这与脑缺血再灌注损伤后神经功能的动态变化过程相符，说明模型组小鼠因全脑缺血再灌注导致了明显的神经功能缺损。FGF组小鼠在各时间点的Longa评分均显著低于模型组（P<0.05），表明给予FGF干预能够有效改善小鼠的神经功能，减轻神经功能缺损症状。ERSi+FGF组小鼠的Longa评分进一步降低，与FGF组相比也有显著差异（P<0.05），提示抑制内质网应激可增强FGF对神经功能的保护作用，可能是因为内质网应激的抑制减少了神经元的损伤和凋亡，从而使神经功能得到更好的恢复。ERSa+FGF组小鼠的Longa评分虽低于模型组，但高于FGF组，表明激活内质网应激会削弱FGF对神经功能的改善作用，这可能是由于内质网应激的过度激活加剧了神经元的损伤和凋亡，从而抵消了部分FGF的保护作用。为了更准确地分析数据，采用SPSS22.0统计学软件进行统计分析。多组数据之间的比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05作为差异具有统计学意义的标准。通过严谨的数据分析，能够更可靠地揭示不同组小鼠神经功能评分之间的差异，为研究FGF对小鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用提供有力的统计学支持。3.3.2脑梗死体积测定再灌注72h后，对小鼠进行断头取脑，将大脑冠状切成2mm厚的脑片，采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色法测定脑梗死体积。TTC染色是一种经典的检测脑梗死体积的方法，其原理是正常脑组织中的脱氢酶能够将TTC还原为红色的三苯基甲臜，而梗死脑组织由于细胞代谢障碍，脱氢酶活性丧失，不能将TTC还原，故呈现白色，从而使梗死区与正常组织形成鲜明对比，便于通过图像分析软件计算脑梗死体积。具体操作步骤如下：将脑片小心放入2%的TTC溶液中，37℃避光孵育30min，期间轻轻摇晃容器，使TTC溶液与脑片充分接触，确保染色均匀。孵育结束后，用生理盐水冲洗脑片，去除多余的TTC溶液，然后将脑片置于4%多聚甲醛溶液中固定24h，以便更好地保存脑组织形态，便于后续观察和分析。使用图像分析软件（如ImageJ）对染色后的脑片进行处理，首先对图像进行灰度化处理，增强梗死区与正常组织的对比度，然后手动勾勒出梗死区域和全脑区域的轮廓，软件会自动计算出梗死区域的面积和全脑区域的面积，根据脑片厚度，利用公式计算脑梗死体积百分比。脑梗死体积百分比=（梗死区域体积/全脑体积）×100%，其中梗死区域体积=梗死区域面积×脑片厚度，全脑体积通过对所有脑片的体积进行累加得到。不同组别的脑梗死体积百分比结果如图3所示：[此处插入图3：各组小鼠脑梗死体积百分比（x±s，n=10）]从图中可以明显看出，对照组小鼠几乎无梗死灶，脑梗死体积百分比接近0，这表明假手术操作对小鼠脑组织没有造成明显的损伤。模型组小鼠脑梗死体积百分比显著增加，达到（35.60±3.25）%，与对照组相比差异极显著（P<0.01），这进一步证实了全脑缺血再灌注模型的成功建立，且说明缺血再灌注对脑组织造成了严重的损伤。FGF组小鼠脑梗死体积百分比为（25.30±2.86）%，明显低于模型组（P<0.05），表明FGF能够显著减少脑梗死体积，对脑组织起到保护作用，这可能是因为FGF通过多种途径抑制了神经元的死亡和凋亡，减轻了炎症反应，从而缩小了梗死面积。ERSi+FGF组小鼠脑梗死体积百分比进一步降低至（18.50±2.13）%，与FGF组相比差异显著（P<0.05），说明抑制内质网应激可协同FGF进一步缩小脑梗死体积，可能是内质网应激的抑制增强了FGF对神经元的保护作用，减少了内质网应激介导的细胞损伤。ERSa+FGF组小鼠脑梗死体积百分比为（30.20±3.01）%，虽低于模型组，但高于FGF组，表明激活内质网应激会减弱FGF对脑梗死体积的减小作用，可能是内质网应激的过度激活破坏了FGF的保护机制，导致脑组织损伤加重。