单克隆抗体筛选及杂交瘤细胞培养方法

单克隆抗体筛选及杂交瘤细胞培养方法单克隆抗体因其特异性强、均一性好、可大量制备等特点，在生命科学研究、疾病诊断及治疗领域发挥着不可替代的作用。杂交瘤技术作为制备单克隆抗体的经典方法，其核心在于通过细胞融合获得杂交瘤细胞，并从中筛选出能稳定分泌目标抗体的单克隆细胞株。本文将围绕单克隆抗体的筛选策略及杂交瘤细胞的培养技术展开讨论，重点阐述关键步骤、常见问题及其实践中的优化要点，旨在为相关领域的研究者提供一套系统且具操作性的实验方案。单克隆抗体制备的前期准备与融合杂交瘤技术的成功与否，很大程度上取决于前期准备工作的细致程度。免疫方案的设计需充分考虑抗原的性质、免疫动物的选择以及免疫途径与剂量的优化。通常，对于可溶性蛋白抗原，采用皮下多点注射结合佐剂的方式可有效激发机体免疫应答；而对于弱免疫原性抗原，可能需要多次加强免疫或采用基因免疫等策略。免疫结束后，需通过血清效价检测评估免疫效果，选择效价高且亲和力好的动物用于后续融合。骨髓瘤细胞的选择与培养是另一关键环节。常用的骨髓瘤细胞株如SP2/0、NS0等，均缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）或胸腺嘧啶核苷激酶（TK），以便在融合后利用HAT培养基进行选择性培养。在融合前，骨髓瘤细胞应处于对数生长期，活力高于95%，且需确保无支原体等微生物污染。细胞融合通常采用聚乙二醇（PEG）法。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞按适当比例混合，在37℃下缓慢滴加预热的PEG溶液，轻柔混匀后静置，随后用不完全培养基终止PEG作用。此过程中，PEG的分子量、浓度及作用时间均需严格控制，以兼顾融合效率与细胞活性。融合后的细胞悬液经离心洗涤后，重悬于含饲养细胞（如小鼠腹腔巨噬细胞或胸腺细胞）的HAT选择培养基中，接种于96孔细胞培养板，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。饲养细胞不仅能提供营养支持，还可分泌一些促进杂交瘤细胞生长的细胞因子。单克隆抗体的筛选策略融合后的细胞在HAT培养基中培养约一周后，即可开始对上清液中的抗体进行检测。筛选的目的是从大量杂交瘤细胞克隆中，快速、准确地鉴定出能稳定分泌特异性抗体的阳性克隆。一个理想的筛选方法应具备特异性强、灵敏度高、操作简便、成本可控且适合大规模筛选等特点。酶联免疫吸附试验（ELISA）是目前应用最为广泛的初筛方法，尤其适用于可溶性抗原。间接ELISA法通过将抗原包被于酶标板，与杂交瘤细胞上清中的抗体结合，再利用酶标记的二抗进行显色检测，可直观反映抗体的存在及其相对滴度。对于细胞表面抗原或病毒颗粒等，免疫荧光法（IFA）或流式细胞术（FACS）则更为适用，能够直接观察抗体与天然构象抗原的结合情况。此外，根据抗原特性及研究需求，还可选用免疫印迹（WesternBlot）、放射免疫测定（RIA）或中和试验等方法进行筛选。初筛获得的阳性克隆往往含有多个细胞克隆，需进行亚克隆以获得单克隆细胞株。有限稀释法是最常用的亚克隆技术，将阳性孔细胞进行梯度稀释后，接种于含饲养细胞的96孔板中，使每孔理论上只含有一个细胞。待克隆长至孔底面积的10%-20%时，再次进行抗体检测，选取单个阳性克隆进行扩大培养和再次亚克隆。通常，亚克隆需重复2-3次，以确保获得遗传背景均一、抗体分泌稳定的单克隆细胞株。在筛选过程中，需特别注意设立严格的阴性对照和阳性对照，以排除非特异性反应和假阳性结果。阴性对照应包括未免疫小鼠血清、骨髓瘤细胞培养上清或仅含培养基的空白对照；阳性对照则可采用已知的特异性抗体或高免血清。同时，筛选时机的把握也至关重要，过早筛选可能因抗体分泌量低而漏检，过晚则可能因阴性克隆过度生长而影响阳性克隆的检出和后续培养。杂交瘤细胞的培养与建系获得阳性单克隆细胞株后，需进行扩大培养与建系，为后续的抗体生产、纯化及细胞冻存奠定基础。杂交瘤细胞的培养特性介于正常细胞与肿瘤细胞之间，其生长需要丰富的营养环境，并对培养条件的变化较为敏感。细胞培养基的选择是保证杂交瘤细胞良好生长和稳定分泌抗体的核心。基础培养基通常选用RPMI1640或DMEM，添加10%-20%的胎牛血清（FBS）以提供生长所需的生长因子、激素、脂质及贴壁因子等。血清的质量对杂交瘤细胞生长影响显著，因此需对不同批次的血清进行筛选，选择支持细胞生长良好且批次间差异小的产品。对于长期培养或大规模生产，可考虑使用无血清培养基，以减少血清批次差异带来的影响，并有利于后续抗体的纯化。此外，培养基中还需添加谷氨酰胺（或其替代物）、青霉素、链霉素等，以维持细胞代谢和防止污染。杂交瘤细胞的培养方式包括贴壁培养和悬浮培养。在实验室规模，初期可采用T25、T75细胞培养瓶进行贴壁或半悬浮培养，待细胞密度达到一定程度后进行传代。