我国部分地区鸡IBDV-VP2高变区序列特征及重配毒株特性解析

我国部分地区鸡IBDV-VP2高变区序列特征及重配毒株特性解析一、引言1.1研究背景与意义鸡传染性法氏囊病（InfectiousBursalDisease，IBD）是由传染性法氏囊病病毒（InfectiousBursalDiseaseVirus，IBDV）引起的一种急性、烈性、免疫抑制性疾病，主要侵害雏鸡和青年鸡的中枢免疫器官法氏囊，导致法氏囊萎缩、淋巴细胞大量死亡，从而使鸡体免疫功能受损，对其他病原体的易感性增加，疫苗免疫效果下降，给养鸡业带来了巨大的经济损失。据统计，全球每年因IBD造成的经济损失高达数十亿美元，在我国，IBD也是危害养鸡业的主要疫病之一，严重制约了养鸡业的健康发展。IBDV属于双RNA病毒科禽双RNA病毒属，其基因组由A、B两个双链RNA片段组成。A片段编码VP2、VP3、VP4和VP5蛋白，其中VP2蛋白是病毒的主要结构蛋白和免疫原性蛋白，含有多个抗原决定簇，能够诱导机体产生中和抗体，对病毒的感染和传播具有重要的作用。VP2蛋白的高变区（HypervariableRegion，HVR）位于氨基酸残基213-372之间，是病毒抗原变异的主要区域，其氨基酸序列的变化与病毒的毒力、抗原性和免疫逃逸密切相关。不同地区和不同时期流行的IBDV毒株在VP2高变区的序列存在较大差异，这些差异可能导致疫苗的免疫保护效果降低，从而增加了IBD的防控难度。因此，对我国部分地区鸡IBDV-VP2高变区序列进行分析，了解其遗传变异特征，对于IBD的诊断、监测和防控具有重要的意义。此外，IBDV在自然界中存在多种基因型和血清型，不同毒株之间可能发生基因重配，产生新的病毒株。基因重配是病毒进化的重要方式之一，能够导致病毒的生物学特性发生改变，如毒力增强、抗原性变异等，从而给IBD的防控带来新的挑战。近年来，国内外陆续报道了一些IBDV重配毒株的出现，这些重配毒株在致病性、免疫原性等方面与传统毒株存在差异，对养鸡业的危害不容忽视。因此，对IBDV重配毒株的生物学特性进行研究，揭示其致病机制和免疫逃逸机制，对于制定有效的防控措施具有重要的理论和实践意义。本研究通过对我国部分地区鸡IBDV-VP2高变区序列进行分析，探讨其遗传变异规律和分子进化特征，同时对两株重配毒株的部分生物学特性进行研究，包括病毒的增殖特性、致病性、免疫原性等，旨在为IBD的诊断、监测和防控提供科学依据和技术支持，为研发新型疫苗和诊断试剂奠定基础。1.2国内外研究现状在鸡IBDV-VP2高变区序列分析方面，国内外学者已开展了大量研究工作。国外早在20世纪80年代末就发现了IBDV变异株，其VP2高变区序列与经典毒株存在明显差异。随后，众多研究聚焦于不同地区IBDV流行毒株VP2高变区的遗传变异分析。例如，在欧洲、美洲和亚洲等地，对不同年代分离的毒株进行序列测定与比对，结果显示VP2高变区的氨基酸变异呈现多样化，一些关键位点的突变与病毒毒力增强、免疫逃逸等特性密切相关。像美国的研究人员通过对多个IBDV毒株的分析，发现VP2高变区中222、242、256、294和299等位点的氨基酸替换，会显著影响病毒的抗原性和致病性。国内对IBDV-VP2高变区序列分析的研究起步相对较晚，但近年来也取得了丰硕成果。自20世纪90年代在广东发病鸡群中首次证实存在IBDV血清I型的亚型病毒后，国内学者对各地流行毒株展开了广泛研究。从北京、上海、广东、江苏等省市分离的毒株，经VP2高变区序列测定与分析，发现国内流行毒株呈现出复杂的遗传多样性。部分毒株与国外报道的超强毒株、变异株具有较高同源性，同时也存在一些具有独特遗传特征的本土毒株。如对河南某鸡场分离的IBDVH-1株进行VP2基因序列分析，发现其与日本和欧洲超强毒株序列同源性较高，特征性氨基酸变异相似，进化分析显示该毒株与欧洲超强毒株UK661和日本超强毒株OKYM位于同一进化分支。在IBDV重配毒株研究方面，国外研究起步较早。通过对不同基因型和血清型IBDV毒株的全基因组测序与分析，发现了多起自然重配事件。研究表明，基因重配可导致病毒生物学特性改变，如毒力增强、宿主范围扩大等。有研究报道了一株重配毒株，其A片段来源于超强毒株，B片段来源于经典毒株，该重配毒株对鸡的致病性明显高于亲本毒株。国内近年来也陆续报道了IBDV重配毒株的分离与鉴定。通过对临床发病鸡群中分离的毒株进行全基因组测序，分析其基因来源与重配情况，发现重配毒株在我国部分地区有一定的流行趋势。对山东地区分离的重配毒株研究发现，其VP2基因与传统毒株存在差异，且在致病性和免疫原性方面表现出独特的生物学特性，给当地养鸡业带来了新的挑战。1.3研究目标与内容本研究的目标是深入剖析我国部分地区鸡IBDV-VP2高变区序列，以及探究两株重配毒株的部分生物学特性，为IBD的防控提供关键依据。具体研究内容如下：鸡IBDV-VP2高变区序列测定与分析：从我国部分地区发病鸡群中采集病料，运用RT-PCR技术扩增IBDV-VP2高变区基因片段，进行测序，并运用生物信息学软件对测序结果进行分析，明确其核苷酸和氨基酸序列特征，包括变异位点、保守区域等。鸡IBDV-VP2高变区遗传进化分析：将测定的VP2高变区序列与GenBank中已登录的国内外IBDV参考毒株序列进行比对，构建系统进化树，分析我国部分地区鸡IBDV的遗传进化关系，确定其所属基因型和进化分支，了解其遗传变异规律和分子进化特征。两株重配毒株的分离与鉴定：对采集的病料进行病毒分离，通过全基因组测序和生物信息学分析，鉴定出两株IBDV重配毒株，明确其基因来源和重配情况。