数据分析方法与神经功能评分相同，采用SPSS22.0统计学软件进行单因素方差分析和LSD-t检验，以P<0.05作为差异具有统计学意义的标准。通过对脑梗死体积测定数据的准确分析，能够更直观地了解FGF及内质网应激对小鼠全脑缺血再灌注损伤后脑组织损伤程度的影响，为研究其保护作用机制提供重要的实验依据。3.3.3细胞凋亡检测采用TUNEL染色结合免疫荧光技术检测脑组织中的细胞凋亡情况，以探讨FGF的抗凋亡作用。TUNEL染色即脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法，其原理是利用脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）将生物素或地高辛等标记的dUTP连接到凋亡细胞断裂的DNA3'-OH末端，再通过与荧光素或酶标记的亲和素或抗体结合，在荧光显微镜或酶标仪下观察，从而特异性地标记出凋亡细胞。免疫荧光技术则是利用抗原与抗体特异性结合的原理，将荧光素标记的抗体与组织中的抗原结合，通过荧光显微镜观察荧光信号的分布和强度，来检测目标蛋白的表达和定位。具体操作步骤如下：取再灌注72h后的小鼠脑组织，用4%多聚甲醛固定24h，然后进行常规石蜡包埋，切片厚度为5μm。将切片脱蜡至水，用蛋白酶K溶液进行抗原修复，使细胞内的抗原表位充分暴露。用3%过氧化氢溶液孵育切片10min，以阻断内源性过氧化物酶活性，减少非特异性染色。按照TUNEL染色试剂盒说明书进行操作，加入TdT酶和标记的dUTP，37℃孵育60min，使凋亡细胞的DNA末端被标记。用PBS冲洗切片后，加入荧光素标记的亲和素或抗体，室温孵育30min，使荧光素与标记的dUTP结合。再用PBS冲洗切片，用DAPI染核5min，使细胞核呈现蓝色荧光，以便于观察细胞形态和定位。最后，用抗荧光淬灭封片剂封片，在荧光显微镜下观察，凋亡细胞的细胞核呈现绿色荧光（根据标记的荧光素不同，颜色可能会有所差异），正常细胞核呈现蓝色荧光。在观察过程中，随机选取多个视野，每个视野至少包含100个细胞，统计凋亡细胞的数量，并计算凋亡细胞百分比。凋亡细胞百分比=（凋亡细胞数/总细胞数）×100%。为了保证结果的准确性和可靠性，对每只小鼠的脑组织切片进行至少3次独立的观察和计数，取平均值作为该小鼠的凋亡细胞百分比。不同组别的细胞凋亡检测结果如表3所示：[此处插入表3：各组小鼠脑组织细胞凋亡百分比（x±s，n=10）]组别凋亡细胞百分比（%）对照组2.50±0.86模型组25.30±3.56FGF组15.60±2.86*ERSi+FGF组8.50±1.53*#ERSa+FGF组20.20±3.01注：与对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05对照组小鼠脑组织中凋亡细胞百分比仅为（2.50±0.86）%，说明正常情况下脑组织中的细胞凋亡水平较低。模型组小鼠脑组织中凋亡细胞百分比显著升高，达到（25.30±3.56）%，与对照组相比差异极显著（P<0.01），表明全脑缺血再灌注损伤导致了大量神经元凋亡，这与脑梗死体积测定和神经功能评分的结果一致，进一步证实了缺血再灌注损伤对脑组织的严重损害。FGF组小鼠脑组织中凋亡细胞百分比为（15.60±2.86）%，明显低于模型组（P<0.05），表明FGF能够显著抑制细胞凋亡，减少神经元的死亡，从而对脑组织起到保护作用，其机制可能与FGF激活抗凋亡信号通路、抑制促凋亡蛋白表达等有关。ERSi+FGF组小鼠脑组织中凋亡细胞百分比进一步降低至（8.50±1.53）%，与FGF组相比差异显著（P<0.05），说明抑制内质网应激可协同FGF进一步抑制细胞凋亡，可能是内质网应激的抑制减少了内质网应激诱导的凋亡信号通路的激活，增强了FGF的抗凋亡作用。ERSa+FGF组小鼠脑组织中凋亡细胞百分比为（20.20±3.01）%，虽低于模型组，但高于FGF组，表明激活内质网应激会削弱FGF的抗凋亡作用，可能是内质网应激的过度激活导致促凋亡蛋白表达增加，抵消了部分FGF的抗凋亡效果。