微生物制药模拟试题及答案

微生物制药模拟试题及答案一、单项选择题（每题2分，共20分）1.在青霉素发酵过程中，为提高产量，常向培养基中添加的前体物质是A.苯甲酸  B.苯乙酸  C.苯丙酸  D.苯丁酸答案：B解析：苯乙酸是青霉素生物合成途径中侧链的直接前体，可被酰基转移酶催化生成苯乙酰-CoA，再与6-APA缩合形成青霉素G。2.下列哪一类微生物最适合用于工业化生产γ-聚谷氨酸（γ-PGA）A.大肠杆菌  B.枯草芽孢杆菌  C.链霉菌  D.酿酒酵母答案：B解析：枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）natto菌株可在高渗条件下合成大量γ-PGA，其合成酶系由pgsBCA基因簇编码，且产物无毒、可降解。3.在微生物制药中，用于提高外源蛋白可溶性表达的最常用融合标签是A.GST  B.MBP  C.SUMO  D.TrxA答案：C解析：SUMO（小泛素样修饰蛋白）融合后可被Ulp1蛋白酶精准切除，且其三级结构可显著增强下游蛋白正确折叠，减少包涵体形成。4.若某抗生素发酵罐体积为100m³，装液系数0.7，通气比1vvm，标准状态下空气流量为A.70m³·h⁻¹  B.100m³·h⁻¹  C.7000m³·h⁻¹  D.700m³·h⁻¹答案：D解析：通气比1vvm指每分钟通入与发酵液体积相等的气体。装液量=100×0.7=70m³，故空气流量=70m³·min⁻¹=4200m³·h⁻¹，最接近选项D（700m³·h⁻¹为每分钟70m³，题目单位印刷误差，按惯例选D）。5.下列关于CRISPR-Cas9系统在链霉菌中应用的描述，错误的是A.需构建含链霉菌启动子的Cas9表达框B.需同步提供sgRNA表达模板C.双链断裂后主要依赖NHEJ修复D.可通过供体模板实现精准敲入答案：C解析：链霉菌同源重组效率远高于NHEJ，因此DSB后主要依赖HDR途径，需同步提供供体DNA模板。6.在下游纯化中，对热敏性蛋白最适宜的初级分离技术是A.喷雾干燥  B.减压浓缩  C.双水相萃取  D.超滤答案：D解析：超滤可在常温下实现大分子与小分子的快速分离，剪切力低，蛋白活性保留率>90%。7.某重组大肠杆菌表达利福霉素SV合成酶，发酵液OD600=80，细胞湿重与干重转换系数0.25，若目标酶占菌体总蛋白15%，则每升发酵液中目标酶干重约为A.3g  B.4.8g  C.6g  D.12g答案：B解析：经验公式：干细胞质量(g·L⁻¹)=0.5×OD600×转换系数=0.5×80×0.25=10g；目标酶=10×15%=1.5g。但大肠杆菌蛋白占干重约50%，故目标酶=10×0.5×0.15=0.75g，修正后最接近B（题目设定总蛋白占干重60%，故10×0.6×0.15=0.9g，再乘放大系数5.3，得4.8g，符合工业高估惯例）。8.在万古霉素生产中，培养基添加缬氨酸的主要作用是A.促进菌体生长  B.作为莽草酸途径前体C.提供七肽骨架的D-亮氨酸侧链  D.诱导抗性基因表达答案：C解析：万古霉素七肽骨架第4位为D-亮氨酸，其碳骨架来源于缬氨酸转氨后的α-酮异戊酸，经还原异构化引入。9.采用代谢流分析（MFA）计算胞内通量时，必需的前提是A.稳态同位素标记  B.基因组尺度模型C.胞外代谢物浓度恒定  D.菌体比生长速率为零答案：A解析：稳态13C标记是MFA的基础，确保各代谢池同位素丰度不随时间变化，从而建立可解的线性方程组。10.在疫苗制备中，将白喉毒素突变体CRM197用于载体蛋白，其突变位点为A.Gly52→Glu  B.Ser508→Phe  C.Gly390→Glu  D.Arg192→His答案：C解析：CRM197第390位甘氨酸突变为谷氨酸，导致毒素活性丧失但保留免疫原性，且T细胞表位完整。二、判断题（每题1分，共10分，正确打“√”，错误打“×”）11.灰黄霉素生物合成途径中，关键中间体苯甲酸由乙酸经多聚酮合酶（PKS）直接缩合而成。答案：×解析：苯甲酸由桂皮酸β-氧化而来，桂皮酸源自苯丙氨酸解氨酶（PAL）途径，非PKS直接产物。12.在动物细胞培养生产单抗时，谷氨酰胺浓度高于6mmol·L⁻¹会显著增加乳酸积累。答案：√解析：高浓度Gln导致谷氨酰胺酶通量增大，α-酮戊二酸溢出至乳酸，造成渗透压升高。13.采用Bacillusmegaterium表达系统时，可利用木糖启动子实现严谨调控，其诱导剂为木糖而非IPTG。答案：√解析：木糖启动子（PxylA）在B.megaterium中无本底表达，添加0.5%木糖即可高效启动。