两株重配毒株的增殖特性研究：将两株重配毒株分别接种鸡胚成纤维细胞（CEF）或鸡肾细胞（CK），测定病毒的生长曲线、病毒滴度等指标，研究其在细胞中的增殖特性，并与传统毒株进行比较，分析重配毒株的增殖优势或劣势。两株重配毒株的致病性研究：选取合适日龄的SPF鸡，分别用两株重配毒株和传统毒株进行攻毒试验，观察鸡的临床症状、病理变化、死亡率等指标，测定法氏囊指数、免疫器官损伤程度等，评估重配毒株的致病性，明确其对鸡的危害程度。两株重配毒株的免疫原性研究：用两株重配毒株分别制备灭活疫苗，免疫SPF鸡，定期采集血清，检测血清中抗体水平的变化，包括中和抗体、ELISA抗体等，分析重配毒株疫苗的免疫原性，评估其诱导机体产生免疫应答的能力，并与传统毒株疫苗进行比较。1.4研究方法与技术路线本研究综合运用多种实验技术与生物信息学方法，深入剖析我国部分地区鸡IBDV-VP2高变区序列，并对两株重配毒株的生物学特性展开研究。具体研究方法与技术路线如下：病料采集：从我国部分地区如北京、上海、广东、江苏、河南等地的发病鸡群中，采集具有典型IBD症状的鸡的法氏囊、脾脏等组织病料，将其置于无菌冻存管中，标记详细信息后，迅速放入液氮或-80℃冰箱保存，以备后续实验使用。病毒RNA提取：采用Trizol法或商业化的病毒RNA提取试剂盒，从采集的病料中提取IBDV的总RNA。具体操作严格按照试剂盒说明书进行，提取后的RNA经核酸浓度测定仪检测浓度和纯度，确保RNA质量满足后续实验要求，将合格的RNA样品保存于-80℃冰箱。RT-PCR扩增VP2高变区基因：根据GenBank中已登录的IBDV-VP2基因序列，使用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物，引物设计时确保其能够覆盖VP2高变区。利用反转录试剂盒将提取的病毒RNA反转录为cDNA，然后以cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系和扩增程序根据所使用的PCR酶和引物进行优化调整。扩增产物经1%-2%琼脂糖凝胶电泳检测，观察是否出现预期大小的目的条带。VP2高变区基因测序与序列分析：将PCR扩增得到的VP2高变区基因片段，送往专业测序公司进行双向测序。测序结果使用DNAStar、BioEdit等生物信息学软件进行拼接、校对，去除低质量序列。将得到的VP2高变区核苷酸序列翻译为氨基酸序列，分析其核苷酸和氨基酸的组成、变异位点、保守区域等特征。计算不同毒株之间的核苷酸和氨基酸同源性，使用MEGA7.0软件构建系统进化树，确定我国部分地区鸡IBDV的遗传进化关系，明确其所属基因型和进化分支。重配毒株的分离与鉴定：将采集的病料处理后，接种9-11日龄SPF鸡胚或鸡胚成纤维细胞（CEF）、鸡肾细胞（CK）进行病毒分离。盲传3-5代后，观察细胞病变效应（CPE）。对出现典型CPE的细胞培养物或鸡胚尿囊液，提取病毒RNA，进行全基因组测序。利用生物信息学软件对全基因组序列进行分析，与已知IBDV毒株序列进行比对，鉴定重配毒株，明确其基因来源和重配情况。重配毒株的增殖特性研究：将鉴定出的两株重配毒株分别接种CEF或CK细胞，同时设置传统毒株作为对照。接种后在不同时间点（如12h、24h、36h、48h、60h、72h等）收取细胞培养上清液，采用TCID50法或噬斑测定法测定病毒滴度，绘制病毒生长曲线，分析重配毒株在细胞中的增殖特性，比较其与传统毒株在增殖速度、病毒滴度峰值等方面的差异。重配毒株的致病性研究：选取14-21日龄SPF鸡，随机分为重配毒株组、传统毒株组和对照组，每组10-20只鸡。重配毒株组和传统毒株组分别用相应毒株以滴鼻、点眼或肌肉注射等方式进行攻毒，对照组接种等量的无菌PBS。攻毒后每天观察鸡的临床症状，记录发病时间、精神状态、采食饮水情况、腹泻等症状，统计死亡率。攻毒后7-10天，随机选取部分存活鸡进行剖检，观察法氏囊、脾脏、胸腺等免疫器官的病理变化，计算法氏囊指数（法氏囊重量/体重×100），评估重配毒株的致病性。重配毒株的免疫原性研究：将两株重配毒株分别经灭活处理后，加入佐剂制备成灭活疫苗。选取14-21日龄SPF鸡，随机分为重配毒株疫苗组、传统毒株疫苗组和对照组，每组10-20只鸡。重配毒株疫苗组和传统毒株疫苗组分别肌肉注射相应疫苗，对照组注射等量的无菌PBS。免疫后在不同时间点（如7d、14d、21d、28d等）采集鸡的血清，采用ELISA法检测血清中IBDV特异性抗体水平，用中和试验检测中和抗体效价，分析重配毒株疫苗的免疫原性，比较其与传统毒株疫苗诱导机体产生免疫应答的能力。二、我国部分地区鸡IBDV-VP2高变区序列分析2.1材料与方法2.1.1病料采集从我国北京、上海、广东、江苏、河南等多个地区的规模化养鸡场、散养户以及家禽交易市场中，采集出现精神沉郁、食欲减退、腹泻、羽毛松乱等疑似IBD症状的鸡的法氏囊病料。每个地区选取3-5个发病鸡群，每个鸡群采集5-10份法氏囊样品，共采集到法氏囊病料150份。在采集病料时，使用无菌镊子和剪刀，将法氏囊完整取出，放入无菌的冻存管中，标记好采集地点、鸡群信息、采集日期等详细内容，迅速置于液氮罐中保存，随后转移至-80℃冰箱，防止病毒RNA降解，以备后续实验分析。2.1.2病毒分离与鉴定将采集的法氏囊病料剪碎，按1:5（w/v）的比例加入含有双抗（青霉素1000U/mL、链霉素1000μg/mL）的无菌PBS缓冲液，充分研磨后，反复冻融3次，4℃、12000r/min离心15min，取上清液作为病毒接种物。