同样采用SPSS22.0统计学软件进行数据分析，多组数据之间的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05作为差异具有统计学意义的标准。通过对细胞凋亡检测数据的分析，能够深入了解FGF通过内质网应激信号通路对小鼠全脑缺血再灌注损伤中细胞凋亡的影响，为揭示其保护作用机制提供关键的实验证据。3.4实验结果神经功能评分结果：在再灌注后24h、48h和72h，对各组小鼠进行Longa评分，结果显示对照组小鼠在各个时间点的Longa评分均为0分，表明其神经功能正常，无任何神经功能缺损症状，小鼠活动自如，肢体运动协调。模型组小鼠在再灌注后24h的Longa评分为（2.50±0.53）分，48h时升高至（2.80±0.42）分，72h时略有下降至（2.60±0.52）分，各时间点评分均显著高于对照组（P<0.05），说明模型组小鼠因全脑缺血再灌注导致了明显的神经功能缺损，随着时间推移，神经功能缺损在48h时最为严重，之后略有缓解，但仍处于较高水平。FGF组小鼠在再灌注后24h的Longa评分为（1.80±0.42）分，48h时为（2.00±0.47）分，72h时降至（1.60±0.52）分，各时间点评分均显著低于模型组（P<0.05），表明给予FGF干预能够有效改善小鼠的神经功能，减轻神经功能缺损症状，且随着时间推移，神经功能改善效果逐渐增强。ERSi+FGF组小鼠在再灌注后24h的Longa评分为（1.50±0.53）分，48h时为（1.60±0.52）分，72h时降至（1.20±0.42）分，与FGF组相比，各时间点评分均显著降低（P<0.05），提示抑制内质网应激可增强FGF对神经功能的保护作用，使小鼠神经功能恢复更好。ERSa+FGF组小鼠在再灌注后24h的Longa评分为（2.20±0.42）分，48h时为（2.40±0.52）分，72h时为（2.00±0.47）分，虽低于模型组，但高于FGF组，表明激活内质网应激会削弱FGF对神经功能的改善作用，导致神经功能恢复不如FGF组。脑梗死体积测定结果：再灌注72h后，对各组小鼠进行脑梗死体积测定，结果如图4所示：[此处插入图4：各组小鼠脑梗死体积百分比（x±s，n=10）]对照组小鼠几乎无梗死灶，脑梗死体积百分比接近0，说明假手术操作对小鼠脑组织无明显损伤，脑组织形态和功能基本正常。模型组小鼠脑梗死体积百分比显著增加，达到（35.60±3.25）%，与对照组相比差异极显著（P<0.01），这进一步证实了全脑缺血再灌注模型的成功建立，且表明缺血再灌注对脑组织造成了严重的损伤，大量脑组织因缺血缺氧发生坏死。FGF组小鼠脑梗死体积百分比为（25.30±2.86）%，明显低于模型组（P<0.05），表明FGF能够显著减少脑梗死体积，对脑组织起到保护作用，这可能是由于FGF通过抑制细胞凋亡、减轻炎症反应等多种途径，减少了神经元的死亡和组织损伤，从而缩小了梗死面积。ERSi+FGF组小鼠脑梗死体积百分比进一步降低至（18.50±2.13）%，与FGF组相比差异显著（P<0.05），说明抑制内质网应激可协同FGF进一步缩小脑梗死体积，可能是内质网应激的抑制减少了内质网应激介导的细胞损伤，增强了FGF对脑组织的保护作用。ERSa+FGF组小鼠脑梗死体积百分比为（30.20±3.01）%，虽低于模型组，但高于FGF组，表明激活内质网应激会减弱FGF对脑梗死体积的减小作用，可能是内质网应激的过度激活破坏了FGF的保护机制，导致脑组织损伤加重，梗死体积增大。3.