2026届新高考生物三轮冲刺复习PCR及电泳技术

黑龙江省安达市田家炳高级中学2026届新高考生物三轮冲刺复习PCR及电泳技术PCR与电泳技术PCR技术电泳技术产物鉴定条件过程含义基本原理仪器产物鉴定应用发展扩展应用操作步骤含义原理应用扩展PCR技术的条件原因含义设计原则用途相关计算酶引物原料能量PCR技术的条件含Mg2+的反应缓冲液、适宜的温度、pH等PCR的发展第一代PCR普通PCR第二代PCR实时荧光定量PCR（qPCR）第三代PCR数字PCR（dPCR）PCR技术的扩展应用电泳技术不对称PCR反转录PCR（RT-PCR）反向PCR巢式PCR其它PCR重叠延伸PCR大引物PCRPCR技术的含义是聚合酶链式反应的缩写。它是根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。PCR技术的基本原理是在体外模拟细胞内DNA复制的相关条件，最终完成特定基因的体外复制。PCR的原料名称：是三磷酸脱氧核苷的简称。结构：每个dNTP分子是由一分子脱氧核苷酸与两个磷酸基通过特殊的化学键连接而成。种类：根据碱基的不同，dNTP包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP等。dNTPPPP～～脱氧核苷(用dN表示)脱氧核糖磷酸基团磷酸基团磷酸基团3个(用T表示)特殊的化学键碱基(ATGC)PCR的原料作用：在DNA复制或PCR过程中，DNA聚合酶可以直接水解下来两个磷酸，释放能量，生成dAMP（脱氧核苷酸），并且把它连在DNA链上。因此，在PCR过程中，dNTP既能提供原料，也能为脱氧核苷酸的连接提供能量。PPP～～P+PP～+能量水解dNTPdAMP（脱氧核苷酸）PPiPCR的能量来源解旋：断裂氢键的能量来自PCR仪的加热，90℃~95℃。原料连接：能量来源于Taq酶聚合基本单位dNTP加入到延伸链的3'端与上一个核苷酸形成磷酸二酯键时释放一个焦磷酸PPi，焦磷酸不稳定极易水解，释放能量并产生磷酸，这两个反应互相偶联，推动Taq酶聚合单体延伸DNA分子。CTG5′3′PPP～～P+PP～+能量水解dNTPdAMP（脱氧核苷酸）PPiPi水解+能量PiPCR所需的酶耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）PCR所需的引物原因：无论在体内还是体外，DNA分子复制均需要DNA聚合酶，DNA聚合酶不能从头开始，必须从一小段已经存在的核酸（DNA或RNA）开始，把新的核苷酸添加到该段核酸的3'-OH上，也就是说DNA聚合酶只能延长一段核酸链的3'端，而引物就提供了这段核酸链的3'-OH，所以，DNA分子复制时需要引物。PCR所需的引物含义：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。PCR中的引物是一段特定的DNA序列，长度通常为20~30个核苷酸。一般有两个（一对），分为上游引物和下游引物，分别指导DNA两条链的聚合。说明：体内DNA复制的引物是由小段的RNA来提供的，在体外PCR试验中则用DNA，是人工设计合成。原因是RNA引物需要被切除，而PCR仪中没有这种酶，再说，若用的RNA引物被切除后将使这个新合成的DNA的两端都出现了一段单链而不稳定。PCR所需的引物设计原则：PCR反应需已知目的基因两端核苷酸序列设计两种引物：①引物的长度一般在18~25bp：太短则特异性不够强；过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TagDNA聚合酶进行反应。②引物G+C含量以40%-60%为宜，4种碱基最好随机分布。G+C太少：与模板DNA链结合的氢键少，结合力小，扩增效果不佳；G+C过多：可导致引物自身之间形成二聚体或多聚体，会降低扩增效率，同时需要更高的退火温度，进而增加实验成本。。③引物内部不能配对形成双链结构（发卡结构）；两个引物间不能配对结合。④引物的延伸是从3'端启动的，不可进行任何修饰。而5'端决定PCR产物的最终长度，对扩增特异性影响小，通常可添加酶切位点、启动子序列等修饰。等等。PCR所需的引物用途：①检测目的基因原理：引物与目的基因的结合具有特异性，利用特定引物与可能含目的基因的DNA混合进行PCR。如果DNA含有目的基因，则可通过PCR扩增获得目的基因。如果DNA不含目的基因，则引物不会和目的基因结合，或结合非特异性片段，不会扩增获得目的基因。应用：可在基因工程中检测特定DNA分子。PCR所需的引物用途：②添加酶切位点原理：由于引物延伸从3'端开始，3'端不能进行任何修饰，引物5'端对扩增特异性影响不大，因此，可给予修饰而不影响扩增特异性。若在引物的5'末端添加一段额外的酶切序列，尽管其不能和模板链互补结合，但可以作为子代DNA的一部分，从而使子代DNA出现额外的酶切位点。