高中生物（必选3）3.2基因工程的基本操作程序知识点

高中生物（必选3）3.2基因工程的基本操作程序知识点整理基因工程的基本操作程序是高中生物必选3模块的核心内容之一，主要包括四个关键步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。以下将逐一梳理各步骤的核心知识点，并配套练习题、答案及解析，帮助深化理解和掌握。一、核心知识点梳理知识点1：目的基因的获取1.目的基因的概念：编码蛋白质的结构基因（如抗虫基因、抗病基因），也可包括一些具有调控作用的因子。2.常用获取方法：（1）从基因文库中获取：①基因文库分类：基因组文库（包含某种生物全部基因）、部分基因文库（如cDNA文库，仅包含某种生物已转录的基因）；②过程：生物基因组DNA切割→与载体连接→导入受体菌→筛选含目的基因的菌落。（2）利用PCR技术扩增目的基因：①原理：DNA半保留复制；②条件：模板DNA、引物（两种不同引物，分别结合目的基因两端）、Taq酶（热稳定DNA聚合酶）、dNTP（原料）、缓冲液；③过程：变性（90-95℃，DNA双链解旋）→复性（55-60℃，引物与模板结合）→延伸（70-75℃，Taq酶合成子链），循环多次可扩增目的基因。（3）人工合成法：①适用场景：目的基因较小、核苷酸序列已知；②方法：化学合成法、反转录法（以mRNA为模板，在逆转录酶作用下合成cDNA，再合成双链DNA）。配套练习题下列关于基因文库的叙述，错误的是（）

A.基因组文库包含某种生物的全部基因

B.cDNA文库仅包含某种生物的部分基因

C.从基因组文库中获取的目的基因可能含内含子

D.cDNA文库构建过程中需要用到限制酶和DNA连接酶，无需逆转录酶

PCR技术扩增目的基因时，下列说法正确的是（）

A.引物的作用是打开DNA双链

B.每次循环都包括变性、复性、延伸三个阶段

C.所用的DNA聚合酶是普通的DNA聚合酶

D.扩增的目的基因数量与循环次数呈线性关系

若目的基因的核苷酸序列已知，且基因片段较短，最简便的获取方法是（）

A.从基因组文库中获取

B.利用PCR技术扩增

C.人工化学合成法

D.反转录法

答案及解析1.答案：D

解析：cDNA文库构建过程为：提取mRNA→在逆转录酶作用下合成cDNA单链→合成cDNA双链→与载体连接→导入受体菌，因此需要逆转录酶，D错误；基因组文库包含生物全部基因，A正确；cDNA文库仅包含已转录的基因（部分基因），B正确；基因组文库中的基因是完整的DNA片段，可能含内含子，C正确。2.答案：B

解析：引物的作用是与模板DNA结合，为DNA聚合酶提供起始结合位点，打开DNA双链依赖高温变性，A错误；PCR每次循环均包括变性、复性、延伸三个阶段，B正确；PCR需用热稳定的Taq酶，普通DNA聚合酶在高温下失活，C错误；扩增的目的基因数量与循环次数呈指数关系（2ⁿ，n为循环次数），D错误。3.答案：C

解析：目的基因核苷酸序列已知且片段较短时，人工化学合成法最简便，直接根据序列合成基因；A项适用于目的基因序列未知的情况；B项适用于目的基因序列已知但片段较长，需大量扩增的情况；D项适用于获取已表达的目的基因，需先获取mRNA，步骤较繁琐，C正确。知识点2：基因表达载体的构建（核心步骤）1.构建目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。2.组成成分及功能：（1）目的基因：核心成分，编码所需蛋白质或调控因子。（2）启动子：位于目的基因上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动目的基因转录。（3）终止子：位于目的基因下游，使转录在相应位置停止。（4）标记基因：用于筛选含目的基因的受体细胞，常用的有抗生素抗性基因（如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因）、荧光蛋白基因（如绿色荧光蛋白基因）。（5）复制原点：使表达载体能在受体细胞中复制。3.构建过程：用同种限制酶切割目的基因和载体→用DNA连接酶连接目的基因和载体→形成重组表达载体（重组质粒）。4.关键工具：①限制酶（切割DNA，产生相同黏性末端或平末端）；②DNA连接酶（连接磷酸二酯键，分E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，前者仅连接黏性末端，后者可连接黏性末端和平末端）。配套练习题基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，下列关于其组成成分的叙述，错误的是（）

