2025年福建省pcr考试试题及答案

2025年福建省pcr考试试题及答案一、单项选择题（每题2分，共30分）1.关于PCR引物设计的基本原则，下列描述错误的是（）A.引物长度通常为18-25个核苷酸B.引物GC含量应控制在40%-60%C.引物3’端尽量避免连续3个G或CD.引物5’端必须与模板严格互补答案：D（引物5’端可添加酶切位点等非模板序列，不要求严格互补）2.实时荧光定量PCR中，Ct值的定义是（）A.荧光信号达到仪器本底噪声时的循环数B.荧光信号进入指数增长期的起始循环数C.荧光信号达到设定阈值时的循环数D.荧光信号达到平台期时的循环数答案：C（Ct值为荧光信号达到阈值时的循环数，是定量的关键参数）3.TaqDNA聚合酶的最适反应温度约为（）A.55℃B.72℃C.95℃D.60℃答案：B（Taq酶的最适延伸温度为72℃，对应DNA链合成的最适条件）4.下列哪种物质可有效减少PCR反应中的非特异性扩增？（）A.增加dNTP浓度B.提高退火温度C.延长延伸时间D.降低Mg²+浓度答案：B（提高退火温度可增强引物与模板的特异性结合，减少非特异性结合）5.进行RT-PCR时，若未去除样本中的基因组DNA，可能导致的结果是（）A.扩增产物长度短于预期B.出现假阴性C.扩增产物包含内含子序列D.荧光信号无明显增长答案：C（基因组DNA含内含子，若未去除，RT-PCR可能扩增出含内含子的DNA片段，导致产物长度异常）6.评价PCR扩增效率（E）的公式为E=10^(-1/斜率)-1，当标准曲线斜率为-3.32时，扩增效率约为（）A.80%B.90%C.100%D.110%答案：C（斜率-3.32时，10^(-1/-3.32)≈2，故E=2-1=100%）7.实验室使用SYBRGreenI染料法进行定量PCR时，熔解曲线出现双峰，最可能的原因是（）A.引物二聚体形成B.dNTP浓度过高C.模板浓度过低D.Taq酶活性不足答案：A（SYBRGreen可结合所有双链DNA，若存在引物二聚体或非特异性产物，熔解曲线会出现多个峰）8.下列关于PCR质量控制的描述，错误的是（）A.阴性对照应无扩增曲线B.阳性对照Ct值应在预期范围内C.内参基因用于校正样本加样量差异D.空白对照需加入模板DNA答案：D（空白对照为无模板的反应体系，用于检测试剂污染）9.扩增人β-actin基因时，若引物跨外显子设计，主要目的是（）A.提高扩增效率B.避免基因组DNA干扰C.增加产物长度D.降低GC含量答案：B（跨外显子引物可区分cDNA（无内含子）与基因组DNA（含内含子），避免基因组污染导致的假阳性）10.PCR反应体系中，Mg²+的主要作用是（）A.稳定引物与模板的结合B.激活TaqDNA聚合酶活性C.防止DNA变性D.提高dNTP溶解度答案：B（Mg²+是Taq酶的辅助因子，直接影响酶活性；浓度过高会增加非特异性扩增）11.某实验室检测新冠病毒核酸时，阳性样本Ct值均大于38，最可能的原因是（）A.样本采集量不足B.扩增程序中变性时间过长C.荧光阈值设置过低D.Taq酶浓度过高答案：A（样本病毒载量低或采集量不足会导致Ct值偏高；阈值过低会使Ct值偏小，变性时间过长可能破坏酶活性，导致无扩增）12.进行多重PCR时，需特别注意（）A.所有引物的Tm值差异不超过5℃B.增加dNTP浓度至0.5mMC.延长延伸时间至2分钟D.使用高保真聚合酶答案：A（多重PCR要求引物Tm值相近，避免因退火温度差异导致扩增效率不一致）13.下列哪种方法可用于PCR产物的定性分析？（）A.实时荧光监测B.琼脂糖凝胶电泳C.标准曲线法D.ΔΔCt法答案：B（电泳可通过条带大小和亮度判断产物特异性和浓度；其余为定量方法）14.保存PCR试剂时，错误的操作是（）A.dNTP分装后-20℃保存B.引物溶解后4℃短期保存C.Taq酶反复冻融D.缓冲液避免光照答案：C（Taq酶反复冻融会导致活性下降，需分装保存）15.