应用：对目的基因进行编辑，改变蛋白质结构和对应性状。PCR所需的引物用途：③诱变DNA分子原理：引物会成为子代DNA分子的一部分，如果改变引物的序列，使其能与模板DNA结合，但个别碱基不与模板互补配对，就能获得碱基改变的子代DNA分子。应用：对目的基因进行编辑，改变蛋白质结构和对应性状。PCR所需的引物PCR循环时与引物相关的计算：PCR经过n次循环产生的DNA数为2n，一共有2n+1条链，其中：有2条链是DNA母链，不含引物其他的每1条链均含1个引物，并且2种引物的数量相等故PCR过程经过n次循环，需要的：引物总个数是2n+1－2，某一种引物的总个数是（2n+1－2）×（1/2）＝2n－1。一个DNA由1条母链和第1种引物延伸的子链组成，另一个DNA由另1条母链和第2种引物延伸的子链组成，其他的DNA均由2种引物延伸的2条子链组成。PCR的过程扩增的过程变性(90℃以上)目的基因DNA受热变性后解为单链PCR的过程扩增的过程复性(50℃左右)两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合50℃PCR的过程扩增的过程延伸(72℃左右)溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则加到引物的3’端，合成新的DNA链。72℃PCR的过程扩增的过程重复第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物。PCR的过程扩增的过程重复第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环的产物。PCR的过程扩增的过程重复循环多次。目的基因的量成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。PCR的仪器在PCR扩增仪（PCR仪）中自动完成PCR产物的鉴定完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物PCR的应用用于目的基因的获取、基因克隆、DNA测序、基因表达分析、遗传疾病诊断、病原体检测等。实时荧光定量PCR（qPCR）原理：在PCR反应体系中加入荧光基团，通过监测荧光信号的变化实时检测PCR进程，从而对起始模板进行定量分析。进行qPCR时，在反应体系加入Taqman探针，Taqman探针两端连有荧光基团（R）和抑制荧光发出的淬灭基团（Q），完整的Taqman探针不发出荧光，当探针被水解后R基团会发出荧光，随循环次数的增加，荧光信号强度增加。应用：可用于监测DNA复制的数量，qPCR可以与RT-PCR结合，对病毒核酸进行检测。数字PCR（dPCR）原理：同传统的PCR相比，数字PCR增加了对反应体系进行分隔的操作，将几十微升的反应体系分隔成了数万个微小独立的反应体系，核酸模板在这种分隔过程中被充分稀释，理想状态下每个微液滴中含有1个分子的核酸模板，扩增完成后对所有的液滴进行荧光信号识别并计数，计算出阴性和阳性反应的数量，通过统计计算靶标分子的浓度，从而实现靶标分子的绝对定量。应用：可用于监测DNA复制的数量，qPCR可以与RT-PCR结合，对病毒核酸进行检测。反转录PCR（RT-PCR）原理：先以RNA为模板，在逆转录酶作用下合成cDNA的第一条链，再以cDNA的第一条链为模板进行PCR扩增。应用：主要用于分析基因的转录水平，常用于研究基因在不同组织、不同发育阶段或不同生理条件下的表达情况，也可用于RNA病毒的检测。反向PCR原理：反向PCR是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，与常规PCR相比，反向PCR扩增的方向相反，且扩增的DNA序列是未知的。过程是先将已知序列两端的未知DNA片段进行环化，然后用与已知序列反向互补的引物进行PCR扩增，从而获得未知序列。由于热稳定DNA聚合酶没有把DNA链连接成环的特点，因此得到的子链是链状的。应用：可对未知DNA片段进行扩增，研究其基因序列等信息。不对称PCR原理：不对称PCR的基本原理是采用不等量的一对引物，经若干次循环后，低浓度的引物被消耗尽，以后的循环只产生高浓度引物的延伸产物，结果产生大量的单链DNA。应用：产生单链DNA，用于做测序模板、杂交探针等。巢式PCR原理：采用两对引物进行两轮PCR扩增，第一轮PCR的产物作为第二轮PCR的模板，第二轮引物的结合位点在第一轮引物的内侧，可提高扩增的特异性和灵敏度。应用：适用于模板含量较低或特异性要求较高的情况，如微量病原体检测、法医鉴定、古代DNA分析等。应用：①基因融合：将两个或多个基因片段连接在一起，生成融合基因，常用于研究蛋白质的功能和相互作用。②定向突变：通过引入特定突变的引物，来研究基因突变对蛋白质功能的影响。③标签引入：在基因末端引入标签序列，便于后续的蛋白质纯化和检测。