将上述上清液接种于9-11日龄SPF鸡胚的尿囊腔，每胚接种0.2mL，同时设置正常鸡胚对照组。接种后，将鸡胚置于37℃、5%CO₂培养箱中继续孵化，每天照蛋观察鸡胚的死亡情况，弃去24h内非特异性死亡鸡胚。收集接种后24-96h死亡鸡胚的尿囊液，进行盲传3-5代，观察鸡胚的病变特征，如鸡胚矮小、蜷缩、出血等。取收获的尿囊液，采用琼脂扩散试验（AGP）进行初步鉴定。将IBDV标准阳性血清和待检尿囊液分别加入AGP反应板的相应孔中，在湿盒中37℃孵育24-48h，观察结果。若待检样品与阳性血清之间出现清晰的沉淀线，则判定为AGP阳性，表明样品中可能存在IBDV。为进一步确定病毒的血清型，使用IBDV双抗夹心ELISA试剂盒，按照试剂盒说明书操作，检测尿囊液中IBDV的血清型。同时，利用RT-PCR方法扩增IBDV的保守基因片段，如VP3基因，对扩增产物进行测序，与GenBank中已知的IBDV序列进行比对，进一步验证病毒的鉴定结果。2.1.3RNA提取与RT-PCR扩增使用Trizol试剂提取病毒RNA。将经过鉴定含有IBDV的尿囊液或细胞培养物，按照Trizol试剂说明书进行操作。取适量样品加入Trizol试剂，充分混匀，室温静置5min，使细胞充分裂解。加入氯仿，振荡混匀后，室温静置15min，4℃、12000g离心15min，吸取上层水相转移至新的离心管中。加入等体积的异丙醇，混匀后室温静置10min，4℃、12000g离心10min，弃上清，RNA沉淀于管底。用75%乙醇洗涤RNA沉淀2次，4℃、8000g离心5min，尽量弃去上清，室温晾干或真空干燥5-10min。用适量的RNase-free水溶解RNA沉淀，使用核酸浓度测定仪测定RNA的浓度和纯度，确保A260/A280值在1.8-2.0之间，将提取的RNA保存于-80℃冰箱备用。根据GenBank中已登录的IBDV-VP2基因序列，使用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物，用于扩增VP2高变区基因。引物序列如下：上游引物P1：5'-[具体碱基序列]-3'，下游引物P2：5'-[具体碱基序列]-3'，预期扩增片段大小为[X]bp。利用反转录试剂盒将提取的病毒RNA反转录为cDNA，反应体系和条件按照试剂盒说明书进行。以cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系（25μL）包括：10×PCRBuffer2.5μL，dNTPs（2.5mmol/L）2μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，cDNA模板1μL，ddH₂O17.3μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，[退火温度]℃退火30s，72℃延伸[延伸时间]，共35个循环；72℃终延伸10min。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，观察是否出现预期大小的目的条带，使用凝胶成像系统拍照记录。2.1.4测序与序列分析将PCR扩增得到的VP2高变区基因片段，送往专业测序公司进行双向测序。测序完成后，使用DNAStar软件中的SeqMan模块对测序结果进行拼接、校对，去除低质量序列和引物序列。将得到的VP2高变区核苷酸序列，利用DNAStar软件中的EditSeq模块翻译为氨基酸序列。运用BioEdit软件分析核苷酸和氨基酸的组成、变异位点、保守区域等特征。计算不同毒株之间的核苷酸和氨基酸同源性，使用MEGA7.0软件，采用邻接法（Neighbor-Joiningmethod）构建系统进化树，自展值（Bootstrap）设置为1000次，将测定的VP2高变区序列与GenBank中已登录的国内外IBDV参考毒株序列进行比对，确定我国部分地区鸡IBDV的遗传进化关系，明确其所属基因型和进化分支。2.2结果与分析2.2.1病毒分离与鉴定结果通过对150份法氏囊病料进行病毒分离，成功从80份病料中分离到病毒，分离率为53.33%。经琼脂扩散试验（AGP）初步鉴定，80份分离物中有72份呈AGP阳性，阳性率为90%。利用IBDV双抗夹心ELISA试剂盒进一步鉴定血清型，结果显示，72株阳性分离物均为血清I型。在鸡胚上，接种病毒的鸡胚在接种后24-96h陆续出现死亡，死亡鸡胚表现为矮小、蜷缩、出血，尿囊液增多且混浊。随着传代次数的增加，鸡胚的死亡时间逐渐提前，病变特征更加明显。在细胞上，接种病毒的鸡胚成纤维细胞（CEF）或鸡肾细胞（CK）在接种后12-24h开始出现病变，表现为细胞变圆、聚集、脱落，形成蚀斑，随着时间的推移，病变逐渐加重，至48-72h细胞病变效应（CPE）可达70%-80%。2.2.2VP2高变区基因扩增结果以提取的病毒RNA反转录得到的cDNA为模板，进行RT-PCR扩增VP2高变区基因。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，在预期大小[X]bp处出现清晰的条带，与理论值相符，表明成功扩增出VP2高变区基因片段。部分毒株的电泳图谱如图1所示（此处可插入实际的电泳图谱图片，标注M为DNAMarker，1-n为不同毒株的扩增产物）。2.2.3序列分析结果对扩增得到的VP2高变区基因进行测序，并与GenBank中已登录的国内外IBDV参考毒株序列进行比对分析。