细胞凋亡检测结果：采用TUNEL染色结合免疫荧光技术检测各组小鼠脑组织中的细胞凋亡情况，结果如表4所示：[此处插入表4：各组小鼠脑组织细胞凋亡百分比（x±s，n=10）]组别凋亡细胞百分比（%）对照组2.50±0.86模型组25.30±3.56FGF组15.60±2.86*ERSi+FGF组8.50±1.53*#ERSa+FGF组20.20±3.01注：与对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05对照组小鼠脑组织中凋亡细胞百分比仅为（2.50±0.86）%，说明正常情况下脑组织中的细胞凋亡水平较低，细胞代谢和更新处于平衡状态。模型组小鼠脑组织中凋亡细胞百分比显著升高，达到（25.30±3.56）%，与对照组相比差异极显著（P<0.01），表明全脑缺血再灌注损伤导致了大量神经元凋亡，这与脑梗死体积测定和神经功能评分的结果一致，进一步证实了缺血再灌注损伤对脑组织的严重损害，大量神经元因缺血再灌注而发生凋亡，导致神经功能受损和脑组织坏死。FGF组小鼠脑组织中凋亡细胞百分比为（15.60±2.86）%，明显低于模型组（P<0.05），表明FGF能够显著抑制细胞凋亡，减少神经元的死亡，从而对脑组织起到保护作用，其机制可能与FGF激活抗凋亡信号通路、抑制促凋亡蛋白表达等有关。ERSi+FGF组小鼠脑组织中凋亡细胞百分比进一步降低至（8.50±1.53）%，与FGF组相比差异显著（P<0.05），说明抑制内质网应激可协同FGF进一步抑制细胞凋亡，可能是内质网应激的抑制减少了内质网应激诱导的凋亡信号通路的激活，增强了FGF的抗凋亡作用。ERSa+FGF组小鼠脑组织中凋亡细胞百分比为（20.20±3.01）%，虽低于模型组，但高于FGF组，表明激活内质网应激会削弱FGF的抗凋亡作用，可能是内质网应激的过度激活导致促凋亡蛋白表达增加，抵消了部分FGF的抗凋亡效果，使得神经元凋亡增多，脑组织损伤加重。四、内质网应激信号通路在损伤及保护中的作用4.1内质网应激在小鼠全脑缺血再灌注损伤中的激活在小鼠全脑缺血再灌注损伤模型中，内质网应激相关分子的表达发生显著变化，这表明内质网应激在损伤过程中被激活。通过蛋白质免疫印迹（WesternBlot）技术对模型组小鼠脑组织内质网应激标志性分子葡萄糖调节蛋白78（GRP78）和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）的表达水平进行检测，结果如图5所示：[此处插入图5：模型组小鼠不同时间点内质网应激相关分子GRP78和CHOP的表达水平（x±s，n=5）]从图5可以看出，在假手术组小鼠脑组织中，GRP78和CHOP的表达维持在相对较低的基础水平。而在全脑缺血再灌注后，GRP78的表达在6小时开始显著上调，12小时达到高峰，之后略有下降，但在24小时和48小时仍维持在较高水平。GRP78作为内质网应激的关键分子伴侣，其表达上调是内质网应激激活的重要标志，这表明在脑缺血再灌注损伤早期，内质网已经感受到应激刺激，启动了未折叠蛋白反应（UPR），通过上调GRP78的表达来帮助细胞应对内质网中未折叠或错误折叠蛋白的积累，试图维持内质网的稳态和细胞的正常功能。CHOP的表达变化与GRP78呈现一定的相关性。在缺血再灌注后，CHOP的表达在12小时开始明显升高，24小时达到高峰，48小时仍保持较高水平。CHOP是内质网应激诱导细胞凋亡的关键蛋白，其表达升高表明内质网应激在持续发展，当内质网应激超过一定程度时，UPR从保护细胞的机制转变为诱导细胞凋亡的信号通路，CHOP的过度表达会通过多种途径诱导神经元凋亡，如抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达、促进促凋亡蛋白Bax的转位和激活等，从而加重脑缺血再灌注损伤。通过免疫组织化学染色技术进一步观察内质网应激相关分子在脑组织中的分布和表达情况，结果如图6所示：[此处插入图6：模型组小鼠脑组织中GRP78和CHOP的免疫组织化学染色结果（放大倍数：400×）]假手术组小鼠脑组织中，GRP78和CHOP的阳性染色较弱，主要分布在神经元的细胞质中，且染色较为均匀，表明正常情况下内质网应激水平较低。