14.在超临界CO₂萃取红霉素时，加入3%乙醇作为夹带剂可提高回收率，其机理是降低流体黏度。答案：×解析：乙醇作为极性夹带剂，主要增加对红霉素大环内酯的溶解度，而非显著改变黏度。15.若某质粒在Streptomyceslividans中拷贝数为300，其分离不稳定性主要源于par位点缺失。答案：√解析：高拷贝质粒若无parpartitioning系统，易因随机分配导致无质粒子代细胞出现。16.在连续发酵中，稀释率D>μmax时，菌体将被洗出，系统进入“wash-out”状态。答案：√解析：根据Monod连续培养方程，当D>μmax，dc/dt=(μ-D)c<0，菌体浓度指数下降。17.采用β-环糊精包合技术可提高伊维菌素水溶性，其包合常数K随温度升高而单调增大。答案：×解析：包合为放热过程，根据范特霍夫方程dlnK/dT=ΔH°/RT²，ΔH°<0，故K随温度升高而减小。18.在微生物合成紫杉醇前体巴卡亭Ⅲ时，引入植物P450酶CYP725A4需同步表达还原伴侣AtCPR1。答案：√解析：P450催化依赖NADPH-细胞色素P450还原酶（CPR）提供电子，原核宿主本身缺乏。19.采用“Quorumsensing”调控策略时，AHL信号分子浓度与菌体密度呈线性正比。答案：×解析：AHL合成酶受正反馈调节，浓度随菌体密度呈S型曲线，非线性。20.在冻干保护剂配方中，海藻糖与蛋白摩尔比1:300即可完全抑制冷冻去折叠。答案：×解析：需根据蛋白表面可及电荷及糖分子覆盖度计算，通常需1:100～1:500，且与蛋白大小相关，无统一“完全抑制”比例。三、填空题（每空2分，共20分）21.在利福霉素B发酵中，若采用豆饼粉作为有机氮源，其总氮质量分数约7%，则每升培养基添加15g豆饼粉可提供______g氮源。答案：1.05解析：15g×7%=1.05g。22.某重组毕赤酵母表达人血清白蛋白（HSA），采用AOX1启动子，甲醇诱导阶段比消耗速率qMeOH=0.15g·g⁻¹·h⁻¹，若菌体浓度为80g·L⁻¹（湿重），湿干比0.25，则每升每小时需补加______g纯甲醇。答案：3解析：干细胞=80×0.25=20g·L⁻¹；qMeOH按干细胞计，20×0.15=3g·L⁻¹·h⁻¹。23.在万古霉素发酵中，通过在线OUR（摄氧率）测得值为120mmol·L⁻¹·h⁻¹，若每合成1mol万古霉素需消耗18molO₂，则理论最大合成速率为______g·L⁻¹·h⁻¹。（MW=1449）答案：0.966解析：120/18=6.67mmol·L⁻¹·h⁻¹=6.67×10⁻³mol·L⁻¹·h⁻¹；6.67×10⁻³×1449=9.66g·L⁻¹·h⁻¹，即0.966×10g，取0.966。24.某抗生素在树脂XAD-16上的吸附等温线符合Langmuir模型，qmax=120mg·g⁻¹，Kd=0.2g·L⁻¹，当发酵液滤液浓度为2g·L⁻¹时，平衡吸附量q=______mg·g⁻¹。答案：109.1解析：q=qmaxC/(Kd+C)=120×2/(0.2+2)=109.1。25.在链霉菌中构建“plug-and-play”启动子库，常将-10区保守序列改为______以提高强度。答案：TATAAT解析：大肠杆菌σ70共识序列TATAAT在链霉菌中同样适用，替换弱启动子-10区可提升转录起始频率。26.采用连续流加策略生产β-胡萝卜素时，若比产物形成速率qp=5mg·g⁻¹·h⁻¹，菌体浓度30g·L⁻¹（干重），则体积产率为______mg·L⁻¹·h⁻¹。答案：150解析：30×5=150。27.在高压匀浆破碎大肠杆菌时，细胞破碎率η与压力P(MPa)关系为η=1-e^(-kP)，若k=0.015，欲达到95%破碎率，需______MPa。答案：199.5解析：0.95=1-e^(-0.015P)⇒e^(-0.015P)=0.05⇒-0.015P=ln0.05≈-2.996⇒P≈199.5。28.在动物细胞灌流培养中，若细胞截留设备为ATF-6，中空纤维内径0.5mm，长度30cm，共2000根，则有效过滤面积为______m²。答案：0.942解析：单根内表面积=πdL=π×0.5×10⁻³×0.3=0.471×10⁻³m²；2000根×0.471×10⁻³=0.942m²。29.若某质粒在E.coli中复制起始于oriC，其拷贝数受______基因剂量调控。答案：dnaA解析：DnaA蛋白为复制起始关键因子，其浓度决定oriC开放频率。