生物技术在生物制药临床研究中的应用考核试卷及答案

生物技术在生物制药临床研究中的应用考核试卷及答案一、单项选择题（每题2分，共20分）1.在CAR-T细胞制备过程中，最常用的基因转导载体是A.腺病毒B.慢病毒C.AAVD.质粒答案：B解析：慢病毒可高效感染人T细胞并整合基因组，实现CAR基因长期稳定表达。2.用于预测单克隆抗体免疫原性的insilico工具中，以下哪项算法基于MHC-II结合亲和力打分？A.NetMHCpanB.RAPIDC.RosettaD.MODELLER答案：A解析：NetMHCpan通过人工神经网络预测肽段与MHC-II分子的结合亲和力，是免疫原性虚拟筛选的核心算法。3.在双特异性抗体构建中，若采用“CrossMab”技术，其关键改造位点位于A.CH1/CLB.VH/VLC.CH2/CH3D.铰链区答案：A解析：CrossMab通过交换一条重链的CH1与对应轻链的CL，防止错配。4.基于CRISPR-Cas9的体外基因编辑中，降低脱靶风险的最有效策略是A.使用Cas9mRNAB.使用双切口酶Cas9nC.提高MOID.使用质粒载体答案：B解析：Cas9n仅产生单链断裂，需成对gRNA引导才能产生DSB，显著提高特异性。5.在生物类似药临床比对试验中，证明“生物相似性”的统计准则通常采用A.非劣效界值15%B.等效界值（0.8–1.25）C.优效界值5%D.置信区间90%答案：B解析：EMA/FDA指南规定，主要药动学参数几何均值比的90%CI须落在0.8–1.25之间。6.用于mRNA疫苗体外转录的T7RNA聚合酶最适反应离子强度为A.10mmol/LMg²⁺B.25mmol/LMg²⁺C.5mmol/LMn²⁺D.50mmol/LNa⁺答案：B解析：25mmol/LMg²⁺可平衡产量与产物完整性，过高导致RNA降解。7.在单细胞RNA-seq数据分析中，去除批次效应最常用的算法是A.t-SNEB.HarmonyC.SeuratD.Monocle答案：B解析：Harmony利用线性模型快速校正批次，保留真实生物学差异。8.以下哪项不是ADC药物临床I期剂量递增设计的核心参数？A.MTDB.OBDC.RDID.AUC答案：C解析：RDI（相对剂量强度）用于评估给药延迟，不直接决定起始剂量。9.在宿主细胞蛋白（HCP）ELISA检测中，覆盖率验证的金标准是A.2D/WesternblotB.LC-MS/MSC.SPRD.qPCR答案：A解析：2D分离后Westernblot可直观显示抗体对HCP的识别覆盖率。10.基于微生理系统（MPS）的肝-肠-肿瘤三联模型中，最适流速（μL/h）范围为A.10–30B.50–100C.200–500D.1000–2000答案：B解析：50–100μL/h可维持生理剪切应力0.5–2dyn/cm²，兼顾细胞活力与物质交换。二、多项选择题（每题3分，共15分；多选少选均不得分）11.以下哪些技术可用于提高CHO细胞单克隆抗体表达滴度？A.谷氨酰胺合成酶（GS）加压系统B.CRISPRa激活XBP1C.微RNA-122抑制D.低温（33°C）培养E.双抗生素串联筛选答案：ABD解析：CRISPRa激活XBP1增强分泌途径；低温减缓凋亡；GS系统加压扩增拷贝数。12.关于AAV载体空壳率检测，下列方法属于正交策略的有A.分析型超速离心（AUC）B.阴离子交换（AEX）-HPLCC.透射电镜（TEM）D.qPCRE.电荷检测质谱（CDMS）答案：ABCE解析：qPCR仅测基因组滴度，无法区分空壳。13.在肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）制备工艺中，以下哪些步骤会降低细胞干性？A.快速扩增法（REP）加IL-26000IU/mLB.使用抗PD-1抗体C.低剂量IL-15D.重复冻存E.高氧（40%O₂）培养答案：ADE解析：高浓度IL-2促终末分化；反复冻存损伤线粒体；高氧诱导ROS。14.以下哪些属于mRNA疫苗核苷修饰的“非天然”碱基？A.N1-甲基假尿苷（m1Ψ）B.5-甲基胞苷（m5C）C.2-硫尿苷（s2U）D.假尿苷（Ψ）E.7-甲基鸟苷（m7G）答案：ABC解析：m7G为5’帽结构，非碱基修饰。15.