DB45-T 2804-2023 猕猴桃细菌性溃疡病PCR诊断技术规程

ICSCCS65.020.0145DB45/T2804—2023猕猴桃细菌性溃疡病PCR诊断技术规程2023-12-26发布2024-02-01实施广西壮族自治区市场监督管理局发布IDB45/T2804—2023本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由广西壮族自治区农业农村厅提出、归口并宣贯。本文件起草单位：广西特色作物研究院。本文件主要起草人：王明召、娄兵海、阳廷密、杨炎昌、唐明丽、门友均、何建军、宋雅琴、韩旸、班世面。DB45/T2804—20231猕猴桃细菌性溃疡病PCR诊断技术规程本文件确立了猕猴桃细菌性溃疡病PCR诊断技术的程序，给出了缩略语、诊断原理，规定了样品采集、诊断方法、诊断后样品处理的操作指示，描述了技术档案作为追溯方法。本文件适用于广西壮族自治区行政区域内猕猴桃属植物感染猕猴桃细菌性溃疡病的诊断。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。本文件没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1猕猴桃细菌性溃疡病bacterialcankerdiseaseofkiwifruit4缩略语下列缩略语适用于本文件。bp：碱基对DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）dNTPs：四种脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleosidetriphosphate）的等摩尔混合物，包括dATP、dGTP、dCTP和dTTPPCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）pH：氢离子浓度指数（Hydrogenionconcentration）5诊断原理利用猕猴桃细菌性溃疡病菌DNA特异性扩增引物，在热稳定DNA聚合酶的作用下，合成大量目标DNA片段，最终通过凝胶电泳分离检测出特定大小的猕猴桃细菌性溃疡病菌特异性DNA谱带，根据该谱带的有无确定样品是否带有猕猴桃细菌性溃疡病菌。6样品采集2DB45/T2804—20236.1鉴定取样6.1.1采有典型和疑似症状的植株叶片样品（参见附录A.1）、枝干样品（参见附录A.2）。6.1.2幼龄树每株采5张叶片，成年树每株采20张叶片，枝干样品采10cm长一段、共3段，分样品装入可密封塑料袋中，同时在密封袋中放入一小团无菌湿纸巾，冰块冷藏运输，3d内送实验室检测。6.2监测取样6.2.1采取Z字型五点取样法，每个点选取3株树采样。6.2.2每株树在东、南、西、北四个方位采集叶片样品，幼龄树每方位采1张叶片，成年树每方位采5张叶片，枝干样品采10cm长一段、共3段，样品保存于可密封塑料袋中，同时在密封袋中放入一小团无菌湿纸巾，冰块冷藏运输，3d内送实验室检测；从同一株树上采集的所有叶片或枝干为一个样品。7诊断方法7.1试剂及要求7.1.1要求本文件所用试剂为分析纯，所有试剂均用高压灭菌的无菌容器分装。7.1.2试剂主要试剂见表1。表1主要试剂123456789DNA分子量标准（DNAmaker，可区DB45/T2804—202337.2仪器和用品用具主要仪器和用品用具见表2。表2主要仪器和用品用具1234567897.3试样制备7.3.1样品存放采集的样品经处理后，在2℃~8℃条件下保存应不超过2周，若需长期保存，应置于-70℃以下超低温冰箱，冻融不超过3次。7.3.2样品预处理将猕猴桃叶片或枝干用流水清洗干净，吸水纸擦干，备用。冲洗废液及用过的吸水纸进行灭菌处理。7.3.3存放的样品处理存放于-70℃以下超低温冰箱的样品，取出后立即放入液氮中。