某实验中，阳性对照无扩增，阴性对照正常，最可能的故障是（）A.引物失效B.样本污染C.仪器温度失控D.荧光探针降解答案：A（阳性对照无扩增而阴性正常，提示阳性对照体系中的关键成分（如引物、模板）失效）二、多项选择题（每题3分，共30分，少选、错选均不得分）1.影响PCR特异性的因素包括（）A.引物设计B.Mg²+浓度C.退火温度D.循环次数答案：ABCD（引物特异性、离子浓度、退火温度直接影响结合特异性；循环次数过多可能导致非特异性产物积累）2.实时荧光定量PCR的定量方法包括（）A.绝对定量B.相对定量C.终点法定量D.熔解曲线定量答案：AB（绝对定量通过标准曲线，相对定量通过内参比较；终点法和熔解曲线用于定性）3.PCR反应中出现“平台效应”的原因有（）A.dNTP或引物耗尽B.Taq酶活性下降C.产物浓度过高导致复性D.模板浓度过低答案：ABC（平台效应是扩增后期产物积累导致的反应速率下降，与底物消耗、酶活性降低及产物复性有关）4.实验室进行PCR检测时，需遵循的生物安全规范包括（）A.分区操作（试剂准备区、样本处理区、扩增区、产物分析区）B.严格穿戴防护装备（手套、口罩、防护服）C.所有废弃物高压灭菌后处理D.扩增产物直接丢弃答案：ABC（产物分析区需避免气溶胶污染，扩增产物需经处理后丢弃）5.关于RT-PCR的描述，正确的是（）A.需要先将RNA逆转录为cDNAB.可用于基因表达量分析C.逆转录酶需要耐高温D.需使用RNase抑制剂防止RNA降解答案：ABD（逆转录酶通常不耐高温，常用M-MLV或AMV；RNase抑制剂可保护RNA）6.下列情况可能导致PCR假阳性的是（）A.气溶胶污染B.阳性对照与样本同批检测C.移液器未消毒D.样本交叉污染答案：ACD（阳性对照需单独处理，规范操作下不会导致假阳性；气溶胶、移液器污染、样本交叉是常见假阳性原因）7.优化PCR反应的策略包括（）A.梯度PCR确定最佳退火温度B.调整Mg²+浓度（0.5-5mM）C.使用热启动Taq酶D.减少模板量至1pg答案：ABC（模板量过低可能导致无扩增，需根据实验目的调整）8.荧光探针法（TaqMan）的优点有（）A.特异性高于SYBRGreen法B.无需熔解曲线分析C.可用于多重PCRD.对引物设计要求低答案：ABC（TaqMan探针需与目标序列特异性结合，引物设计仍需严格；SYBRGreen法对引物要求更高）9.实验室PCR结果判读时，需排除的干扰因素有（）A.仪器孔间差异B.样本抑制物（如血红蛋白、肝素）C.试剂批次差异D.操作人员技术水平答案：ABCD（均可能影响结果准确性，需通过内参、阳性对照、重复实验排除）10.关于PCR产物纯化，正确的操作是（）A.琼脂糖凝胶电泳后切胶回收B.使用柱式纯化试剂盒去除dNTP和引物C.纯化后的产物可直接用于测序D.纯化效率与产物大小无关答案：ABC（小片段产物纯化效率可能较低，需选择适合的试剂盒）三、判断题（每题1分，共10分，正确填“√”，错误填“×”）1.PCR扩增的特异性主要由引物决定。（）答案：√（引物与模板的特异性结合是决定扩增特异性的关键）2.实时荧光定量PCR中，Ct值越小，模板初始浓度越低。（）答案：×（Ct值与初始模板浓度成反比，Ct值越小，浓度越高）3.热启动Taq酶通过化学修饰或抗体封闭，可减少低温下的非特异性扩增。（）答案：√（热启动酶在变性温度（95℃）下激活，避免退火前引物错配）4.进行PCR时，延伸时间应根据产物长度调整，通常1kb产物延伸1分钟。（）答案：√（Taq酶延伸速率约1kb/分钟，延伸时间需匹配产物长度）5.SYBRGreenI染料法不能区分引物二聚体和目标产物。（）答案：√（SYBRGreen结合所有双链DNA，需通过熔解曲线判断产物特异性）6.RT-PCR中，Oligo(dT)引物只能逆转录带polyA尾的RNA。（）答案：√（Oligo(dT)与mRNA的polyA尾结合，无法逆转录rRNA或tRNA）7.PCR反应体系中，dNTP浓度过高会抑制Taq酶活性。