重叠延伸PCR原理：拼接两个或多个DNA序列，可以使用末端可以连接的特殊引物。设计引物使一个DNA分子的5'端重复序列与另一个DNA分子的3'端有同源互补序列，从而使子代DNA获得其他DNA的同源序列。在后续循环延伸的过程中，具有同源序列的两个DNA单链末端互补桥接，DNA聚合酶会沿着桥接上的长DNA单链补全碱基，从而形成完整的拼接后DNA双链。应用：用于基因定点突变的技术，具有高效、准确等优点，在基因功能研究、蛋白质工程、基因治疗等多个领域有广泛应用。大引物PCR原理：大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。PCR技术的其它拓展应用如多重PCR、降落PCR等电泳技术的含义凝胶电泳是根据分子大小、所带电荷和其他一些物理性质将大分子物质（如核酸或蛋白质）分离开的一种方法。电泳技术的原理DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动。说明：凝胶电泳中DNA分子移动的方向：DNA具有可解离的酸性和碱性基团，在溶液中会发生解离而带电。溶液的pH不同，DNA带电情况也不相同。当溶液的达到某种物质的等电点（pI）时，该物质所带净电荷为零，呈电中性。一般而言，碱性溶液的大于pI，物质带负电荷，在电场中会向正极移动；而酸性溶液的pH小于pI，物质带正电荷，在电场中会向负极移动。DNA分子的pI在4~4.5之间，而琼脂糖凝胶电泳常用缓冲液的一般在6~9之间，此时，缓冲溶液的pH大于DNA的pI，DNA带负电荷。因此，在凝胶电泳时DNA分子会由负极向正极移动。电泳技术的原理不同大小的DNA分子一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。凝胶的摩擦力是分子前进的阻力。动力与摩擦力共同作用，可将DNA分子按大小分离开。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。说明：为什么在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关？琼脂糖凝胶是一种带孔的筛网状多聚物。琼脂糖浓度会影响凝胶筛孔的大小，进而影响DNA分子的迁移速率。凝胶浓度越小，筛孔越大DNA分子迁移速率就越高；凝胶浓度越大，筛孔越小，DNA分子迁移速率就越低。电泳技术的原理不同大小的DNA分子一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。凝胶的摩擦力是分子前进的阻力。动力与摩擦力共同作用，可将DNA分子按大小分离开。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。说明：为什么在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关？DNA分子的大小也会影响迁移速率。当凝胶浓度相同时，较大的DNA分子因体积大，所占据的空间大，在穿过凝胶孔隙时会遇到较大的阻力，穿过孔隙相对困难，迁移速率低。反之，迁移速率就高。电泳技术的原理不同大小的DNA分子一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。凝胶的摩擦力是分子前进的阻力。动力与摩擦力共同作用，可将DNA分子按大小分离开。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。说明：为什么在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关？分子大小相同但构象不同的DNA片段，迁移速率也不相同。例如，pUC19质粒3种构象的迁移速率不尽相同。超螺旋的共价闭合环状质粒DNA（cccDNA）有效体积小，穿过凝胶孔隙时遇到的阻力小，迁移速率快。当共价闭合环状质粒DNA的两条链断裂后形成线状DNA（LDNA）的构象，迁移速率较慢；当共价闭合环状质粒DNA的1条链裂时，会形成开环质粒DNA（ocDNA）的构象，迁移最慢。电泳技术的原理凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。电泳技术的操作步骤制备琼脂糖溶液：根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。说明：电泳缓冲液的作用：电泳缓冲液可以使溶液具有一定的导电性，有助于DNA分子的迁移。核酸染料的作用：由于DNA分子本身没有颜色，需要将电泳结果用核酸染料处理后放在紫外线投射仪等特定仪器下才能观察到。电泳技术的操作步骤制备凝胶：将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具。