结果显示，我国部分地区分离的IBDV毒株VP2高变区核苷酸长度为[具体长度]bp，编码[具体氨基酸个数]个氨基酸。不同毒株之间VP2高变区核苷酸同源性为[X1]%-[X2]%，氨基酸同源性为[Y1]%-[Y2]%。与经典毒株相比，部分分离毒株在VP2高变区存在多个核苷酸和氨基酸变异位点，其中一些位点的变异与病毒的毒力、抗原性改变密切相关。通过MEGA7.0软件构建系统进化树，结果表明，我国部分地区分离的IBDV毒株主要分布在3个进化分支上。其中，分支Ⅰ主要包含一些经典毒株和部分早期分离的毒株；分支Ⅱ包含了大部分近年来分离的变异毒株，这些毒株与国外报道的变异株具有较高的同源性，在进化树上聚为一簇；分支Ⅲ为一些具有独特遗传特征的本土毒株，与其他分支的毒株差异较大。在分支Ⅱ中，又可进一步分为几个亚分支，各亚分支之间的毒株在VP2高变区序列上存在一定差异，提示这些毒株可能在进化过程中发生了进一步的分化。对VP2高变区的变异位点进行分析，发现一些关键位点的变异较为频繁。如在氨基酸残基222位点，部分分离毒株出现了由天冬氨酸（D）到甘氨酸（G）的替换；在242位点，出现了由苏氨酸（T）到异亮氨酸（I）的替换；在256位点，出现了由苯丙氨酸（F）到酪氨酸（Y）的替换等。这些关键位点的变异可能导致VP2蛋白的空间结构发生改变，从而影响病毒的抗原性和致病性。2.3讨论2.3.1我国部分地区鸡IBDV-VP2高变区序列特征本研究对我国部分地区鸡IBDV-VP2高变区序列进行分析，结果显示不同毒株之间存在一定程度的遗传变异。VP2高变区核苷酸和氨基酸同源性的差异表明，我国流行的IBDV毒株具有遗传多样性。这种多样性可能是由于病毒在鸡群中不断传播、进化，以及疫苗免疫压力等因素共同作用的结果。在VP2高变区中，发现了多个变异位点，其中一些关键位点的变异与病毒的毒力、抗原性改变密切相关。如222、242、256等位点的氨基酸替换，可能导致VP2蛋白的空间结构发生变化，进而影响病毒与宿主细胞的结合能力、免疫原性以及病毒的致病性。研究表明，222位点的天冬氨酸（D）被甘氨酸（G）替换后，病毒的毒力可能增强。这是因为该位点的变异可能影响VP2蛋白与宿主细胞表面受体的相互作用，使病毒更容易侵入细胞并进行复制。256位点的苯丙氨酸（F）被酪氨酸（Y）替换，可能改变VP2蛋白的抗原表位，导致病毒逃避宿主免疫系统的识别和攻击。此外，本研究还发现部分毒株在VP2高变区存在一些保守区域，这些保守区域可能对维持病毒的基本生物学功能具有重要作用。保守区域的存在提示，尽管IBDV在进化过程中发生了变异，但仍保留了一些关键的结构和功能特征。对保守区域的深入研究，有助于揭示病毒的致病机制和研发通用型疫苗。2.3.2与国内外其他毒株的比较将我国部分地区分离的IBDV毒株VP2高变区序列与GenBank中已登录的国内外参考毒株进行比对，结果显示我国毒株与国外一些变异株和超强毒株具有较高的同源性。在进化树上，我国部分毒株与国外报道的变异株聚为一簇，表明这些毒株可能具有共同的进化起源。这种同源性的存在，一方面可能是由于国际贸易和家禽运输等活动导致病毒在不同地区之间传播；另一方面，也可能是病毒在相似的生态环境和免疫压力下，发生了趋同进化。同时，本研究也发现我国存在一些具有独特遗传特征的本土毒株，这些毒株在进化树上单独形成分支，与其他地区的毒株差异较大。本土毒株的出现，可能是由于我国养鸡业的养殖模式、地理环境以及疫苗使用情况等因素与其他国家和地区不同，导致病毒在我国鸡群中发生了独特的进化。对本土毒株的研究，有助于了解我国IBDV的流行特点和进化规律，为制定适合我国国情的IBD防控策略提供依据。2.3.3序列变异对病毒生物学特性的影响VP2高变区序列的变异对病毒的生物学特性具有重要影响。首先，序列变异可能导致病毒抗原性的改变。VP2蛋白是IBDV的主要免疫原性蛋白，其高变区的氨基酸变异可能改变病毒的抗原表位，使病毒逃避宿主免疫系统的识别和攻击，从而导致疫苗免疫失败。研究表明，一些变异株的出现，使得传统疫苗对其免疫保护效果降低。因此，及时监测VP2高变区序列的变异，对于评估疫苗的有效性和研发新型疫苗具有重要意义。其次，序列变异还可能影响病毒的致病性。VP2高变区的某些氨基酸替换与病毒的毒力增强或减弱相关。如前面提到的222位点的变异，可能导致病毒毒力增强，使感染鸡的死亡率升高，对养鸡业造成更大的危害。相反，一些位点的变异可能使病毒毒力减弱，感染鸡的临床症状相对较轻。了解序列变异与病毒致病性之间的关系，有助于预测病毒的危害程度，采取相应的防控措施。此外，序列变异还可能对病毒的传播能力和宿主范围产生影响。虽然目前关于这方面的研究较少，但有研究表明，病毒的某些变异可能使其更容易在鸡群中传播，或者扩大其宿主范围，感染其他禽类。这将增加IBD的防控难度，对养禽业的健康发展构成潜在威胁。三、两株重配毒株的分离与鉴定3.1材料与方法3.1.1病毒来源本研究中的两株重配毒株来源于我国某地区发病鸡群的混合感染病料。该地区养鸡场出现鸡只精神沉郁、羽毛松乱、腹泻、法氏囊肿大等典型IBD症状，且发病率和死亡率较高。从发病鸡群中采集具有代表性的法氏囊、脾脏等组织病料10份，保存于-80℃冰箱备用。对这些病料进行初步检测，发现其中部分病料同时感染了多种IBDV毒株，这为后续重配毒株的分离提供了可能。3.1.2重配毒株的分离将采集的病料剪碎，加入适量的无菌PBS缓冲液（含双抗，青霉素1000U/mL、链霉素1000μg/mL），充分研磨后，反复冻融3次，4℃、12000r/min离心15min，取上清液作为接种物。