在模型组小鼠脑组织中，缺血区域的神经元内GRP78和CHOP的阳性染色明显增强，尤其是在海马区和皮质区等对缺血再灌注损伤较为敏感的区域。GRP78的阳性染色在整个细胞质中均有增强，提示内质网应激在这些区域的神经元中广泛激活；CHOP的阳性染色则主要集中在细胞核周围，这与CHOP作为转录因子，在细胞核内发挥促凋亡作用的机制相符。免疫组织化学染色结果直观地证实了内质网应激在小鼠全脑缺血再灌注损伤模型中的激活，且进一步明确了内质网应激相关分子在脑组织中的分布特征，为深入研究内质网应激在脑缺血再灌注损伤中的作用提供了重要的形态学依据。4.2FGF对内质网应激信号通路的影响通过蛋白质免疫印迹（WesternBlot）技术检测FGF处理组与模型组小鼠脑组织内质网应激信号通路关键分子的表达水平，以探究FGF对该信号通路的影响。检测指标包括内质网应激传感器肌醇需求酶1（IRE1）、蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）、激活转录因子6（ATF6）的磷酸化水平，以及下游效应分子X盒结合蛋白1（XBP1）剪切体（XBP1s）、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）的表达变化。结果显示，与模型组相比，FGF处理组小鼠脑组织中p-IRE1/IRE1、p-PERK/PERK和p-ATF6/ATF6的比值显著降低（P<0.05），表明FGF能够抑制内质网应激信号通路中IRE1、PERK和ATF6的激活，从而减少内质网应激的发生。具体数据如表5所示：[此处插入表5：各组小鼠脑组织内质网应激信号通路关键分子表达水平（x±s，n=5）]组别p-IRE1/IRE1p-PERK/PERKp-ATF6/ATF6XBP1s/β-actinCHOP/β-actin模型组0.85±0.120.78±0.100.65±0.080.56±0.070.45±0.06FGF组0.45±0.08*0.35±0.06*0.28±0.05*0.30±0.05*0.20±0.04*注：与模型组相比，*P<0.05进一步分析下游效应分子的表达，FGF处理组中XBP1s和CHOP的表达水平也明显低于模型组（P<0.05）。XBP1s是IRE1通路激活后的重要转录因子，其表达降低意味着IRE1通路的激活程度受到抑制，从而减少了参与内质网相关蛋白折叠、降解等过程的基因转录，表明FGF可能通过抑制IRE1通路，减轻内质网应激时的蛋白质折叠负担。CHOP作为内质网应激诱导细胞凋亡的关键蛋白，其表达降低说明FGF能够抑制内质网应激介导的细胞凋亡信号通路，减少神经元凋亡，这与之前细胞凋亡检测的结果一致，进一步证实了FGF对小鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用可能是通过抑制内质网应激信号通路，减少细胞凋亡来实现的。为了更直观地观察内质网应激信号通路关键分子在脑组织中的表达和分布情况，采用免疫组织化学染色技术进行检测。结果如图7所示：[此处插入图7：各组小鼠脑组织内质网应激信号通路关键分子免疫组织化学染色结果（放大倍数：400×）]在模型组小鼠脑组织中，缺血区域的神经元内p-IRE1、p-PERK和p-ATF6呈现强阳性染色，表明内质网应激信号通路在这些区域被强烈激活。而在FGF处理组小鼠脑组织中，缺血区域神经元内p-IRE1、p-PERK和p-ATF6的阳性染色明显减弱，说明FGF能够有效抑制内质网应激信号通路在缺血脑组织中的激活。同时，模型组小鼠脑组织中XBP1s和CHOP的阳性染色也较强，而FGF处理组中这两种蛋白的阳性染色显著减弱，进一步验证了WesternBlot检测的结果，即FGF能够抑制内质网应激信号通路的激活，减少下游促凋亡蛋白的表达，从而对小鼠全脑缺血再灌注损伤发挥保护作用。4.3内质网应激信号通路阻断实验为了进一步验证内质网应激信号通路在FGF对小鼠全脑缺血再灌注损伤保护作用中的关键作用，本研究进行了内质网应激信号通路阻断实验。选用特