在生物制药临床样本生物分析中，需进行incurredsamplereanalysis（ISR）的情形包括A.关键III期试验B.毒代动力学（TK）研究C.免疫原性阳性样本D.生物类似药PK比对E.体外溶出度答案：ABD解析：ISR适用于所有GLP/法规PK研究，免疫原性为定性检测无需ISR。三、判断题（每题1分，共10分；正确打“√”，错误打“×”）16.使用CRISPR-Cas13d可在不切断基因组DNA的前提下实现单碱基RNA编辑。答案：√解析：Cas13d为RNA靶向核酸酶，无DNA切割活性。17.在双盲临床试验中，生物类似药与参照药的外观差异可通过添加微量食用色素解决，无需向受试者披露。答案：×解析：任何添加物须列入说明书并获伦理批准，双盲完整性不能以欺骗为代价。18.对于ADC药物，游离毒素（payload）的Cmax升高与中性粒细胞减少症呈正相关。答案：√解析：游离payload暴露增加骨髓毒性。19.采用“自剪切”2A肽（P2A）连接重链与CAR，可导致CAR表达量下降30%–50%。答案：√解析：2A肽剪切效率非100%，残留肽段影响CAR折叠与膜定位。20.在单细胞水平上，使用Seurat的SCTransform可消除线粒体基因比例带来的假阳性聚类。答案：√解析：SCTransform通过正则化负二项模型自动降低高表达线粒体基因权重。21.对于基于微载体的VERO细胞培养，Cytodex-3的胶原包被可提升细胞对狂犬病毒感染的敏感性。答案：√解析：胶原增强细胞贴附与病毒受体表达。22.在生物制药稳定性研究中，若制剂缓冲液为PBSpH7.4，则冻融循环导致的聚集体增加主要源于磷酸氢二钠的共晶点低。答案：√解析：Na₂HPO₄·12H₂O在0°C附近共晶，形成高离子强度微环境。23.使用HiBiT标签监测抗体半衰期时，需内源性表达LgBiT互补亚基。答案：×解析：LgBiT为外源补充，无需基因组整合。24.对于mRNA疫苗，poly(A)尾长度从100nt缩短到60nt，可导致表达量下降但半衰期延长。答案：×解析：缩短poly(A)尾降低核糖体循环效率，半衰期亦缩短。25.在生物制药临床前毒理中，食蟹猴重复给药28天，若出现抗药抗体（ADA）阳性，应立即终止试验。答案：×解析：需评估ADA是否中和、是否影响PK/PD，综合决定。四、填空题（每空1分，共15分）26.在CHO细胞中，通过CRISPR敲除________基因，可消除α-1,6-岩藻糖基化，增强ADCC效应。答案：FUT8解析：FUT8编码核心岩藻糖基转移酶，敲除后降低Fc岩藻糖水平。27.计算抗体在血清中的半衰期（t₁/₂）公式为：t₁/₂=0.693×Vd/________。答案：CL解析：Vd为表观分布容积，CL为清除率。28.在AAV9载体基因组中，ITR序列长度为________bp。答案：145解析：反向末端重复（ITR）形成T型发夹，为复制包装必需。29.当使用Expi293F表达系统时，转染后________小时进行“Enhancer”补料，可显著提高蛋白产量。答案：18–22解析：此时细胞密度约2–3×10⁶cells/mL，处于对数中期。30.在生物类似药III期疗效比对中，置信区间法要求效应量Δ的95%CI须落在参照药效应的________区间内。答案：±Δequiv（通常±0.3SD）解析：EMA指南推荐±0.3SD等效界值。31.用于mRNA疫苗自我复制（saRNA）的委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）复制酶，其全长为________nt。答案：约7000解析：非结构蛋白nsP1-4编码区约7kb。32.在单细胞ATAC-seq中，片段可及性矩阵需经________算法进行降维聚类。答案：LSI（latentsemanticindexing）解析：LSI基于TF-IDF变换，适用于稀疏峰矩阵。33.对于ADC药物，毒素MMAE的分子式为C₃₉H₆₇N₅O₇，其疏水常数clogP约为________。答案：5.2解析：高疏水性易致聚集，需偶联亲水性linker。34.在生物制药下游纯化中，使用CaptoCore700填料，其排阻极限为________kDa。答案：700解析：壳层孔径允许<700kDa蛋白进入，病毒颗粒流穿。35.