（）答案：√（dNTP可与Mg²+结合，浓度过高会降低游离Mg²+浓度，抑制酶活性）8.扩增产物电泳无条带时，可能是模板中不含目标序列或引物失效。（）答案：√（需通过阳性对照验证引物有效性，排除模板问题）9.多重PCR可同时扩增多个目标基因，因此引物数量越多越好。（）答案：×（引物数量过多会增加非特异性结合风险，需严格优化反应条件）10.实验室PCR结果出现“拖尾”现象，可能是dNTP浓度过高或模板降解。（）答案：√（dNTP过高导致非特异性扩增，模板降解产生大小不一的片段，均会导致电泳拖尾）四、简答题（每题6分，共30分）1.简述PCR技术的基本原理及三个主要步骤。答案：PCR（聚合酶链式反应）是通过酶促反应在体外扩增特定DNA片段的技术。基本原理：利用DNA半保留复制特性，通过高温变性（双链DNA解旋为单链）、低温退火（引物与单链模板结合）、适温延伸（Taq酶催化dNTP沿引物延伸合成新链）的循环，使目标片段呈指数级扩增。三个主要步骤：变性（94-95℃，30秒-1分钟）、退火（50-65℃，30秒-1分钟）、延伸（72℃，时间依产物长度而定）。2.实时荧光定量PCR中，绝对定量与相对定量的区别是什么？各自适用场景是什么？答案：绝对定量通过已知浓度的标准品绘制标准曲线，计算样本中目标基因的绝对拷贝数；相对定量以内参基因（如β-actin）为参照，计算目标基因相对于内参的表达倍数（如ΔΔCt法）。绝对定量适用于需要精确拷贝数的场景（如病毒载量检测）；相对定量适用于比较不同样本间基因表达差异（如药物处理前后的基因表达变化）。3.列举PCR实验中常见的三种污染类型及预防措施。答案：（1）气溶胶污染：PCR产物形成的微小颗粒扩散到环境中，污染后续实验。预防措施：分区操作（扩增区与其他区物理隔离）、使用带滤芯的移液器、定期用紫外线照射实验室。（2）交叉污染：样本间相互污染。预防措施：样本处理时使用一次性吸头、不同样本处理间更换手套、严格按“试剂准备→样本处理→扩增”的顺序操作。（3）试剂污染：试剂（如dNTP、引物）被目标DNA污染。预防措施：分装试剂、使用专用移液器、设置空白对照（无模板体系）监测污染。4.某实验室进行新冠病毒核酸检测时，出现“假阴性”结果，可能的原因有哪些？如何验证？答案：可能原因：（1）样本采集不当（如咽拭子未接触到感染部位）；（2）RNA提取效率低（病毒被灭活或裂解不充分）；（3）扩增体系中存在抑制物（如样本中的血红蛋白、黏液）；（4）引物/探针失效（保存不当导致降解）；（5）扩增程序错误（退火温度过高或延伸时间过短）。验证方法：（1）重复检测同一份样本，观察结果是否一致；（2）检测内参基因（如人RNA酶P基因），若内参无扩增，提示样本质量差或提取失败；（3）用已知阳性样本验证试剂有效性；（4）检查扩增程序设置是否符合标准。5.简述SYBRGreenI染料法与TaqMan探针法的优缺点。答案：SYBRGreen法优点：成本低（无需探针）、操作简单（通用反应体系）；缺点：特异性较低（可结合所有双链DNA，需熔解曲线辅助判断）、无法用于多重PCR。TaqMan探针法优点：特异性高（探针与目标序列特异性结合）、可进行多重检测（不同探针标记不同荧光）；缺点：成本高（需设计合成探针）、对引物和探针设计要求严格（需避免二级结构）。五、案例分析题（每题10分，共20分）案例1：某福建省疾控中心实验室使用实时荧光定量PCR检测环境样本中的霍乱弧菌，部分样本Ct值为35-38（阳性阈值为Ct≤37），且熔解曲线在80℃出现单峰（目标产物熔解温度为82℃）。问题：（1）该结果应判为阳性还是阴性？为什么？（2）熔解曲线异常的可能原因是什么？（3）提出改进措施。答案：（1）判为阴性。因Ct值超过阳性阈值（37），且熔解温度与目标产物不符，可能为非特异性扩增或引物二聚体。（2）熔解温度偏低可能原因：引物二聚体（长度短，熔