A.启动子是RNA聚合酶结合的位点，决定转录的起始

B.终止子可使转录过程在目的基因末端停止

C.标记基因的作用是鉴别受体细胞是否含目的基因，便于筛选

D.复制原点仅保证目的基因在受体细胞中复制

下列关于限制酶和DNA连接酶的说法，正确的是（）

A.限制酶能识别特定的核苷酸序列，并在任意位点切割DNA

B.E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶都能连接平末端和黏性末端

C.构建重组质粒时，需用同种限制酶切割目的基因和质粒，以产生相同末端

D.DNA连接酶连接的是碱基之间的氢键

某科研人员构建重组质粒时，用限制酶EcoRⅠ切割目的基因和质粒，下列说法正确的是（）

A.切割后目的基因和质粒产生的末端一定是平末端

B.连接时需选用E·coliDNA连接酶

C.若目的基因和质粒反向连接，仍可保证目的基因正常表达

D.切割过程中会破坏DNA分子中的磷酸二酯键

构建基因表达载体时，不需要考虑的是（）

A.目的基因的插入位置是否在启动子和终止子之间

B.目的基因与载体的连接方式

C.目的基因的碱基序列是否与受体细胞的密码子偏好一致

D.载体上标记基因的种类

答案及解析1.答案：D

解析：复制原点的作用是使整个重组表达载体在受体细胞中复制，而非仅保证目的基因复制，D错误；A、B、C项分别对应启动子、终止子、标记基因的功能，表述均正确。2.答案：C

解析：限制酶识别特定核苷酸序列，并在特定位点切割DNA，A错误；E·coliDNA连接酶仅能连接黏性末端，T4DNA连接酶可连接黏性末端和平末端，B错误；构建重组质粒时，同种限制酶切割可产生相同末端，便于目的基因与载体连接，C正确；DNA连接酶连接的是DNA片段之间的磷酸二酯键，氢键可自动形成，D错误。3.答案：D

解析：EcoRⅠ是产生黏性末端的限制酶，A错误；连接黏性末端可选用E·coliDNA连接酶或T4DNA连接酶，B错误；目的基因反向连接会导致其转录方向错误，无法正常表达，C错误；限制酶切割DNA的作用是破坏磷酸二酯键，D正确。4.答案：C

解析：目的基因需插入启动子和终止子之间，才能保证转录正常进行，A需考虑；目的基因与载体的连接方式（黏性末端或平末端连接）影响连接效率，B需考虑；标记基因种类影响筛选方式（如抗生素筛选、荧光筛选），D需考虑；目的基因的碱基序列与受体细胞密码子偏好一致与否，影响翻译效率，不属于构建表达载体时需考虑的核心内容（构建时主要保证目的基因能转录），C无需考虑。知识点3：将目的基因导入受体细胞1.受体细胞的选择：需具备繁殖能力强、易培养、能接纳重组载体等特点，常用的有大肠杆菌（微生物）、农杆菌（介导植物转化）、受精卵（动物）、植物体细胞（如叶肉细胞）。2.常用导入方法：（1）导入植物细胞：①农杆菌转化法（最常用，适用于双子叶植物和裸子植物，农杆菌Ti质粒上的T-DNA可将目的基因整合到植物细胞染色体DNA上）；②基因枪法（适用于单子叶植物，如玉米、小麦，将含目的基因的载体包裹在金属颗粒上，轰击植物细胞）；③花粉管通道法（适用于被子植物，将目的基因导入花粉管，随花粉管进入胚囊，与受精卵结合）。（2）导入动物细胞：①显微注射法（最常用，将重组载体直接注射到动物受精卵中）；②病毒介导的转化法（利用病毒的侵染性，将目的基因导入细胞）。（3）导入微生物细胞：①感受态细胞法（常用，如大肠杆菌，用Ca²⁺处理细胞，使细胞膜通透性改变，成为感受态细胞，便于重组质粒进入）；②电穿孔法（利用电场使细胞膜形成小孔，让重组载体进入）。配套练习题下列关于目的基因导入植物细胞方法的叙述，错误的是（）

A.农杆菌转化法适用于大多数双子叶植物

B.基因枪法常用于单子叶植物的转化

C.花粉管通道法无需构建重组表达载体

D.农杆菌的Ti质粒上的T-DNA可将目的基因整合到植物细胞染色体上

将目的基因导入大肠杆菌时，常用Ca²⁺处理大肠杆菌，其目的是（）

A.杀死大肠杆菌中的原有细菌

B.使大肠杆菌成为感受态细胞，便于吸收重组质粒

C.促进大肠杆菌的增殖

D.破坏大肠杆菌的细胞壁，便于重组质粒进入

下列关于目的基因导入动物细胞的说法，正确的是（）

A.常用的受体细胞是动物体细胞

B.显微注射法是最常用的导入方法

C.导入后目的基因仅存在于细胞质中

D.无需构建重组表达载体，直接导入目的基因即可

下列导入方法与受体细胞的搭配，错误的是（）

A.农杆菌转化法——棉花体细胞

B.显微注射法——小鼠受精卵

C.感受态细胞法——酵母菌细胞

D.基因枪法——大豆体细胞（双子叶植物）

答案及解析1.答案：C

解析：花粉管通道法仍需构建重组表达载体，将含目的基因的载体导入花粉管，C错误；A、B、D项均为植物细胞导入方法的正确表述，农杆菌转化法适用于双子叶植物，基因枪法适用于单子叶植物，Ti质粒的T-DNA可整合目的基因到植物染色体DNA上。2.答案：B

