食药用真菌生物工程第5章(扩充内容)金针菇基因工程

第5章金针菇基因工程表达白藜芦醇金针菇工程菌株的构建一、研究背景2白藜芦醇1.非黄酮类多酚化合物2.植物抗毒素3.自由态和糖苷两种形式存在主要存在于各种浆果、花生以及药用植物（如虎杖）中3抗癌保护神经系统抗心血管疾病白藜芦醇生理活性抗癌抗心血管疾病抗炎抗菌保护神经系统抗疲劳抗衰老白藜芦醇植物体内含量低微，生长周期长，提取过程复杂，组培成本高易污染路线长，成本高，环境污染大4主要来源微生物异源表达植物提取化学合成白藜芦醇来源当下研究热点食用菌，营养价值丰富，培养周期短，安全无毒RS

白藜芦醇生物合成关键酶白藜芦醇合酶（RS)4香豆酸：辅酶A连接酶（4CL）肉桂酸4-羟基化酶（C4H）苯丙氨酸解氨酶（PAL）5白藜芦醇生物合成途径6遗传转化体已有所报道。金针菇金针菇蛋白质含量高，氨基酸种类丰富，含有多种维生素和各种微量元素，还含有抗癌和提高免疫功能的活性物质，营养价值较高。含有多酚类化合物代谢途径。7构建含有4cl和rs基因的代谢组合表达载体含有潮霉素抗性基因的表达载体金针菇原生质体拟转化子转化子产白藜芦醇的金针菇工程菌株二、技术路线三、研究方法与结果分析8RS

9表达载体pgfvs-4cl的构建表达载体pgfvs-4cl的构建10图1.1pgFvs-hph

和pgLes-G4cl的PstⅠ和BsrGⅠ双酶切图M.分子量标准；1：pgFvs-hphPCR扩增条带；2：质粒pgLes-G4cl的PstⅠ和BsrGⅠ双酶切产物。M11M图1.2质粒pgfvs-4cl酶切鉴定图M.分子量标准；1-2：质粒pgfvs-4cl的PstⅠ和BsrGⅠ双酶切鉴定图。华南农业大学博士生毕业答辩11RS

表达载体pgFvs-vrs2的构建表达载体pgFvs-vrs2的构建华南农业大学博士生毕业答辩12M124587bp752bp图1.3质粒pgles-vrs2和pgFvs-hph酶切图M.分子量标准；1：质粒pgFvs-hph的SpeI和sacⅡ双酶切；2：质粒pgles-vrs2的SpeI和sacⅡ双酶切。图1.4质粒pgFvs-vrs2酶切鉴定图M.分子量标准；1：质粒pgFvs-vrs2的酶切。13RS

一个表达框的表达载体pgfvs-4cl-vrs①

一个表达框的表达载体pgfvs-4cl-vrs①14图1.5pgLes-G4cl的PCR扩增和质粒pgFvs-vrs2的酶切1-3：pgLes-G4cl为模板，进行PCR扩增。4：质粒pgFvs-vrs2的Spe

I酶切图。M.分子量标准。图1.6质粒pgfvs-4cl-vrs①的酶切鉴定M.分子量标准；1：质粒pgfvs-4cl-vrs①BsrGⅠ酶切鉴定。15图2.1血球计数板中的金针菇原生质体PEG介导法转化金针菇PEG介导法转化金针菇1650μg/ml为菌丝体致死浓度25μg/ml为原生质体致死浓度PEG介导法转化金针菇17图2.4拟转化子再生A：拟转化子（转化原生质体，潮霉素筛选）B：阴性对照（未转化原生质体，潮霉素筛选）图2.5拟转化子的多次筛选金针菇工程菌株的鉴定18图2.6金针菇拟转化子的PCR鉴定（引物STS-F/STS-R和4s-1/4s-2）A：拟转化子的PCR鉴定利用引物STS-F/STS-R；B：拟转化子的PCR鉴定利用引物4s-1/4s-2。M：DNA分子量标准DL4500；泳道1-7：拟转化子；泳道+,阳性对照质粒pgfvs-4cl-vrs①的PCR产物；-，未转基因金针菇的PCR产物。19ABCDE图2.7转化子转接10次后菌丝体对潮霉素的耐受性测试图2.8转化子的PCR鉴定（引物4s-1/4s-2）金针菇工程菌株的鉴定20图2.9转化子的RT-PCR鉴定A：拟转化子的RNA的提取；B：拟转化子的PCR鉴定利用引物STS-F/STS-R；C：拟转化子的PCR鉴定利用引物4s-1/4s-2。M：DNA分子量标准DL2000；泳道-：未转化金针菇的RT-PCR产物；+：阳性对照质粒pgfvs-4cl-vrs①的PCR产物；泳道1～4：转化子的RT-PCR（TF71,TF72,TF7E,TF7H）金针菇工程菌株的鉴定目标产物白藜芦醇检测2122图2.10金针菇工程菌菌丝体高效液相色谱图A：白藜芦醇标样（10mg/L）；B：转化子TF71；C：转化子TF7E；D：转化子TF7H；E：非转化子目标产物白藜芦醇检测目标产物白藜芦醇检测233株工程菌株菌丝体中检测到白藜芦醇，说明4cl和rs基因插入金针菇基因组内可以正常表达得到目的产物。目标产物白藜芦醇检测24图2.11金针菇工程菌发酵液高效液相色谱图A目标产物白藜芦醇检测25目的产物不仅存在菌丝体内，也有部分分泌到了发酵液内。将可以产白藜芦醇的金针菇工程菌株进行出菇实验，以进一步研究在相同栽培条件下，金针菇工程菌株的生物学特性和栽培特性与亲本相比是否存在差异。26工程菌株出菇实验表2.1转基因金针菇和亲本生物学特征（17℃恒温）27菌株strain满袋期sackful生长势tendency原基数primordia菌柄stipe颜色color