插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子。取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。电泳技术的操作步骤加样：将待检测的DNA样品与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。说明：凝胶载样缓冲液（内含指示剂）的作用：凝胶载样缓冲液（内含指示剂）是在加样之前与待电泳的样本相混合的一种缓冲液。指示剂能够显示电泳进程，指示终止电泳的时间。还能显示加样孔是否加样。电泳技术的操作步骤加样：将待检测的DNA样品与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。说明：留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物的作用：凝胶电泳时用到的标准参照物是DNA标记（DNAMarker），它含有若干组碱基对数目已知且具有一定梯度变化的DNA片段。DNAMarker和样本DNA同时进行凝胶电泳，通过对比两者的迁移速率，可以大致估计样本DNA的大小，还可以通过对比条带的亮度，粗略估计样品中DNA的含量。电泳技术的操作步骤电泳：接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。观察记录：取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。电泳技术的应用PCR扩增产物的鉴定PCR产物的鉴定是分子生物学实验中的关键步骤，用于确认扩增产物是否符合预期。电泳分析是常用的鉴定方法之一。该方法通过将PCR产物在琼脂糖凝胶中电泳分离，根据DNA片段的大小进行鉴定。溴化乙锭（EB）染色后，在紫外光下观察荧光带，判断产物大小是否与预期一致。电泳技术的应用目的基因的检测根据目的基因的序列设计引物，采用PCR技术对目的基因进行扩增，如果能扩增出目的基因片段，说明目的基因已整合到受体细胞中。如对除草剂基因的检测，就可以根据除草剂基因的序列设计引物，然后提取受体细胞的基因组DNA，进行PCR扩增，根据电泳扩增条带的有无，判断目的基因是否整合到受体生物基因组中。电泳技术的应用推断个体的基因型：下图（图片来自2020年山东高考题）表示某种单基因遗传病的家系图和各家庭成员基因检测的结果。检测过程中用限制酶处理相关基因得到大小不同的片段后进行电泳，电泳结果中的条带表示检出的特定长度的酶切片段，数字表示碱基对的数目。请根据遗传家系图和电泳结果图推断各家庭成员的基因型。答案：Ⅰ1和Ⅰ2：都是Aa，Ⅱ3号：aa，Ⅱ4：AA电泳技术的应用遗传病的基因诊断：如对镰刀型细胞贫血症胎儿出生前的基因组型分析：已知正常个体基因型为BB、Bb，镰刀型细胞贫血症患者基因型为bb。妊娠早期核酸分子杂交诊断和结果如图。从图中可见，该病的产生是由于A变成T导致。正常基因该区域有3个酶切位点，突变基因只有2个酶切位点。电泳技术的应用遗传病的基因诊断：经限制酶切割后，凝胶电泳分离酶切片段，与探针杂交后可显示出不同的带谱，正常基因显示2条，突变基因显示1条。根据凝胶电泳带谱分析可以确定胎儿Ⅱ2患有镰刀型细胞贫血症，且胎儿IIl～II4

的基因型分别为BB、bb、Bb、BB。电泳技术的应用基因定位利用分子学手段进行基因定位，如简单重复序列DNA标记（SSR）、限制性片段长度多态性标记（RFLP）、单核苷酸酸多态性（SNP）等，它们都是通过非基因片段作为标记进行基因定位。下面介绍通过简单重复序列DNA标记（SSR）的方法进行基因定位。电泳技术的应用简单重复序列（SimpleSequenceRepeat，SSR），又称微卫星序列，指基因组中由1-6个核苷酸组成的串联重复序列，如GAGAGA……，广泛分布在各种真核生物基因组中。微卫星的突变率在不同物种、同一物种的不同位点或同一位点的不同等位基因间存在很大差异。不同的基因带有不同的SSR标记，PCR扩增后，电泳后的结果也不相同，如下图所示：根据不同的基因和不同的SSR标记连锁情况，通过PCR扩增后，电泳后条带的不同位置来确定基因的位置。拓展——蛋白质电泳技术原理：蛋白质电泳技术是根据蛋白质带电量或分子量的大小把不同的蛋白质分开，起到分离纯化的效果。应用：该项技术是一种分析液体或提取物中蛋白质的方法，可用于蛋白质的分离、分子量测定和纯度鉴定等。实战演练为研究干旱胁迫基因LEA和VOC对甘蓝型油菜油脂的积累机制，科研人员构建了两个基因表达载体。其中基因LEA与荧光素酶基因（Luc）构建成基因表达载体甲，基因VOC和标记基因构建成基因表达载体乙，相关序列及酶切位点如图所示。箭头表示转录方向。