采用“种子-扩增”法检测蛋白聚集时，ThT荧光最大发射波长为________nm。答案：482解析：ThT与β-折叠结合后荧光增强，发射峰482nm。36.在生物制药临床研究中，儿童剂量按体表面积换算，若成人剂量为500mg，儿童BSA为0.8m²，则剂量为________mg。答案：200解析：儿童剂量=成人剂量×(儿童BSA/1.73m²)=500×0.8/1.73≈200。37.用于实时监测CAR-T细胞增殖的________标记，可在无需裂解条件下定量ATP。答案：CellTiter-Glo解析：荧光素酶法检测ATP，与活细胞数线性相关。38.在生物制药稳定性研究中，若采用Arrhenius模型，激活能Ea通常取________kcal/mol。答案：20解析：经验值20kcal/mol用于估算加速条件。39.用于高浓度抗体（>100mg/mL）黏度预测的________模型，基于氨基酸序列与溶液条件。答案：Mooney解析：Mooney方程η=η₀exp(kφ)可拟合高浓度黏度。40.在生物制药临床研究中，若采用适应性无缝II/III期设计，需提前定义________函数。答案：剂量-反应（D-R）或生存贝塔（Beta）解析：用于中期决策是否扩大样本。五、简答题（每题8分，共40分）41.阐述基于CRISPR-Cas9的“安全港”位点（AAVS1）整合外源抗体表达框的完整流程，并说明如何评估插入拷贝数与表达稳定性。答案与解析：（1）位点选择：AAVS1位于PPP1R12C基因内含子，无已知功能，插入不破坏关键基因。（2）gRNA设计：靶向AAVS1的safeharbor序列，5’-GGGGCCACTAGGGACAGGAT-3’，合成crRNA-tracrRNA嵌合体。（3）供体模板构建：包含左同源臂800bp-EF1α启动子-重链-IRES-轻链-bGHpolyA-右同源臂800bp，两侧加同向loxP以便后续切除。（4）转染：CHO-S细胞采用电穿孔（1200V,20ms），共转Cas9-gRNARNP与供体质粒（摩尔比1:3）。（5）筛选：48h后加嘌呤霉素（10μg/mL）7天，获得混合克隆。（6）单克隆化：有限稀释法，96孔板0.5cell/孔，克隆生长后取上清用ProteinAHPLC测滴度。（7）拷贝数评估：①ddPCR：设计探针针对EF1α启动子，内参基因为RPP30，计算ΔΔCt得拷贝数。②qPCR标准曲线：已知单拷贝基因组DNA梯度稀释，构建标准曲线，回归方程y=-3.42x+39.1,测得样本Ct值对应拷贝数。（8）表达稳定性：连续传代60代（约3个月），每10代测滴度，计算相对表达率R=若R>90%，判定为稳定。（9）核型分析：G显带法确认无染色体易位。（10）结论：AAVS1单拷贝插入即可实现>3g/L稳定表达，且不影响细胞生长。42.某ADC药物采用vc-MMAElinker，DAR=4，临床I期出现2例3级周围神经病变（PN）。请设计一套体外模型，预测其神经毒性风险，并说明关键参数。答案与解析：（1）模型构建：①细胞：人iPSC衍生感觉神经元（iPSC-SNs），表达Nav1.7、TRPV1。②微流控芯片：轴突隔离室（axonchamber），胞体区加ADC（1μmol/L），轴突区不加，观察轴突运输。③共培养：加入Schwann细胞，模拟髓鞘。（2）关键参数：①游离MMAE释放量：LC-MS/MS检测，培养48h后胞内浓度>5nmol/g蛋白为高风险。②微管抑制率：βIII-tubulin免疫荧光，轴突长度缩短>30%判定阳性。③线粒体膜电位：JC-1法，红/绿荧光比下降>40%提示凋亡。④电生理：MEA记录，动作电位频率下降>50%为毒性阈值。（3）数据处理：建立Logistic模型P=X为游离MMAEAUC，b=0.82（p<0.01），预测PN概率。（4）验证：用历史临床数据回代，ROC-AUC=0.91，灵敏度85%，特异度88%。（5）结论：该体外模型可在早期筛选低神经毒性linker，建议替换为亲水性PEG12-vc-PABC-MMAE，游离AUC下降60%，PN风险降至<5%。43.详述如何利用单细胞多组学（scRNA-seq+scTCR-seq）追踪CAR-T细胞在患者体内的克隆演化，并给出生物信息学分析流程。答案与解析：（1）样本采集：患者回输后第0、7、14、28天取外周血，密度梯度离心获PBMC。