生物制药试题及答案

生物制药试题及答案1.单项选择题（每题2分，共20分）1.1在CHO细胞中表达单克隆抗体时，最常被敲除以抑制岩藻糖基化的基因是A.FUT4 B.FUT8 C.GMDS D.MGAT3答案：B解析：FUT8编码α-1,6-岩藻糖基转移酶，敲除后可显著降低抗体Fc区的岩藻糖水平，从而增强ADCC效应。1.2下列哪一项不是用于测定蛋白A层析柱动态结合载量（DBC）的常用流速A.100cmh⁻¹ B.200cmh⁻¹ C.300cmh⁻¹ D.500cmh⁻¹答案：D解析：500cmh⁻¹远超常规蛋白A层析推荐线性流速（50–300cmh⁻¹），会导致压力超限、填料压缩及结合载量虚高。1.3对于双特异性抗体（BsAb）的“knobs-into-holes”设计，下列配对正确的是A.knob在重链CH3区引入T366Y，hole引入Y407TB.knob在重链CH3区引入T366W，hole引入Y407AC.knob在重链CH3区引入T366Y，hole引入T366WD.knob在重链CH3区引入Y407T，hole引入T366Y答案：B解析：T366W形成knob，Y407A形成hole，可促使异源二聚体优先形成，同源二聚体因空间位阻被抑制。1.4在生物反应器放大过程中，保持下列哪一参数恒定最能确保细胞剪切环境相似A.P/V（单位体积功率） B.k_La C.混合时间 D.表观气速答案：A解析：P/V决定湍流涡旋尺度，直接影响细胞所受剪切力；放大时维持P/V恒定可最大限度保留剪切环境。1.5下列哪种质粒元件对提高CHO细胞中长期抗体表达稳定性贡献最小A.MAR B.UCOE C.WPRE D.IRES答案：D解析：IRES仅用于双顺反子共表达，对抗体轻链/重链平衡有帮助，但对长期基因沉默防护作用有限；MAR、UCOE、WPRE均可抑制染色质沉默。1.6采用DoE（实验设计）优化上游工艺时，若研究三因素两水平并考虑所有两因子交互作用，最少需进行几次实验A.4 B.8 C.11 D.16答案：C解析：全因子2³=8次，加上3个中心点共11次，可满足所有主效应及两因子交互作用估计。1.7下列哪一项不是单克隆抗体电荷异构体形成的主要原因A.天冬酰胺脱酰胺 B.甲硫氨酸氧化 C.C端赖氨酸剪切 D.甘露糖-5糖型答案：D解析：甘露糖-5属于糖型异构，不影响抗体等电点；其余三项均会改变表面电荷。1.8在病毒清除验证中，对小型非包膜病毒最稳健的清除步骤通常是A.低pH孵育 B.蛋白A层析 C.阴离子交换层析 D.纳米膜过滤答案：D解析：20nm级纳米膜可基于尺寸排阻机制去除细小病毒，对非包膜病毒清除能力高达≥4log₁₀，稳健性最好。1.9使用CE-SDS（还原）检测抗体纯度时，下列哪种还原剂最常用且与后续胶分离兼容A.DTT B.TCEP C.β-ME D.GSH答案：B解析：TCEP在中性pH下无异味、不还原胶内二硫键，且带正电荷不影响电泳迁移。1.10对ADC药物进行DAR（药物抗体比）测定，下列哪种方法可直接给出平均DAR且无需标准品A.HIC-HPLC B.LC-MS完整蛋白模式 C.UV/Vis分光 D.RP-HPLC答案：B解析：LC-MS完整蛋白模式利用去卷积质谱可直接计算载药分布及平均DAR，无需外标。2.判断题（每题1分，共10分，正确写“T”，错误写“F”）2.1在Fed-batch培养中，谷氨酰胺浓度超过8mM会显著增加乳酸生成。答案：T解析：高谷氨酰胺经谷氨酰胺酶代谢产氨，促进糖酵解，乳酸上升。2.2采用PF68（0.1%w/v）可完全消除2000L搅拌式反应器中的泡沫。答案：F解析：PF68仅降低泡沫稳定性，高气体流量下仍需机械消泡桨或硅油辅助。2.3对于IgG4抗体，体内半衰期与FcRn结合亲和力呈正相关。答案：T解析：FcRn回收机制决定IgG血清稳定性，亲和力越高，半衰期越长。2.4在QbD框架中，CQA仅包括临床安全有效性相关质量属性。答案：F解析：CQA还包括工艺可控性、法规符合性相关属性，如糖型、聚集体。2.5使用Doehlert设计可在三因子空间实现连续移动，便于后续最陡爬坡。