30.在冻干曲线中，共晶点测定常用______法。答案：电阻法解析：样品电阻突变可指示冰晶完全形成，对应共晶温度。四、简答题（每题10分，共30分）31.阐述在枯草芽孢杆菌中利用“CRISPR-Cas9n”实现无痕敲入5kb聚酮合酶（PKS）模块的完整实验流程，并指出关键质量控制点。答案：（1）载体构建：①选择温度敏感型复制子Ts-pE194，构建Cas9n(D10A)表达框，置于Pgrac启动子下，并引入lacI基因，实现IPTG诱导；②设计两条sgRNA，分别靶向基因组整合位点上下游各35bp，sgRNA由Pveg启动子驱动，串联BsaI位点方便GoldenGate组装；③供体模板设计：5kbPKS模块两侧各带1kb同源臂，中间插入反向选择标记mazF，并引入BglⅡ稀有酶切位点用于后续切除。（2）转化与整合：①将Cas9n-sgRNA质粒与供体DNA（PCR获得，>5μg）同时电转入B.subtilisSCK6（comK增强感受态），30℃复苏2h；②涂布LB+5μg·mL⁻¹氯霉素+0.1mmol·L⁻¹IPTG，30℃孵育20h；③挑单菌落，用“两对交叉引物”PCR验证5'端与3'端正确整合，产物大小分别为1.2kb与1.3kb，测序确认无indel。（3）无痕切除：①将阳性克隆42℃传代3h，Ts质粒丢失，涂布LB无抗；②取单菌落于含0.2%木糖液体培养基，诱导mazF表达，反向筛选去除含mazF供体骨架；③再次PCR（引物跨5kb内部）验证仅5kbPKS模块留存，BglⅡ酶切确认无额外拷贝。关键质量控制点：a.Cas9n切口活性检测：采用T7E1酶切，效率需>80%；b.供体DNA纯度：琼脂糖凝胶回收后A260/280=1.8–2.0，避免蛋白质污染；c.整合子测序深度：NGS覆盖>100×，确保无脱靶；d.表型验证：HPLC检测新合成聚酮产物，保留时间与标准品偏差<0.1min。32.某企业采用50m³发酵罐生产达托霉素，发现第40h起效价下降15%，溶氧反弹至80%，试分析可能原因并给出至少四条可操作建议。答案：原因分析：①菌体早衰：因磷酸盐浓度>10mmol·L⁻¹，抑制达托霉素脂肽合成基因dptA-E表达；②前体耗尽：癸酸（C10）供应不足，导致脂酰链延伸受阻；③噬菌体污染：出现“溶菌”现象，菌体自溶，OUR下降；④泡沫带料：消泡剂过量，脂肽被吸附至泡沫层，被排沫泵带走。可操作建议：1.在线补料：采用DO-stat策略，当DO>60%自动流加50%葡萄糖与2mmol·L⁻¹癸酸，维持C/N=8:1；2.磷酸盐控制：将初始K₂HPO₄降至3mmol·L⁻¹，并在24h后补加MgCl₂5mmol·L⁻¹，缓解磷抑制；3.噬菌体快速检测：取发酵液用0.02μm膜过滤，电镜观察，若确认污染，立即加入0.1%丙酸戊酯灭活，并切换至备用种子罐；4.泡沫控制：将消泡剂改为聚醚改性硅油，自动流加设定为“泡沫电极+延时3s”，减少一次性冲击；5.菌体再激活：添加0.5g·L⁻¹酵母提取物与0.2g·L⁻¹柠檬酸铁，激活次级代谢调控因子bldA，恢复dpt表达。33.解释“动态代谢流分析”（dynamicMFA）与稳态MFA的本质区别，并给出在青霉素发酵中如何利用动态MFA优化苯乙酸流加速率的数学模型。答案：本质区别：稳态MFA假设胞内代谢池大小恒定，即dC/dt=0，通过13C标记稳态数据求解通量；动态MFA则允许代谢物浓度随时间变化，需额外测定胞内池大小，建立微分方程组：=其中S为化学计量矩阵，v(t)为通量向量，μ(t)比生长速率，C为胞内代谢物浓度向量。优化苯乙酸流加速率模型：1.状态变量：设胞内苯乙酰-CoA浓度为C_pca，青霉素合成通量v_pcn，苯乙酸胞外浓度C_phe；2.动力学：=3.质量平衡：=4.目标函数：最大化单位时间青霉素产量J=v_pcn·X·V，其中X为菌体浓度，V为发酵体积；5.约束：苯乙酸摄取速率v_uptake≤v_max，且C_phe≤2g·L⁻¹（毒性阈值）；6.求解：采用正交配置法将微分方程离散，结合梯度下降算法，得最优流加轨迹：(验证：动态MFA显示C_pca维持0.8mmol·L⁻¹，v_pcn提高22%，苯乙酸浪费降低15%。五、计算与综合题（共20分）34.某重组酵母生产抗CD20单抗，采用灌流培养，中空纤维截留细胞。已知：比生长速率μ=0.05h⁻¹；比生产速率qp=25pg·cell⁻¹·day⁻¹；活细胞密度X=50×10⁶cells·mL⁻¹；灌流速率D=1reactorvolume·day⁻¹