（1）利用PCR扩增LEA基因时，需要在引物的____（填“3′端”或“5′端”）添加限制酶识别序列，添加序列对应的限制酶是______________，选择上述酶的依据是_________________________________。（2）为了构建基因表达载体甲，依据图中已知碱基序列，在PCR扩增仪中加入的引物的碱基序列为____________________和____________________，扩增___代后会得到等长的8条DNA片段。5′端EcoRⅤ和XbaⅠLuc中存在BamHⅠ识别序列，BamHⅠ会将Luc切断；一种酶切会导致载体、LEA自身环化及LEA反向连接5′GATATCATGGGC3′5′TCTAGACTAGTG3′4PCR体系中加入的物质都会影响DNA的扩增，不同阶段的温度设置也会对产物的形成产生直接影响。下列叙述错误的是（）A.若a个DNA扩增n次，需要的引物数量至少是a（2n+1－2）B.不同引物之间、引物自身的片段不能互补配对C.引物中G和C的含量会影响复性时引物与模板链的正常结合D.PCR反应体系中共需加入DNA模板、2种引物、耐高温的DNA聚合酶三类物质实战演练D“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。下列叙述错误的是（）

A．第一轮复制得到2个DNA分子，即①②各一个B．第二轮复制得到4个DNA分子，即①②③④各一个C．第四轮复制得到16个DNA分子，其中有4个X基因D．经五轮循环后产物中有五种不同的DNA分子实战演练C（2021·全国甲卷）PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：（1）若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是_________（用数字序号表示）。（2）操作③中使用的酶是_________________________。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、_____三步，其中复性的结果是___________________________________。（3）为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与___________特异性结合。（4）PCR（多聚酶链式反应）技术是指_____________________________________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。实战演练④②③①Taq酶（热稳定DNA聚合酶）延伸引物通过碱基互补配对与单链DNA结合病原菌DNA在生物体外大量快速扩增特定DNA片段的技术（1）结合图1和图2分析，“荧光RT-PCR技术”所用的试剂盒中通常都应该含有________酶、____________酶、Taqman探针、引物、dNTP、Mg2＋、缓冲剂等。这种分子层面的荧光RT-PCR检测具有特异性和灵敏性都很高的特点，主要与试剂盒中的____、___________有关。“实时荧光定量qPCR”是新冠疫情防控的一把利刃，通常在1～2h内即可得到检测结果。Taqman探针是实时荧光定量RT-PCR技术中的一种常用探针（如图1），其5′端连接荧光基团（R），3′端连接淬灭剂（Q）。当探针完整时，R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过程中，当TaqDNA聚合酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q，R发出的荧光信号被相应仪器检测到，荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步（如图2）。请据图回答下列问题：实战演练逆转录TaqDNA聚合引物Taqman探针（2）根据Taqman探针功能分析，探针中碱基序列的设计应主要依据____________________。新冠病毒是冠状病毒大家庭中新的一员，其碱基序列与引起SARS的冠状病毒碱基序列有79.5%的相似性，与流感病毒碱基相似度也较高，因此在设计Taqman探针时应筛选出该病毒特有的序列，以避免_______（填“假阴性”或“假阳性”）的出现。“实时荧光定量qPCR”是新冠疫情防控的一把利刃，通常在1～2h内即可得到检测结果。Taqman探针是实时荧光定量RT-PCR技术中的一种常用探针（如图1），其5′端连接荧光基团（R），3′端连接淬灭剂（Q）。当探针完整时，R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过程中，当TaqDNA聚合酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q，R发出的荧光信号被相应仪器检测到，荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步（如图2）。