答案：T解析：Doehlert矩阵具有均匀空间填充性，适合序贯优化。2.6对于双水相萃取（ATPE），PEG分子量越高，抗体分配系数K越趋近于1。答案：F解析：PEG分子量升高会增大上相疏水性，抗体K值通常下降。2.7在病毒灭活低pH步骤，若蛋白浓度>20gL⁻¹，需延长孵育时间以确保≥4log₁₀清除。答案：T解析：高蛋白可缓冲pH，保护病毒，需延长时间或降低pH。2.8采用MabSelectPrismA™填料时，DBC随停留时间缩短线性增加。答案：F解析：DBC与停留时间呈指数饱和关系，过短停留导致载量骤降。2.9对于ADC，药物Linker中引入磺酸基可提高亲水稳定性并降低聚集。答案：T解析：磺酸基增加负电荷，降低疏水相互作用，抑制聚集。2.10在生物类似药可比性研究中，强制降解试验需覆盖氧化、脱酰胺、光照、高温四种应力。答案：T解析：ICHQ5B要求全面应力以揭示潜在差异。3.填空题（每空2分，共20分）3.1在CHO细胞中，抗体重链与轻链通过________结构域配对形成异二聚体，其界面关键盐桥由重链________位天冬氨酸与轻链________位精氨酸构成。答案：CH1-CL；D221；R214解析：X-ray晶体学显示该盐桥对正确配对至关重要。3.2根据Nernst-Planck方程，离子交换层析中传质通量J与电场梯度∇φ关系为：J其中z代表________，F为________常数。答案：离子价态；法拉第3.3采用中心复合设计（CCD）研究三因子时，若轴向距离α取________，则设计具有________性，可直接拟合二阶模型。答案：1.682；正交旋转3.4在ADC制备中，若Linker采用vc-PAB（val-cit-p-aminobenzyl），其酶切依赖组织蛋白酶________，该酶在________体中活性最高。答案：CathepsinB；溶酶体3.5根据Michaelis-Menten方程，当底物浓度[S]=3K_m时，反应速率v与最大速率V_max之比为________。答案：0.75解析：v3.6在病毒过滤验证中，若挑战液含颗粒·mL⁻¹的PPV，过滤后检出颗粒·mL⁻¹，则LRV=________。答案：6解析：LRV=log₁₀(10⁸/10²)=6。3.7用于高浓度制剂（>100mgmL⁻¹）的抗体，若其自相互作用第二维里系数B₂₂为________×10⁻⁴molmLg⁻²，则表明存在弱吸引，可接受。答案：-1～-53.8在培养基优化中，若铜离子浓度从0.1μM提高到1μM，可导致抗体________型糖型比例上升，其结构为________。答案：G2F；Galα1-3Galβ1-4GlcNAc3.9根据Arrhenius方程，若某抗体在4°C降解速率常数k₄=2×10⁻⁷day⁻¹，在40°C为k₄₀=5×10⁻⁵day⁻¹，则活化能E_a≈________kJmol⁻¹。答案：96解析：ln3.10在双模过滤（TFF）中，若膜通量J=30Lm⁻²h⁻¹，蛋白传质系数k=20Lm⁻²h⁻¹，则极化层浓度C_w与主体浓度C_b比值可用________方程估算，其值≈________。答案：薄膜凝胶；1.6解析：=若考虑凝胶点限制，实际约1.6。4.简答题（每题10分，共30分）4.1阐述在Fed-batch培养中，通过动态调节葡萄糖浓度以控制乳酸生成的策略，并给出闭环控制算法框图。答案：策略：将葡萄糖设定为2–3mM的“饥饿窗口”，利用在线葡萄糖分析仪（如YSI）每5min采样，结合PID控制器调节泵速。当乳酸>20mM且葡萄糖<1mM时，暂停补糖；当乳酸<10mM且葡萄糖<2mM时，启动脉冲补糖（每次0.5gL⁻¹）。算法框图：```Glu_measured→Comparator→PID→PulsePump→Culture↑Glu_set=2.5mM```参数：K_p=0.8h⁻¹，K_i=0.05h⁻²，K_d=0.2h。结果：乳酸峰值从35mM降至15mM，积分活细胞密度（IVCD）提高18%。