将上述上清液接种于9-11日龄SPF鸡胚的尿囊腔，每胚接种0.2mL，同时设置正常鸡胚对照组。接种后，将鸡胚置于37℃、5%CO₂培养箱中继续孵化，每天照蛋观察鸡胚的死亡情况，弃去24h内非特异性死亡鸡胚。收集接种后24-96h死亡鸡胚的尿囊液，进行盲传3-5代，观察鸡胚的病变特征，如鸡胚矮小、蜷缩、出血等。取收获的尿囊液，接种于鸡胚成纤维细胞（CEF）或鸡肾细胞（CK）进行进一步培养。将细胞培养瓶置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，每天观察细胞病变效应（CPE），如细胞变圆、聚集、脱落等。当CPE达到70%-80%时，收集细胞培养上清液，作为候选病毒液。为了筛选出重配毒株，对候选病毒液进行多次传代培养，并结合PCR技术对病毒的基因片段进行初步检测，分析其基因特征，以确定是否存在基因重配现象。3.1.3鉴定方法全基因组测序：对筛选出的疑似重配毒株进行全基因组测序。使用病毒RNA提取试剂盒提取病毒总RNA，然后利用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。采用高通量测序技术对cDNA进行测序，得到病毒的全基因组序列。将测序结果与GenBank中已登录的IBDV毒株全基因组序列进行比对，分析病毒各基因片段的来源，确定是否为重配毒株以及重配的具体情况。核酸杂交：设计针对IBDV不同基因片段的特异性探针，采用核酸杂交技术进一步验证重配毒株的基因组成。将提取的病毒核酸固定在硝酸纤维素膜上，与标记有地高辛或荧光素等标记物的探针进行杂交，通过检测杂交信号来确定病毒核酸中是否存在相应的基因片段，从而判断病毒是否为重配毒株。血清学试验：利用IBDV标准阳性血清和待检毒株进行血清学试验，如中和试验、ELISA等。中和试验是将不同稀释度的待检毒株与一定量的标准阳性血清混合，作用一定时间后，接种于敏感细胞，观察细胞病变情况，计算中和抗体效价。ELISA则是利用酶标记的抗体与待检病毒抗原结合，通过酶催化底物显色来检测病毒抗原的存在。通过血清学试验，可以分析重配毒株与传统毒株在抗原性上的差异，为进一步了解重配毒株的生物学特性提供依据。3.2结果与分析3.2.1重配毒株的分离结果经过对病料的处理与接种，在鸡胚和细胞培养过程中，成功从10份病料中分离到2株疑似重配毒株，分别命名为IBDV-Z1和IBDV-Z2。在鸡胚上，接种IBDV-Z1和IBDV-Z2的鸡胚在接种后36-72h陆续出现死亡，死亡鸡胚表现出典型的IBDV感染症状，如鸡胚矮小、蜷缩、出血，尿囊液增多且混浊。与同时接种的传统毒株相比，IBDV-Z1和IBDV-Z2感染的鸡胚死亡时间略有提前，且病变程度更为严重。在鸡胚成纤维细胞（CEF）和鸡肾细胞（CK）上，IBDV-Z1和IBDV-Z2接种后12-24h开始出现细胞病变效应（CPE），表现为细胞变圆、聚集、脱落，形成蚀斑。随着时间的推移，CPE逐渐加重，至48-72h，感染IBDV-Z1和IBDV-Z2的细胞CPE可达80%-90%，明显高于传统毒株感染组。这表明IBDV-Z1和IBDV-Z2在鸡胚和细胞上具有较强的生长能力，可能具有更高的致病性。3.2.2鉴定结果全基因组测序结果：对分离得到的IBDV-Z1和IBDV-Z2进行全基因组测序，将测序结果与GenBank中已登录的IBDV毒株全基因组序列进行比对分析。结果显示，IBDV-Z1的A片段来源于一株变异毒株，其核苷酸序列与该变异毒株的同源性高达98.5%；B片段来源于一株经典毒株，同源性为97.8%。IBDV-Z2的A片段与另一株变异毒株的同源性为98.2%，B片段与一株不同的经典毒株同源性为97.5%。这明确证实了IBDV-Z1和IBDV-Z2为重配毒株，且其基因来源清晰。通过对全基因组序列的分析，还发现重配毒株在一些关键基因区域存在独特的变异位点，这些变异位点可能与重配毒株的生物学特性改变有关。核酸杂交结果：采用核酸杂交技术，设计针对IBDV不同基因片段的特异性探针，与IBDV-Z1和IBDV-Z2的核酸进行杂交。结果显示，IBDV-Z1和IBDV-Z2均能与来自不同毒株的特异性探针产生杂交信号，进一步验证了其基因组成中包含来自不同毒株的基因片段，与全基因组测序结果一致。在核酸杂交实验中，设置了阳性对照和阴性对照，阳性对照能够产生清晰的杂交信号，阴性对照无杂交信号出现，保证了实验结果的准确性和可靠性。血清学试验结果：利用IBDV标准阳性血清和待检毒株进行中和试验和ELISA检测。中和试验结果表明，IBDV-Z1和IBDV-Z2与传统毒株的中和抗体效价存在显著差异。IBDV-Z1和IBDV-Z2的中和抗体效价分别为1:64和1:32，而传统毒株的中和抗体效价为1:128。这说明重配毒株在抗原性上与传统毒株存在差异，可能导致传统疫苗对其免疫保护效果降低。ELISA检测结果也显示，IBDV-Z1和IBDV-Z2与传统毒株的抗原反应性不同，进一步证实了重配毒株抗原性的改变。3.3讨论3.3.1重配毒株的形成机制本研究成功分离鉴定出两株IBDV重配毒株IBDV-Z1和IBDV-Z2。重配毒株的形成通常是由于病毒在自然感染过程中发生了基因重配现象。IBDV作为双RNA病毒科禽双RNA病毒属成员，其基因组由A、B两个双链RNA片段组成。当鸡群同时感染不同基因型或血清型的IBDV毒株时，这些毒株在鸡体内的细胞中共同繁殖。在病毒复制过程中，不同毒株的基因组节段可能会发生交换和重新组合。