7.3.4样品DNA提取取0.1g样品组织，剪碎后放入震荡研磨仪或研钵中，加入液氮冷冻研磨至粉末状。采用商用植物基因组DNA提取试剂盒（推荐使用多糖多酚类植物样品专用基因组DNA提取试剂盒按照其操作步骤和方法提取样品总DNA，或者选用其他能达到PCR扩增质量要求的方法提取样品总DNA，将提取的样品DNA置于-20℃冰箱保存备用。DB45/T2804—202347.3.5样品总DNA检测7.3.5.1用超微量紫外分光光度计检测样品总DNA的浓度和A260/A280、A260/A230比值（A260/A280在1.8～2.0之间,A260/A230在1.8～2.2之间得到的DNA纯度较高），用无菌ddH2O稀释DNA浓度至50ng/µL。7.3.5.2吸取1µL～2µL样品总DNA与等体积的上样缓冲液混合，加入1％琼脂糖凝胶的点样孔中，同时设100bp梯度DNA标准分子量作为片段大小的标准，在120V电压下电泳20min～40min。电泳结束后，将琼脂糖凝胶放入凝胶成像系统中拍照保存，观察DNA谱带的有无、大小及形状特征。7.4PCR检测7.4.1PCR扩增引物序列正向引物5’-CAGAGGCGCTAACGAGGAAA-3’；反向引物5’-CGAGCATACATCAACAGGTCA-3’。7.4.2PCR扩增体系PCR扩增体系见表1，体系总体积25µL/管。表3猕猴桃细菌性溃疡病菌PCR扩增体系1-211-7.4.3PCR扩增按表3，依次向PCR反应管中加入超纯水、dNTPs、PCR缓冲液、正向引物、反向引物、Taq酶、模板DNA，低速短暂离心后放入PCR仪，PCR反应程序为：94℃5min；94个循环；72℃10min，4℃下保存。检测时设置空白对照、阳性对照（猕猴桃细菌性溃疡病菌基因组DNA）和阴性对照（健康猕猴桃植株基因组DNA）。7.4.4电泳及成像7.4.4.1电泳将5µLPCR产物与3µL上样缓冲液混合，加入1％琼脂糖凝胶的点样孔中，同时设100bp梯度DNA标准分子量作为片段大小的标准，在120V电压下电泳约60min。7.4.4.2成像及分析DB45/T2804—20235电泳结束后，将琼脂糖凝胶放入凝胶成像系统中拍照保存并观察分析，观察DNA谱带的有无、大小及形状特征。7.4.5结果判定凝胶上阳性对照应出现一条311bp大小的特异性条带，阴性对照应没有该特异性条带；供试样品若出现与阳性对照相同大小的特异性条带，则判定样品为阳性，即带猕猴桃细菌性溃疡病菌；供试样品若未出现与阳性对照相同大小的特异性条带，样品为阴性，即不带猕猴桃细菌性溃疡病菌。结果判定参见附录C。8诊断后样品处理DNA提取液放置于-20℃以下，以备复检。用于猕猴桃细菌性溃疡病菌检测的植物样品、用具，以及实验操作台面和废液在完成检验后，植物样品集中处理，用具及废液进行灭活处理，实验操作台面用75％酒精杀菌。9技术档案建立猕猴桃细菌性溃疡病诊断档案，详细记录诊断过程中样品采集、处理、检测等情况。DB45/T2804—20236猕猴桃细菌性溃疡病症状特征A.1叶片症状特征叶片发病时在新生叶片上呈现褪绿小点，水浸状，后发展为1mm～3mm的不规则形或多角形褐色病斑，边缘有明显的淡黄色晕圈。高温条件下病斑呈红色，在连续阴雨低温条件下，病斑扩展很快，有时也不产生黄色晕圈。叶片上产生的许多小病斑相互融合形成枯斑，叶片边沿向上翻卷，不易脱落。秋季叶片病斑呈暗紫色或暗褐色，容易脱落。症状特征见图A.1。图A.1叶片症状特征A.2枝干症状特征感病植株最初从发病部位芽眼、叶痕、皮孔、小伤口等处溢出乳白色粘质菌脓，划破皮层可见韧皮部开始变为深灰色腐烂。病部皮层组织逐渐变软呈水浸状下陷，树干或大枝上可出现纵向裂缝。植株进入伤流期后，病部的菌脓与伤流液混合从伤口漫溢出，呈锈红色。病斑扩展绕茎一周后导致发病部以上的枝干坏死，也会向下部扩展导致地上部分枯死或整株死亡。症状特征见图A.2。图A.2枝干症状特征DB45/T2804—20237试剂和溶液配制试剂和溶液的配制见表