菌柄高度(cm)height生物学效率(%)biologicalefficiency(%)F728d较强多较粗壮黄13.88±0.3638.50±0.86TF7132d弱多粗壮浅黄10.83±1.12*33.44±1.42*TF7229d较强较少较粗壮黄12.33±1.06*37.61±1.23TF7E29d强较多粗壮较黄11.00±0.45*33.76±1.34*TF7H32d强少粗壮浅黄10.03±1.34*31.72±1.31*工程菌株出菇实验28图2.12栽培袋中转基因金针菇和亲本的菌丝生长状况A：转化子TF71；B：非转化子F7工程菌株出菇实验29ABCDEF图2.13转基因金针菇和亲本的原基形成A：非转化子；B：转化子TF71；C，D：转化子TF7E；E，F：转化子TF7H菌丝满袋后同一时间搔菌原基出现情况存在不同工程菌株出菇实验30图2.14转基因金针菇和亲本的子实体形态A：非转化子；B：转化子TF71；C：转化子TF7E；D：转化子TF7H工程菌株出菇实验工程菌株基本成分分析本部分研究将以金针菇工程菌株TF71、TF7H和传统菌株F7为实验菌株，分别进行基本成分以及白藜芦醇代谢途径相关的成分白藜芦醇、香豆酸和黄酮类化合物分析，从而进一步推测4cl与rs基因引入金针菇基因组后对金针菇带来了哪些变化以及影响。31成分b含量（g/100g）F7TF71TF7H文献范围d水分87.01±1.28a

86.57±0.62b

86.43±0.88c

84-89粗蛋白19.31±0.06a

15.17±0.12b

15.94±0.14c

8.39-11.80碳水化合物66.04±1.23a65.92±0.59b

64.79±0.96c

43.33-69.40粗纤维粗脂肪灰分3.70±0.65a

2.43±0.45a

6.37±0.53a

3.66±0.77b

2.38±0.97b

6.56±0.67b

3.72±0.82a

2.32±1.01c

6.42±0.57c

1.90-7.401.79-2.914.91-7.4032表2.2转基因和亲本对照金针菇子实体基本成分比较两个转基因样品中的各基本成分与对照存在显著性差异，但是他们的含量都在可接受的范围之内，转基因金针菇的基本成分与亲本对照F7相比，具有一致性。工程菌株基本成分分析表2.3转基因金针菇氨基酸测定成分含量

(g/100g干重)文献范围F7TF7HTF71Literaturerange*

赖氨酸

异亮氨酸苯丙氨酸苏氨酸缬氨酸亮氨酸甲硫氨酸0.96±0.01a0.56±0.03a0.72±0.03a

0.81±0.01a0.76±0.05a0.98±0.05a1.88±0.02a0.85±0.04b0.46±0.02b

0.65±0.03b

0.73±0.05b

0.63±0.03b

0.83±0.01b

2.08±0.08b0.85±0.02b0.58±0.02a0.66±0.04b

0.82±0.06a

0.78±0.03c

1.03±0.02c1.77±0.01c0.53-1.030.50-1.960.50-0.790.50-0.830.59-0.820.64-1.390.19-3.10丝氨酸0.81±0.03a0.77±0.04b

0.75±0.09c

0.55-0.87谷氨酸3.00±0.06a3.20±0.05a

2.22±0.07b2.00-3.80甘氨酸0.70±0.04a

0.63±0.02b

0.69±0.06a

0.44-0.74丙氨酸1.26±0.01a

1.20±0.03b

1.20±0.04b

0.70-1.32胱氨酸0.13±0.03a0.11±0.01a0.15±0.05a

0.087-0.31天冬氨酸1.28±0.07a1.15±0.03b

1.26±0.05a

0.94-1.02酪氨酸0.51±0.02a

0.50±0.06a

0.47±0.08b

0.21-0.52组氨酸0.31±0.04a0.29±0.06a

0.31±0.03a

0.16-0.63精氨酸必需氨基酸0.69±0.10a

6.67a0.70±0.09a

6.23b

0.79±0.11b

6.49c

0.44-0.874.50-6.77总氨基酸15.37a

14.70b14.37c

11.52-17.02必需氨基酸所占比例43.4%42.3845.1633工程菌株的氨基酸含量与原种相比较均有不同，但是工程菌株的所有氨基酸成分均在