传代时需注意控制接种密度，一般以1×10⁴-1×10⁵cells/mL为宜，避免细胞过度密集或生长过密导致营养耗尽及代谢产物积累。对于需要大量制备抗体的情况，可采用细胞工厂、摇瓶或生物反应器进行悬浮培养，通过优化搅拌速度、通气量、pH值和溶氧等参数，实现细胞的高密度培养和抗体的高效表达。细胞培养过程中，需密切观察细胞形态和生长状态。健康的杂交瘤细胞通常呈圆形或椭圆形，折光性好，大小均一，悬浮生长或轻微贴壁。若发现细胞形态不规则、折光性差、出现大量碎片或贴壁细胞脱落，则提示细胞生长异常，可能是由于营养缺乏、代谢产物积累、污染或支原体感染等原因所致，需及时排查并采取相应措施。杂交瘤细胞的克隆化与稳定性检测尽管经过一次亚克隆，仍有可能存在多个细胞克隆混合生长的情况，因此，对阳性克隆进行多次克隆化是确保单克隆性的关键。有限稀释法仍是最常用的克隆化手段，但其效率有时较低。为提高克隆形成率，可在培养基中添加饲养细胞，或采用半固体培养基克隆化法，利用甲基纤维素等物质形成凝胶环境，使单个细胞在其中增殖形成可见的细胞集落，便于挑选单个克隆。克隆化后的细胞株需进行长期的稳定性监测。连续传代培养是评估细胞株稳定性的常用方法，将细胞在体外连续传代20-30代，定期检测抗体分泌水平和特异性。若抗体效价和特异性保持稳定，则表明该细胞株具有较好的遗传稳定性。此外，也可通过冻存复苏实验来考察细胞株的稳定性，将克隆化后的细胞冻存于液氮中，复苏后观察其生长情况和抗体分泌能力，若与冻存前无显著差异，则说明细胞株在冻存过程中未发生明显的遗传改变。对于需要长期保存的杂交瘤细胞株，应及时进行冻存。冻存液通常为含10%-20%DMSO和20%-40%FBS的完全培养基。冻存时，将处于对数生长期的细胞离心后重悬于冻存液中，分装于冻存管，梯度降温（如4℃30分钟，-20℃1-2小时，-80℃过夜，最后转入液氮长期保存）。复苏时，需将冻存管从液氮中取出后迅速置于37℃水浴中融化，离心去除冻存液，用新鲜培养基重悬后接种培养。融合后克隆的筛选与培养中的常见问题及对策在杂交瘤细胞的筛选与培养过程中，常常会遇到各种问题，影响实验的顺利进行。假阳性结果是筛选阶段常见的困扰之一，其产生原因可能包括：饲养细胞或骨髓瘤细胞自身分泌的非特异性抗体、抗原不纯含有杂蛋白、ELISA检测时的交叉反应或操作污染等。为减少假阳性，除设立严格对照外，可采用两种不同原理的检测方法进行交叉验证，例如将ELISA阳性的克隆再用WesternBlot或IFA进行复核。同时，确保实验所用试剂的纯度和质量，规范操作流程，避免交叉污染。杂交瘤细胞生长缓慢或不生长也是实验中经常遇到的问题。可能的原因有：融合效率低，阳性克隆数量少；HAT培养基配制不当或使用过期培养基；饲养细胞活力不足或数量不够；细胞污染（如细菌、真菌、支原体等）。针对这些情况，首先应检查培养基的配方和有效期，确保HAT选择压力适宜。若怀疑污染，需对细胞进行支原体检测，并及时更换污染的培养物。对于生长缓慢的克隆，可尝试更换新鲜培养基，添加条件培养基（如培养过骨髓瘤细胞的上清）或适当提高血清浓度，以促进细胞生长。抗体分泌不稳定或丢失是杂交瘤细胞长期培养中面临的主要挑战。这可能与细胞遗传不稳定性、染色体丢失、培养条件改变或某些未知的表观遗传调控有关。为提高细胞株的稳定性，应尽可能在早期获得高度克隆化的细胞株，并在传代过程中避免过度稀释或过度生长。定期进行抗体分泌水平检测，一旦发现效价下降，应及时进行亚克隆，挑选仍能稳定分泌抗体的子克隆。此外，将细胞尽早冻存于液氮中，可在一定程度上保存其原始特性。细胞污染是细胞培养的大敌，一旦发生，不仅会导致实验失败，还可能污染其他细胞株。预防污染的关键在于严格遵守无菌操作规范，定期对培养箱、超净台等设备进行清洁消毒，使用无菌的试剂和耗材。对于疑似污染的细胞，应立即隔离培养，进行鉴定。若确认为细菌或真菌污染，轻度污染时可尝试使用抗生素处理，但效果往往有限；严重污染时则应果断弃去，以免扩散。支原体污染因其隐蔽性强、难以清除，危害更大，需采用特异性的支原体检测试剂盒进行常规筛查，一旦发现，建议丢弃污染细胞，或使用商品化的支原体清除试剂进行处理，并在处理后进行多次检测确认无污染。总结与展望单克隆抗体的筛选及杂交瘤细胞的培养是一项技术性强、操作繁琐且需要耐心与细致的工作。从免疫、融合、筛选到克隆化和扩大培养，每一个环节都需要严格控制实验条件，优化实验参数。高效的筛选策略能够快速锁定目标阳性克隆，而优良的培养技术则是维持杂交瘤细胞稳定生长和抗体持续分泌的保障。在实践中，研究者应根据自身实验目的和抗原特性，灵活选择和优化实验方案，及时总结经验，解决实验中出现的各种问题。随着生物技术的不断发展，一些新的技术方法正逐渐应用于单克隆抗体制备领域，如噬菌体展示技术、核糖体展示技术等，这些技术无需细胞融合，可直接从免疫文库中筛选人源抗体基因，具有快速高效的优点。然而，杂交瘤技术作为经典