解析：Ca²⁺处理大肠杆菌的作用是使细胞膜通透性增加，成为感受态细胞，便于吸收外界的重组质粒，B正确；A、C、D均不是Ca²⁺处理的目的。3.答案：B

解析：导入动物细胞常用的受体细胞是受精卵（全能性高，可发育成完整个体），A错误；显微注射法是动物细胞导入的最常用方法，B正确；导入后目的基因可能整合到细胞染色体DNA上，也可能存在于细胞质中，C错误；导入前必须构建重组表达载体，保证目的基因稳定存在和表达，D错误。4.答案：D

解析：大豆是双子叶植物，常用农杆菌转化法导入目的基因，基因枪法常用于单子叶植物，D搭配错误；A（棉花是双子叶植物，农杆菌转化法适用）、B（小鼠受精卵常用显微注射法）、C（酵母菌可通过感受态细胞法导入）搭配均正确。知识点4：目的基因的检测与鉴定1.检测层次（从分子水平到个体水平）：（1）分子水平检测（核心，分三步）：①检测目的基因是否导入受体细胞（存在检测）：方法为DNA分子杂交技术；原理：碱基互补配对；过程：提取受体细胞DNA→用放射性同位素标记的目的基因作探针→与受体细胞DNA杂交→若出现杂交带，说明目的基因已导入。②检测目的基因是否转录出mRNA（转录检测）：方法为分子杂交技术（RNA分子杂交）；原理：碱基互补配对；过程：提取受体细胞mRNA→用标记的目的基因作探针→与mRNA杂交→出现杂交带，说明目的基因已转录。③检测目的基因是否翻译出蛋白质（翻译检测）：方法为抗原—抗体杂交技术；原理：抗原与抗体特异性结合；过程：提取受体细胞蛋白质→用对应目的基因表达产物的抗体作探针→若出现杂交带，说明目的基因已翻译。（2）个体水平鉴定（功能鉴定）：根据目的基因的功能设计实验，验证其是否发挥作用。如抗虫基因导入棉花后，进行抗虫接种实验，观察棉花是否抗虫；抗病基因导入植物后，接种病原体，观察植物抗病性；目的基因导入动物后，观察其性状是否改变（如生长激素基因导入小鼠，观察小鼠生长速度）。配套练习题下列关于目的基因检测与鉴定的叙述，错误的是（）

A.DNA分子杂交技术可检测目的基因是否导入受体细胞

B.RNA分子杂交技术可检测目的基因是否转录出mRNA

C.抗原—抗体杂交技术可检测目的基因是否翻译出蛋白质

D.个体水平鉴定仅需观察受体细胞的形态变化即可

在目的基因的分子水平检测中，探针的本质是（）

A.含目的基因的DNA片段

B.含目的基因的RNA片段

C.放射性同位素标记的目的基因片段（DNA或RNA）

D.放射性同位素标记的抗体

将抗虫基因导入棉花细胞后，下列检测步骤的先后顺序正确的是（）

①检测目的基因是否导入细胞②检测目的基因是否转录出mRNA③检测目的基因是否翻译出蛋白质④进行抗虫接种实验

A.①②③④B.④①②③C.①③②④D.②①③④

下列属于目的基因个体水平鉴定的是（）

A.用DNA分子杂交技术检测水稻细胞中是否含抗除草剂基因

B.用RNA分子杂交技术检测抗虫棉细胞中是否含抗虫基因的mRNA

C.用抗原—抗体杂交技术检测小鼠细胞中是否含生长激素

D.将含抗病基因的烟草植株接种烟草花叶病毒，观察其是否发病

关于DNA分子杂交和抗原—抗体杂交的说法，正确的是（）

A.两者的原理均为碱基互补配对

B.两者均需用到放射性同位素标记的探针

C.DNA分子杂交检测的是核酸，抗原—抗体杂交检测的是蛋白质

D.两者均可用于目的基因的转录检测

答案及解析1.答案：D

解析：个体水平鉴定需根据目的基因的功能设计实验，验证其是否发挥作用（如抗虫、抗病实验），而非仅观察细胞形态变化，D错误；A、B、C项分别对应分子水平三步检测的方法，表述均正确。2.答案：C

解析：分子水平检测中，探针是用放射性同位素或荧光物质标记的、能与目的基因（或其转录产物mRNA）互补的核酸片段（DNA或RNA），C正确；A、B未提及“标记”，不完整；D是抗原—抗体杂交中抗体的