4.2说明如何利用氢氘交换质谱（HDX-MS）定位抗体聚集热点，并给出实验流程与数据分析公式。答案：流程：1.将抗体分别稀释至1mgmL⁻¹于D₂O缓冲液（pD7.0）；2.0–240min时间梯度交换，淬灭（pH2.5，0°C）；3.胃蛋白酶在线酶切，UPLC分离，OrbitrapMS检测；4.提取肽段同位素分布，计算氘代率D(t)：D5.与单体对照比较，若某肽段ΔD>5%且p<0.01，定义为“热点”；6.结构映射发现CH2区342–360序列氘代减慢，提示局部折叠稳定，聚集可能通过该界面介导；7.引入W347K突变，SEC显示聚集体由8%降至1%，验证热点。4.3比较ProteinA层析与混合模式（MM）层析在抗体捕获阶段的优劣，并给出经济性模型。答案：ProteinA：优势——选择性极高，一步可>95%纯度；劣势——介质贵（$15kL⁻¹），配基脱落需后续清除。MM（CaptoMMC）：优势——耐盐上样，可用HETP直接捕获细胞培养液，介质价低（$5kL⁻¹）；劣势——纯度仅80%，需后续精纯。经济性模型：设年产量500kg，ProteinA方案需两步层析，Cycle200次，介质寿命100次，需2套；MMC方案需三步，Cycle300次，介质寿命150次，需2套。CAPEX：ProteinA介质成本=2×20L×15k=600kOPEX：ProteinA缓冲液+缓冲罐=120k按10年折旧，NPV@8%：ProteinA=1.4M结论：若下游无瓶颈，MMC更经济；若需快速上市，ProteinA时间成本更低。5.计算题（每题10分，共20分）5.1某抗体在pH5.0条件下进行阳离子交换层析，其电荷分布服从Henderson-Hasselbalch方程，已知pI=7.8，分子量150kDa，结合区可及正电荷数Z=12。若填料平均电荷密度σ=0.15M，求理论结合容量q_max（mgmL⁻¹）。假设1:1静电配对，且忽略空间位阻。答案：=实际因孔道限制，实验值约60mgmL⁻¹，理论值仅为上限。5.2在20L搅拌罐中，培养CHO细胞，目标活细胞密度X=20×10⁶cellsmL⁻¹，比耗氧率q_O₂=5×10⁻¹⁰mmolcell⁻¹h⁻¹，若k_La需满足OTR≥OUR，求最小k_La。已知氧气溶解度C=0.21mM，操作C=0.05mM。5.2在20L搅拌罐中，培养CHO细胞，目标活细胞密度X=20×10⁶cellsmL⁻¹，比耗氧率q_O₂=5×10⁻¹⁰mmolcell⁻¹h⁻¹，若k_La需满足OTR≥OUR，求最小k_La。已知氧气溶解度C=0.21mM，操作C=0.05mM。答案：OUROTR=故最小k_La=62.5h⁻¹，对应P/V≈40Wm⁻³。6.综合设计题（20分）背景：某生物类似药抗HER2单抗，原研参比制剂（RMP）为冻干粉，糖型G0F60%、G1F30%、G2F10%，聚集体<1%，ADCC活性EC₅₀=50ngmL⁻¹。现需设计一条3×500L并联Fed-batch生产线，要求：1.糖型分布与RMP差值<5%；2.聚集体<0.5%；3.单批次成本≤$150k；4.年产能≥1.5t。任务：a.制定上游、下游及制剂整体方案；b.给出关键控制策略（CPP、CQA、KPI）；c.估算年产能与成本；d.提出可比性研究矩阵。答案：a.方案上游：CHO-K1GS系统，化学限定培养基，Fed-batch14天，温度-shift37→33°C第3天，Cu²⁺0.5μM，Mn²⁺5μM，调节UDP-Gal水平，使G1F+G2F≈40%。下游：深层过滤→蛋白A（MabSelectPrismA™，DBC60gL⁻¹）→低pH病毒灭活→阳离子（SPHP）→阴离子（QHP）→病毒过滤→超滤浓缩→20nm过滤。制剂：组氨酸-蔗糖缓冲，pH5.5，150mgmL⁻¹，预充式注射器。b.控制策略CPP：培养Day3温度、Cu²⁺浓度、蛋白A上样密度、低pH孵育时间、UF通量。CQA：糖型分布、聚集体、宿主蛋白（HCP<50ppm）、蛋白A脱落<10ppm、ADCC活性。KPI：IVCD>80×1