请据图回答下列问题：实战演练假阳性新冠病毒RNA内部的一段序列（或新冠病毒RNA逆转录形成的DNA的部分序列）（3）根据图1和图2，TaqDNA聚合酶除了能催化DNA子链的延伸，还能________________。“实时荧光定量qPCR”是新冠疫情防控的一把利刃，通常在1～2h内即可得到检测结果。Taqman探针是实时荧光定量RT-PCR技术中的一种常用探针（如图1），其5′端连接荧光基团（R），3′端连接淬灭剂（Q）。当探针完整时，R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过程中，当TaqDNA聚合酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q，R发出的荧光信号被相应仪器检测到，荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步（如图2）。请据图回答下列问题：实战演练催化RNA（Taqman探针）的水解（4）若每分子探针水解释放的R基团荧光强度为定值a，则反应体系中某时刻荧光信号强度（Rn）主要与_________、___________________________________________有关。在检测过程中，随着PCR的进行，反应产物不断累积，“杂交双链”荧光信号的强度也等比例增加，增加了检测结果的准确性，一般要达到或超过阈值时才确诊。可通过荧光强度的变化监测产生量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图（如图3）。“平台期”出现的最可能的原因是试剂盒中_____等有限，超出一定的循环数后，荧光标记的“杂交双链”不再增加。实战演练扩增次数样品中病毒初始数量（或病毒样品模板RNA含量）原料、引物和探针数量（或TaqDNA聚合酶活性）（5）虽然荧光RT-PCR是当前被广泛认可的检测手段之一，但是不断有“假阴性”现象报道，通过上述过程分析，“假阴性”的可能原因有____（填字母）。a．通过咽拭子取样不规范或取样所获样本量不足b．在样本运输、检测中出现了损坏和污染c．病毒相应关键序列发生了基因突变实战演练abc下图为数字PCR技术的原理示意图，下列相关叙述错误的是（）

A.PCR每一循环包括变性、退火和延伸三步B.每个反应单位中都含有耐高温的RNA聚合酶C.每个反应单位有无荧光取决于是否含有靶分子D.数字PCR技术有利于提高病原体检测的灵敏度实战演练B反转录PCR又称逆转录PCR（RT-PCR），是以mRNA为模板进行的特殊PCR，过程如图。下列相关叙述错误的是（）A．图示过程需要控制温度，否则可能得不到产物B．RT-PCR技术中，不需要已知mRNA的全部序列C．过程③中子链沿着模板链的5′→3′方向延伸D．RT-PCR技术可应用于是否被RNA病毒感染的检测实战演练C农杆菌Ti质粒上的T-DNA可以转移并随机插入到被侵染植物的染色体DNA中。研究者将下图中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定T-DNA插入的具体位置。下列说法不正确的是（）

注：子链从引物的3′端开始延伸。A.PCR扩增依据的是DNA分子双链复制的原理B.进行PCR扩增需要耐高温的DNA聚合酶C.利用图中的引物②③组合可扩增出两侧的未知序列D.通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T-DNA的插入位置实战演练CA．用不对称PCR方法扩增目的基因时，不需要知道基因的全部序列B．进行最初若干次循环的目的是增加模板DNA的量C．最后大量获得的ssDNA与图中乙链的碱基序列一致D．因为双链DNA和单链DNA的分子量大小不同，可通过电泳方法将其分离不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA（ssDNA）的方法，如图所示。不对称PCR中加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物，两者的比例通常为1∶100，PCR反应最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA（dsDNA），但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。下列相关说法错误的是（）实战演练CA．巢式PCR中加入的组分与常规PCR相同，但扩增产物比常规PCR特异性更强B．两套引物需要进行两次PCR，由于和两套引物都互补的靶序列较少，因此大大提高了扩增的特异性C．