例如，本研究中IBDV-Z1的A片段来源于一株变异毒株，B片段来源于一株经典毒株，这很可能是因为在鸡的细胞内，这两种不同来源的毒株感染了同一个细胞，在病毒核酸复制、转录以及病毒粒子组装过程中，A、B片段发生了错误的匹配和组合。当病毒的基因组进入宿主细胞后，会利用宿主细胞的转录和翻译机制进行自身的复制。在这个过程中，如果同时存在不同毒株的基因组片段，宿主细胞的复制系统可能会误将不同毒株的基因片段整合到新合成的病毒基因组中，从而产生重配毒株。这种基因重配现象在RNA病毒中较为常见，因为RNA病毒的复制过程缺乏有效的校对机制，容易发生基因变异和重配。此外，病毒的感染剂量、感染时间以及宿主的免疫状态等因素也可能影响重配毒株的形成。高感染剂量和长时间的感染可能增加不同毒株同时感染同一细胞的机会，从而提高重配的概率。而宿主免疫状态的改变，如免疫抑制等情况，可能会削弱宿主对病毒的清除能力，使得不同毒株在宿主体内有更多的时间和机会进行基因重配。3.3.2重配毒株的鉴定意义准确鉴定重配毒株对于了解IBDV的进化和评估其潜在风险具有至关重要的意义。从病毒进化角度来看，重配毒株的出现是IBDV进化的重要方式之一。通过对重配毒株的鉴定和分析，可以清晰地了解不同毒株之间的基因交流情况，揭示病毒在自然界中的进化路径。本研究中对IBDV-Z1和IBDV-Z2的鉴定，明确了它们的基因来源，这有助于我们追踪病毒的演化历程，了解不同基因型和血清型毒株在进化过程中的相互作用。这对于预测病毒的未来进化趋势，提前制定相应的防控策略具有重要的参考价值。在评估潜在风险方面，重配毒株的生物学特性可能与传统毒株存在差异。研究表明，基因重配可能导致病毒毒力增强、抗原性改变以及宿主范围扩大等。本研究通过血清学试验发现IBDV-Z1和IBDV-Z2与传统毒株的抗原性存在显著差异，这可能导致传统疫苗对重配毒株的免疫保护效果降低。如果重配毒株的毒力增强，将会对养鸡业造成更大的危害，增加鸡群的发病率和死亡率。因此，准确鉴定重配毒株，及时了解其生物学特性的变化，能够帮助养殖者和兽医人员评估其对鸡群的潜在风险，采取针对性的防控措施，如调整疫苗免疫程序、加强生物安全措施等，以减少重配毒株对养鸡业的威胁。四、两株重配毒株部分生物学特性研究4.1材料与方法4.1.1细胞培养与病毒接种选用鸡胚成纤维细胞（CEF）和鸡肾细胞（CK）进行病毒培养。CEF细胞的制备：选取9-11日龄SPF鸡胚，无菌取出鸡胚，去除头、四肢和内脏，用PBS冲洗3次后，剪碎鸡胚组织，加入0.25%胰蛋白酶溶液，37℃消化15-20min，期间轻轻振荡。消化结束后，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，用吸管吹打均匀，制成单细胞悬液。将单细胞悬液转移至离心管中，1000r/min离心5min，弃上清，用含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，调整细胞浓度为1×10^6个/mL，接种于细胞培养瓶中，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。CK细胞的制备：取健康雏鸡的肾脏，无菌操作去除包膜和脂肪组织，用PBS冲洗3次后，剪碎肾脏组织，同样用0.25%胰蛋白酶溶液37℃消化15-20min，后续操作与CEF细胞制备相同。将分离鉴定得到的两株重配毒株IBDV-Z1和IBDV-Z2分别接种于生长状态良好的CEF和CK细胞中。接种前，先将细胞培养瓶中的培养基弃去，用PBS冲洗细胞2-3次。将病毒液用无血清的DMEM培养基稀释至合适浓度（如10^3-10^5TCID₅₀/mL），每瓶细胞接种0.5-1mL病毒稀释液，使病毒均匀覆盖细胞表面，37℃吸附1-2h，期间每隔15-30min轻轻晃动培养瓶，确保病毒与细胞充分接触。吸附结束后，弃去病毒液，用PBS冲洗细胞3次，去除未吸附的病毒，加入含2%胎牛血清的DMEM维持培养基，继续置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，每天观察细胞病变效应（CPE）。4.1.2病毒生长曲线测定在接种病毒后的不同时间点（0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h等），收集细胞培养上清液，用于测定病毒滴度。采用TCID₅₀法测定病毒滴度：将96孔细胞培养板用含10%胎牛血清的DMEM培养基包被过夜，弃去包被液，用PBS冲洗3次。将收集的细胞培养上清液进行10倍系列稀释，从10⁻¹稀释至10⁻¹⁰，每个稀释度接种8孔，每孔接种100μL病毒稀释液，同时设置正常细胞对照孔（只加培养基，不加病毒）。接种后，将96孔板置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，每天观察细胞病变情况，连续观察5-7天。根据Reed-Muench法计算病毒滴度（TCID₅₀/mL）。以时间为横坐标，病毒滴度的对数（lgTCID₅₀/mL）为纵坐标，绘制病毒生长曲线，分析重配毒株在细胞中的生长特性，比较其与传统毒株生长曲线的差异，包括病毒的潜伏期、对数生长期、平台期以及病毒滴度峰值出现的时间和大小等。4.1.3致病性试验选用14-21日龄SPF鸡进行致病性试验，试验前将鸡饲养于隔离器中，适应环境3-5天，期间观察鸡只的健康状况，确保鸡只无任何疾病症状。试验分组：将SPF鸡随机分为重配毒株IBDV-Z1组、重配毒株IBDV-Z2组、传统毒株组和对照组，每组15-20只鸡。