（2）建库：10xGenomicsChromium，同时捕获mRNA与TCRα/β全长。（3）数据预处理：①scRNA-seq：CellRangerv7.0，参考基因组GRCh38，得表达矩阵。②scTCR-seq：用scRepertoire包，过滤CDR3<30bp，去除低丰度克隆。（4）质控：基因数>500，UMI>2000，线粒体<15%，DoubletFinder去除双细胞。（5）整合：Seuratv4，SCTransform标准化，Harmony去批次。（6）聚类：分辨率0.8，得CD8⁺、CD4⁺、Treg等14个亚群。（7）克隆追踪：①定义克隆型：CDR3α+CDR3β氨基酸序列相同。②计算克隆扩增指数CFE=CFE>5为显著扩增。（8）伪时间分析：Monocle3，以TCF7为根节点，发现扩增克隆向效应记忆T（TEM）分化。（9）差异基因：扩增克隆高表达GZMB、CCL4，低表达LEF1，提示效应表型。（10）整合TCR与转录组：STARTRAC评估克隆迁移与状态转换，显示TEM克隆具有跨组织迁移能力。（11）验证：对高频克隆合成CAR-TCR，体外重复刺激5次仍保持>70%杀伤，证实持久性。（12）结论：单细胞多组学可精准识别长期存续克隆，为下一代CAR-T设计提供分子标签。44.某生物类似药候选物（抗HER2单抗）与原研药进行头对头III期疗效比对，主要终点为病理完全缓解（pCR）。假设原研药pCR=40%，非劣效界值δ=-12%，α=0.05，power=80%，请计算所需样本量，并说明若实际pCR差异为+3%时的统计推断。答案与解析：（1）公式：非劣效性检验，两组比例差H样本量计算采用PASS软件，Farrington-Manning法，得n=代入π_T=0.40，π_R=0.40，Δ=0，δ=0.12，Z_{0.95}=1.645，Z_{0.8}=0.84，得n=382例/组，考虑10%脱落，最终420例/组，共840例。（2）若实际观察pCR_T=0.43，pCR_R=0.40，差异+3%，95%CI为(-0.02,0.08)。（3）推断：下限-0.02>-0.12，拒绝H0，结论为非劣效成立，且显示数值优势。（4）敏感性：按PP集与ITT集分别分析，结果一致，稳健。（5）监管：FDA/EMA认可，可外推所有适应症。45.描述如何利用器官芯片（Organ-on-Chip）评估高浓度抗体（150mg/mL）的肺吸入毒性，并给出关键读数与判定标准。答案与解析：（1）芯片设计：①材料：PDMS多孔膜，上腔为气-液界面，下腔为血管通道。②细胞：人肺泡II型上皮细胞（A549）与肺微血管内皮细胞共培养，剪切应力0.2dyn/cm²。③雾化暴露：振动网式雾化器生成气溶胶，MMAD=2.5μm，沉积量模拟临床吸入30mg。（2）实验分组：空白对照、低浓度（10mg/mL）、高浓度（150mg/mL）、阳性对照（脂多糖）。（3）关键读数：①屏障完整性：TEER值，基线>1000Ω·cm²，下降>20%为毒性。②炎症因子：IL-6、IL-8，ELISA检测，>200pg/mL为阳性。③细胞活力：Calcein-AM/PI染色，活细胞<80%判定毒性。④黏液分泌：AB-PAS染色，高浓度组分泌量增加>1.5倍提示刺激。⑤氧化应激：ROS荧光探针DCFH-DA，MFI升高>2倍为阳性。（4）数据标准化：毒性评分权重w_i=0.3（TEER）、0.3（IL-6）、0.2（活率）、0.1（黏液）、0.1（ROS），评分>2判定为有毒性。（5）验证：与食蟹猴吸入毒性数据对比，一致性90%，预测价值高。（6）改进：建议加入肝芯片代谢模块，评估抗体片段FcRn回收，减少假阳性。六、综合应用题（共40分）46.背景：某企业开发一款三特异性抗体（TriAb），靶向CD3×CD19×PD-L1，用于B细胞淋巴瘤。分子量约150kDa，表达体系为CHO-K1，下游采用ProteinA、离子交换、病毒过滤。临床I期需制定首次人体（FIH）起始剂量。任务：a)根据NOAEL换算MRSD，列出完整步骤与公式；（10分）b)设计一套基于流式细胞术的药效学（PD）标志物检测方案，包括Panel、对照、设门策略；（10分）c)若临床出现2级CRS，请给出剂量调整算法与再激发标准；（