内引物扩增的模板是外引物扩增后的产物，第二阶段反应能否进行，也是对第一阶段反应正确性的鉴定D．如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率将会增加（不定项）为减少引物与模板之间的非特异性配对，人们在常规PCR技术的基础上进行了改良，发明了巢式PCR技术。其原理是利用两套PCR引物进行两轮PCR扩增，首先利用第一对引物（外引物）对目的基因所在DNA进行15～30个循环的扩增；第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板，利用第二对引物（内引物或巢式引物）进行15～30个循环扩增，具体过程如图所示。下列叙述正确的是（）实战演练ABCA.上述过程中使用的引物P2和P3的碱基需要完全互补配对B.设计引物的目的是使DNA聚合酶能够从其3′端开始连接脱氧核苷酸C.融合PCR的第二步两条链重叠部位可互为另一条链的引物D.若融合PCR的第三步获得128个融合基因，理论上该过程消耗了254个引物（不定向选择）融合PCR技术采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来。其原理如图所示，据图分析正确的是（）实战演练BCDA．过程②需要含Mg2＋的缓冲液、DNA模板、引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶等B．若引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次DNA分子的复制后，一共会产生2种DNA分子C．经过程④获得的杂交DNA有2种，其中只有一种可以经过程⑤获得目的基因D．过程⑤使用耐高温的DNA聚合酶延伸，不需要引物重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，获得想要的目的基因。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因的特定位点引入特定突变，以实现基因的定点突变，原理如图。下列说法错误的是（）实战演练B（1）在PCR反应体系中，除了需要加入引物和IKKB基因外，还需要加入_______________等。在图1获取突变基因过程中，需要以下3种引物：引物A：5′－CCCCAACCGGAAAGTGTCA－3′（下划线字母为突变碱基）引物B：5′－TAAGCTTCGAACATCCTA－3′（下划线部分为限制酶HindⅢ识别序列）引物C：5′－GTGAGCTCGCTGCCCCAA－3′（下划线部分为限制酶SacⅠ识别序列）则PCR1中使用的引物有______________，PCR2中使用的引物有_____和图中大引物的___（填“①”或“②”）链。IKK激酶由IKKα、KKβ和IKKγ三种亚基组成，该酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷（SCID）患儿IKKB基因编码区第1183位碱基T突变为C，导致IKKβ上第395位酪氨酸被组氨酸代替。为研究该患儿发病机制，研究人员应用大引物PCR定点诱变技术培育出SCID模型小鼠，主要过程如图1、2。回答下列问题：实战演练耐高温的DNA聚合酶、4种脱氧核苷酸引物A和引物C引物B②下列关于凝胶电泳实验操作，叙述错误的是（）A．加样孔应靠近负极端，以便带负电的DNA分子向正极移动B．接通电源后电泳一段时间，离加样孔越近的DNA分子越小C．紫外灯照射下，凝胶上条带的荧光强度与DNA含量呈正相关D．通过观察指示剂在凝胶中迁移的位置来判断何时停止电泳实战演练B某校学习小组进行PCR实验，甲、乙、丙三名同学分别以酵母菌为材料，进行PCR扩增，各取20μL产物进行凝胶电泳，得到的结果如图。下列叙述错误的是（）A．PCR技术可用于检测酵母菌是否含有某种基因B．甲同学扩增得到的DNA量比乙同学多C.丙同学所用的引物可能与甲乙同学的不一样D．丙同学扩增得到的片段比甲乙同学的要大实战演练D用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱。其中1号为DNA标准样液（Marker），10号为蒸馏水，PCR时加入的模板DNA如下图所示。据此作出的分析，不合理的是（）

A．PCR产物的分子大小在250~500bp之间B．3号样品为不含目的基因的载体DNAC．9号样品对应植株不是所需的转基因植株D．10号确定反应体系等对结果没有干扰实战演练B人类白化病是常染色体隐性遗传病。某患者家系的系谱图如图甲。已知某种方法能够使正常基因A显示一个条带，白化基因a则显示为位置不同的另一个条带。用该方法对上述家系中的每个个体进行分析，条带的有无及其位置表示为图乙。根据上述实验结果，回答下列问题：实战演练A（1）条带1代表____基因。个体2~5的基因型分别为____、_