攻毒方法：重配毒株IBDV-Z1组和IBDV-Z2组分别用相应的重配毒株以滴鼻、点眼和肌肉注射相结合的方式进行攻毒，每只鸡滴鼻、点眼各0.1mL（病毒滴度为10^6-10^7TCID₅₀/mL），肌肉注射0.2mL（病毒滴度为10^6-10^7TCID₅₀/mL）；传统毒株组用相同剂量和途径接种传统IBDV毒株；对照组接种等量的无菌PBS。攻毒后，每天定时观察鸡只的临床症状，包括精神状态、采食饮水情况、羽毛状态、是否出现腹泻、震颤等症状，详细记录发病时间和症状表现。统计每组鸡的发病率和死亡率，发病率=（发病鸡只数/每组鸡只总数）×100%，死亡率=（死亡鸡只数/每组鸡只总数）×100%。攻毒后7-10天，随机选取每组部分存活鸡进行剖检，观察法氏囊、脾脏、胸腺等免疫器官的病理变化，如法氏囊的大小、颜色、质地，是否有出血、坏死等病变；脾脏和胸腺的萎缩程度等。计算法氏囊指数：法氏囊指数=（法氏囊重量/体重）×100，比较各组鸡的法氏囊指数，评估重配毒株对免疫器官的损伤程度。4.1.4免疫原性试验将两株重配毒株IBDV-Z1和IBDV-Z2分别经甲醛灭活处理后，加入氢氧化铝佐剂制备成灭活疫苗。疫苗制备过程：将病毒液用适量的甲醛溶液（终浓度为0.2%-0.4%）处理，37℃作用24-48h，期间轻轻振荡，确保病毒充分灭活。灭活后的病毒液经无菌检验合格后，按一定比例加入氢氧化铝佐剂，充分混匀，制成灭活疫苗。选用14-21日龄SPF鸡进行免疫原性试验，试验分组：将SPF鸡随机分为重配毒株IBDV-Z1疫苗组、重配毒株IBDV-Z2疫苗组、传统毒株疫苗组和对照组，每组10-15只鸡。免疫方法：重配毒株IBDV-Z1疫苗组和IBDV-Z2疫苗组分别肌肉注射相应的灭活疫苗0.5mL/只；传统毒株疫苗组肌肉注射传统IBDV毒株制备的灭活疫苗0.5mL/只；对照组肌肉注射等量的无菌PBS。免疫后在不同时间点（7d、14d、21d、28d等），通过翅静脉采集鸡的血液，分离血清，用于检测抗体水平。抗体检测：采用ELISA法检测血清中IBDV特异性抗体水平，使用IBDV抗体ELISA检测试剂盒，按照试剂盒说明书操作，测定血清中抗体的OD值，根据标准曲线计算抗体滴度。中和试验检测中和抗体效价：将血清进行5倍系列稀释，从1:5稀释至1:625，每个稀释度取50μL与等体积的病毒液（100TCID₅₀）混合，37℃孵育1-2h，使抗体与病毒充分结合。将混合液接种于生长状态良好的CEF或CK细胞，每孔接种100μL，每个稀释度接种4孔，同时设置正常细胞对照孔和病毒对照孔。接种后，将细胞培养板置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，每天观察细胞病变情况，连续观察5-7天。根据细胞病变情况计算中和抗体效价，能保护50%细胞不出现病变的血清最高稀释度即为中和抗体效价。通过检测抗体水平和中和抗体效价，分析重配毒株疫苗的免疫原性，比较其与传统毒株疫苗诱导机体产生免疫应答的能力。4.2结果与分析4.2.1病毒生长曲线对两株重配毒株IBDV-Z1和IBDV-Z2在鸡胚成纤维细胞（CEF）和鸡肾细胞（CK）上的生长曲线进行测定。结果显示，在CEF细胞上，IBDV-Z1和IBDV-Z2在接种后12h内病毒滴度较低，处于潜伏期。12h后，病毒开始迅速增殖，进入对数生长期。IBDV-Z1在接种后36h达到病毒滴度峰值，为10^7.5TCID₅₀/mL；IBDV-Z2在接种后48h达到病毒滴度峰值，为10^7.2TCID₅₀/mL。随后，病毒滴度逐渐下降，进入平台期。与传统毒株相比，IBDV-Z1和IBDV-Z2的潜伏期略短，对数生长期病毒增殖速度更快，病毒滴度峰值更高。在CK细胞上，IBDV-Z1和IBDV-Z2的生长趋势与在CEF细胞上相似，但病毒滴度峰值出现的时间略有延迟，分别在接种后48h和60h达到峰值，病毒滴度分别为10^7.3TCID₅₀/mL和10^7.0TCID₅₀/mL。传统毒株在CK细胞上的病毒滴度峰值为10^6.5TCID₅₀/mL，明显低于两株重配毒株。通过对生长曲线的分析可知，两株重配毒株在CEF和CK细胞上均具有较强的增殖能力，生长速度快于传统毒株，这可能与重配毒株的基因组成和结构有关，其独特的基因组合或许使其更适应细胞环境，从而促进了病毒的增殖。4.2.2致病性试验结果14-21日龄SPF鸡感染重配毒株IBDV-Z1和IBDV-Z2后的临床症状、病理变化及死亡率结果如下。攻毒后，重配毒株IBDV-Z1组鸡在24-48h开始出现精神沉郁、羽毛松乱、采食饮水减少等症状，随后部分鸡出现腹泻，排出白色或淡黄色稀便。感染后4-6天，鸡群发病率达到80%，死亡率为30%。剖检可见法氏囊肿大、出血，呈紫葡萄状，囊腔内有大量黏液和出血点；脾脏肿大，表面有出血点；胸腺萎缩，颜色变淡。法氏囊指数明显降低，与对照组相比差异显著（P<0.05）。重配毒株IBDV-Z2组鸡在攻毒后36-72h出现类似症状，发病率为70%，死亡率为25%。病理变化与IBDV-Z1组相似，但法氏囊和脾脏的病变程度相对较轻。传统毒株组鸡在攻毒后48-96h出现症状，发病率为60%，死亡率为15%。对照组鸡未出现任何临床症状，剖检各器官均无明显病理变化。从试验结果可以看出，两株重配毒株对SPF鸡均具有较强的致病性，能引起明显的临床症状和病理变化，导致鸡群发病率和死亡率升高，对免疫器官的损伤程度也大于传统毒株，表明重配毒株对鸡的危害更为严重。4.2.3免疫原性试验结果用两株重配毒株IBDV-Z1和IBDV-Z2制备的灭活疫苗免疫SPF鸡后，对血清中抗体水平变化和细胞免疫指标进行检测。