2025年和双缩脲试剂法测定蛋白质含量实验步骤详解

南方li新大学

生物化学试验汇报

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生物化学与分子生物学试验教学中心

试验名称蛋白质含量测定——双缩服试剂法

试验日期试验地点

合作者指导老师

评分教师签名批改日期

一、试验目的

1.1.掌握双缩腺测定血清总蛋白的基本原理、操作：

1.2.掌握双缩服试剂的配制；

1.3.熟悉血清总蛋白的临床意义：

1.4.理解双缩腺法测定血清总蛋白的特点和注意事项。

二、试验原理

2.1.两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩胭（H2N-OC-N1HX）7H2）,因分子内具有两个邻接

的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩眠反应，生成紫红色络合物。

2.2.蛋白质分子具有大量彼此相连的肽键（-C07H-）,同样能在碱性条件下与Cu2+发生

双缩眠反应，生成的紫红色络合物，旦在540nni处的吸光度与蛋白质的含量在10〜120g/L范围

内有良好的线性关系。

三、材料与措施：

3.1.试验材料：

3.1.L试验试剂:①小牛血清:②6.Omol/LNaOH溶液：③双缩腺试剂：硫酸酮、酒石酸钾

钠、碘化钾；④蛋白质原则液（70g/L）；⑤0.舞NaCl；⑥蒸储水。

3.1.2.试验器材：①试管；②烧杯；③容量瓶：④加样枪；⑤刻度吸管；⑥玻璃棒

:⑥1100分光光度计；⑦电子天平：⑧水浴锅。

3.2.试验环节

取3支试管，做好标识，按下表操作：、

加入物（ml）B（空白）S（原则）U（待测）

小牛血清（1:10）==075

蛋白质原则液（1:10）0.5

0.9%Nacl0.5

双缩胭试剂4.04.04.0

广__a.各市湿匀，观测各试管颜色;X

b.将各试管置于37℃水浴锅中加热20min,观测颜色：

c.将试管中的液体倒入比色杯中，置于1100分光光度计的洋品槽内，在波长540nm,以空

白管调零，测S和U管吸的光度；

d.测定结束后，将比色杯中的样品回收进试管。

VJ

A

血清总蛋白（g/L）=--x蛋白质标准液浓度（g/L）

根据公式算出成果：As

四、成果与讨论:

4.1.试验现象：

①选用三支洁净无损的试管，从左往右依次加入0.9%氯化钠溶液、蛋白质原则液、对应的

小牛血清各0.5ml,分别命名为B试管、S试管和U试管，再分别向三支试管内加入4ml的双缩

脉试剂，溶液均成蓝色透明状。

②将三支试管放入37℃水浴锅中加热20min,取出后，B试管呈淡蓝色，S试管和U试管均

成浅紫色，且S试管的颜色比U试管的颜色深。（如图-）

图一水浴后三支试管颜色图二分光计读数

4.2.试验数据

---------------------------

管号_____平均吸光度

管号123

S().1850.1840.1850.1847

U0.1520.⑸0.1520.1517

成果计算：代入公式：血清总蛋白(g/L)=(Au/As)X蛋白质原则液浓度(g/L),得出成果:

血清总蛋白-57.493g/L。

4.3.成果讨论

经查阅资料得：正常成人血清总蛋白含量为60〜80g/L,而小牛血清总蛋白含量比正常成

人血清总蛋白含量略低一点，本次成果得出小牛血清总蛋白含量为57.493g/L,符合状况。

4.3.1.成功原因:

①本次试验的试剂混合水浴后出现r预期效果：B试管呈淡蓝色，s试管和u试管均成浅紫

色，且S试管的颜色比U试管的颜色深。B试管呈淡蓝色是由于B试管中没有发生任何反应，

因此展现双缩服试剂本来的淡蓝色，而S试管和U试管呈浅紫色是由于试剂中的蛋白质和双缩

服发生了双缩股反应而呈浅紫色。

②吸光度测试后得到的数据，经计算后得到了预期中的成果，是由于前面操作严谨。

4.3.2.误差分析

①三次反复测定过程中出现了某些浮动数据，也许是由于仪器自身存在的可容许的误差范

围。

②第一次尝试使用分光光度计的时候得到了负值，经杳明是由于放置在其内的比色杯将磨

面对准了通光而，经调整后，获得了对的的数据。

4.4.课后复习题

4.4.1.什么叫双缩服试剂？为何要在双缩麻试剂中加入酒石酸钾钠和碘化钾？

答：双缩腺试剂是一种用于鉴定蛋白质的分析化学试剂，碰到蛋白质显紫色。它是一种碱

性的含铜试液，呈蓝色，由0.1g./ml氢氧化钠或氢氧化钾、0.Olg/ml硫酸铜和酒石酸钾钠配制。

疏酸铜、酒石酸钾钠的碱性溶液中会生成紫红色络合物，在这种比例的碱性水溶液中，本来形成

的Cu(0H)2会与溶液中多出的OH-形成[Cu(0H)4]2-络离子，酒石酸钾钠的作用就是保护这种

络离子不被析出变为沉淀，向试剂中加入碘化钾,可延长试剂的使用寿命。

4.4.2.试剂配制过程中,为何NaOH要单独配制,最终加入?

答：先单独加入NaOH溶液是为了营造一种碱性环境,在碱性环境下双缩胭试剂B中的Cu2+

与蛋白质肽键络合产生颜色反应假如先将双缩腺试剂A与双缩腺试剂B混合,即NaOH与CuS04

溶液混在一起,那么就会产生C