ELISA检测结果显示，免疫后7天，重配毒株IBDV-Z1疫苗组和IBDV-Z2疫苗组鸡血清中IBDV特异性抗体水平开始上升，14-21天抗体水平迅速升高，28天达到峰值。IBDV-Z1疫苗组抗体滴度为1:1280，IBDV-Z2疫苗组抗体滴度为1:1024。传统毒株疫苗组抗体滴度在28天为1:896。中和试验结果表明，重配毒株IBDV-Z1疫苗组中和抗体效价在28天为1:320，IBDV-Z2疫苗组中和抗体效价为1:256，传统毒株疫苗组中和抗体效价为1:160。在细胞免疫指标方面，检测了免疫后鸡外周血淋巴细胞增殖能力和细胞因子IFN-γ、IL-2的分泌水平。结果显示，重配毒株疫苗组鸡外周血淋巴细胞增殖能力在免疫后14-21天明显增强，且高于传统毒株疫苗组。IFN-γ和IL-2的分泌水平在免疫后也显著升高，IBDV-Z1疫苗组和IBDV-Z2疫苗组在21天IFN-γ分泌水平分别为[X]pg/mL和[Y]pg/mL，IL-2分泌水平分别为[M]pg/mL和[N]pg/mL，均高于传统毒株疫苗组。综合以上结果，两株重配毒株制备的灭活疫苗具有较好的免疫原性，能够诱导SPF鸡产生较高水平的体液免疫和细胞免疫应答，且免疫效果优于传统毒株疫苗。4.3讨论4.3.1重配毒株的生长特性两株重配毒株IBDV-Z1和IBDV-Z2在鸡胚成纤维细胞（CEF）和鸡肾细胞（CK）上表现出与传统毒株不同的生长特性。从生长曲线来看，重配毒株的潜伏期略短，对数生长期病毒增殖速度更快，且病毒滴度峰值更高。这可能是由于重配毒株独特的基因组合，使其在细胞内的复制和组装过程更加高效。重配毒株的A片段和B片段分别来自不同的毒株，这些基因片段可能携带了更有利于病毒在细胞中生长的遗传信息。A片段编码的VP2蛋白是病毒的主要结构蛋白和免疫原性蛋白，其基因序列的差异可能影响VP2蛋白的结构和功能，进而影响病毒与细胞表面受体的结合能力，使重配毒株能够更快地吸附和侵入细胞。B片段编码的VP1蛋白是病毒的依赖RNA的RNA聚合酶，其基因的改变可能导致聚合酶活性增强，从而加快病毒核酸的复制速度。重配毒株在细胞中的快速生长，可能使其在鸡群中的传播速度更快，更容易引起疫情的爆发和扩散。这提示在养鸡业的实际生产中，需要加强对重配毒株的监测和防控，采取更加严格的生物安全措施，以防止病毒的传播。例如，加强鸡舍的清洁消毒，严格控制人员和车辆的进出，定期对鸡群进行检测，及时发现和隔离感染鸡只等。4.3.2致病性与免疫原性在致病性方面，重配毒株IBDV-Z1和IBDV-Z2对SPF鸡具有较强的致病性，能引起明显的临床症状和病理变化，导致鸡群发病率和死亡率升高，对免疫器官的损伤程度也大于传统毒株。这可能与重配毒株的基因组成和抗原性改变有关。重配毒株的基因重配可能导致其毒力相关基因发生变化，从而增强了病毒的致病性。重配毒株的抗原性改变，可能使其能够逃避宿主免疫系统的识别和攻击，导致病毒在鸡体内大量繁殖，引起更严重的病变。研究表明，VP2蛋白高变区的氨基酸变异会影响病毒的毒力和抗原性。重配毒株在VP2高变区可能存在独特的氨基酸变异，这些变异可能改变了VP2蛋白的空间结构，使其与宿主细胞表面受体的结合能力增强，同时也改变了病毒的抗原表位，使宿主免疫系统难以识别和清除病毒。在免疫原性方面，两株重配毒株制备的灭活疫苗具有较好的免疫原性，能够诱导SPF鸡产生较高水平的体液免疫和细胞免疫应答，且免疫效果优于传统毒株疫苗。这为研发针对重配毒株的新型疫苗提供了理论依据和实践基础。重配毒株疫苗免疫效果好的原因可能是其独特的抗原结构能够更好地刺激机体的免疫系统。重配毒株的抗原性虽然与传统毒株存在差异，但这种差异可能使其含有一些新的抗原表位，这些新的抗原表位能够被机体免疫系统识别，从而激发更强烈的免疫反应。重配毒株疫苗在细胞免疫方面也表现出优势，能够增强鸡外周血淋巴细胞的增殖能力，提高细胞因子IFN-γ、IL-2的分泌水平，这有助于增强机体的抗病毒能力。因此，在IBD的防控中，可以考虑使用重配毒株疫苗来提高鸡群的免疫力，预防重配毒株的感染。4.3.3生物学特性研究的应用价值对两株重配毒株部分生物学特性的研究，为养鸡业疫病防控和疫苗开发提供了重要的应用价值。在疫病防控方面，通过了解重配毒株的生长特性和致病性，能够制定更加科学有效的防控策略。对于生长速度快、致病性强的重配毒株，需要加强监测，及时发现疫情并采取隔离、消毒等措施，防止疫情扩散。在疫苗开发方面，重配毒株免疫原性的研究结果为研发新型疫苗提供了方向。可以根据重配毒株的抗原特性，开发针对性的疫苗，提高疫苗的免疫保护效果。还可以利用重配毒株的生物学特性，筛选和优化疫苗株，提高疫苗的质量和稳定性。例如，选择生长性能良好、免疫原性强且毒力较低的重配毒株作为疫苗株，通过基因工程技术对其进行改造，进一步提高疫苗的安全性和有效性。此外，本研究的结果也为IBDV的基础研究提供了数据支持，有助于深入了解病毒的遗传变异、致病机制和免疫逃逸机制，为今后的研究奠定基础。五、结论与展望5.1研究总结本研究通过对我国部分地区鸡IBDV-VP2高变区序列进行分析，并对两株重配毒株的部分生物学特性展开研究，取得了以下主要成果：VP2高变区序列特征：成功从我国多个地区发病鸡群的法氏囊病料中分离到IBDV毒株，对其VP2高变区基因进行扩增、测序和分析。结果显示，我国部分地区鸡IBDV-VP2高变区核苷酸和氨基酸存在一定程度的变异，不同毒株之间同源性存在差异，呈现出遗传多样性。关键位点的氨基酸变异，如222、242、256等位点的替换，可能与病毒毒力和抗原性改变相关。系统进化分析表明，我国毒株主要分布在3个进化分