小规模纯化AAV-MAX系统生产的AAV

应用说明｜AAV-MAX无辅助AAV生产系统AAV生产小规模纯化AAV-MAX系统生产的AAV介绍Gibco™Helper-Free无辅助病毒生产系统是一个腺相关病毒（）生产系统，用于可扩展、高滴度的AAV-MAX系统包括一个克隆性HEK293F来源的悬浮细胞系成分确定的生产培养基、转染试剂和转染促进剂（booster）、转染增强剂（enhancer）和裂解缓冲液。材料和方法AAV生产根据AAV-MAX用户指南（出版号：MAN0019619略1和策略2分别在两个2.8L摇瓶和四个2.8L摇瓶中使用完整的系统试剂盒（表1）生产rAAV6-GFP。载体的下游处理和纯化策AAV-MAX系统在2L或4L培养液中生产的。策略1是一项较基础的工艺，不必使用昂贵的设备和过滤器，而是通过离心法直接澄清，并通过切向流过滤法（TFF）进行浓缩，这对于早期发现或实验室小规模的考察研究来说是一个非常理想的选择（图1）。裂解和核酸酶处理310倍Gibco™裂解缓冲液加入2LrAAV6培养液中，使最终浓度为1倍。在裂解过程中，加入最终浓度为2的MgCl2和最终浓度为的ThermoScientific™Pierce™通用核酸酶，以消化rAAV颗粒中未被衣壳化的DNA。将培养物放在37℃的培养箱中，在转速125rpm的摇床平台上培养2小时。策略2用深层过滤器进行澄清，通过TFF工艺高效浓缩AAV，以及实施缓冲液交换以稳定2可以扩展到更大的生11和2ThermoScientific™POROS™亲和树脂分别实现了血清型6（rAAV6）载体70%和49%总工艺回收率，证明了在典型的实验室规模下，用系统生产载体能够获得较高的回收率。策略1澄清TFFMiniKros柱亲和性POROSGoPureAAVX预装柱，1mL细胞裂解用AAV-MAX裂解缓冲液裂解2L细胞培养物以6,000xg的速度离心30分钟；NalgeneRapid-Flow过滤装置（0.2μm）（10倍浓缩系数）策略2澄清深层过滤器组：Millistak+C0SP过滤器，Millistak+F0HC过滤器，和Sartopore2XLG过滤器TFFMiniKros柱细胞裂解亲和性POROSGoPureAAVX预装柱，1mL用AAV-MAX裂解缓冲液裂解4L细胞培养物（20倍浓缩系数）；6倍渗滤体积渗滤图1.两种纯化策略的概述。表用于AAV生产和纯化的材料。工艺步骤材料描述货号AAV生产AAV-MAXHelper-Free生产系统试剂盒A51217CN（含国产化细胞）A50520裂解和核酸酶处理AAV-MAX裂解缓冲液（10倍）1MMgCl2J61014.AK88702Pierce通用核酸酶ThomsonOptimumGrowth2.8L烧瓶（）NalgeneRapid-Flow带膜的无菌一次性过滤装置（0.2）真空泵（Welch）50-112-006567-0020离心澄清I31-0176SorvallLYNX6000超速离心机NalgenePPCO离心瓶750065903120-100007522-20深层过滤澄清MasterflexL/S泵（）Masterflex铂金固化硅胶管，25号（）管夹或止血钳96440-2516100118MC0SP027H1MF0HC027H15441307G4-SS-B07522-20Millistak+HCPro深层过滤器，C0SP（MilliporeSigma）Millistak+Pod深层过滤器，F0HC（MilliporeSigma）Sartopore2XLG过滤器（Sartorius）MasterflexL/S泵（）Masterflex铂金固化硅胶管，25号（）。管夹或止血钳切向流过滤96440-25PL1905847Q试管软管旋塞试剂瓶（Corning）431432MiniKros中空纤维TFF组件（Repligen）SciLog压力传感器（Parker）SciLog压力监测仪（Parker）ÄKTAPure25系统（Cytiva）POROSGoPure预装柱各种缓冲液S02-E100-05-N080-699PSX-3P-5SP0820J-1329亲和层析不适用A36652不适用策略1：离心澄清和TFF将用核酸酶处理过的细胞裂解液在20℃6,000xg离心30分钟。将上清液倒入ThermoScientific™Nalgene™Rapid-Flow无菌一次性过滤装置（0.2），并使用真空装置开始进行过滤。在2-8℃下储存一夜后，使用根据相同的离心澄清和过滤方案重新澄清已经过澄清的裂解液，然后装入MiniKrosHFTFF2面积为22的去离子（DI）水冲洗新的中空纤维过滤器，以2,000s-1（mL/min）的剪切率在HFTFF中再循环已经过澄清的裂解液。使用软管旋塞向再循环管路施加背压并进行调整，使整个工艺中的跨膜压（TMP）为5psi。材料浓缩10倍后，将其收集起来。用1.4倍滞留体积的亲和平衡缓冲液来淋洗HFTFF，并将其与HFTFF产物混合。按照上述澄清方案，使用NalgeneRapid-Flow0.2混合的淋洗和HFTFF产物进行离心和过滤。以冲掉过滤器中的储存甘油，然后用过滤面积为1mL/cm2的亲和平衡缓冲液进行平衡。2策略2：深层过滤澄清和TFF亲和纯化用过滤面积至少为100L/m（22.7L的DI水以6002/hr270纯化前，用0.5NNaOH对KTA™系统进行灭菌处理，接触时间为30分钟。先后用5个柱体积（CV）的水、5个CV的0.2M磷酸（接触时间为15分钟）、5个CV的6M盐酸5个CV的2MHCL5个CV的洗涤110个CV的亲和平衡缓冲液1（用于策略1）和亲和平衡缓冲液2略2）以cm/hr的流速对ThermoScientific™POROS™GoPure™0.5x5cm13接下来，以300cm/hr的流速将过滤后的HFTFF产物加载到色谱柱上（相应的停留时间为1分钟）。待过滤后的HFTFF产物加载完成后，先后用10个的平衡缓冲液、三个不同的中间冲洗液（每种均为5个CV10个CVpH值为2.5的甘氨酸缓冲液洗脱rAAV67个CV的0.2M磷酸（接触时间为15分钟）、5个CV的6M5个CV的亲和平衡缓冲液、5个CV的2MHCL、10个CV的水对POROSGoPureAAVX柱进行剥离和灭菌处理，然后将其保存在5个CV的20%mL/min）的流速冲洗Millistak+™C0SP和F0HC深层过滤器，或者直至从过滤器中排出所有空气。将Millistak+C0SP过滤器的出口与F0HC过滤器的入口相连接；将F0HC过滤器的出口与Sartopore™2XLG过滤器的入口相连接。用1.5滤器滞留体积（975）的澄清缓冲液以150L/m2/hr67.5mL/min）的流速平衡整个过滤器组。以150L/m2/hr（67.5mL/min滤器组，然后以相同的流速用1.5倍滞留体积（1,008）的2-8℃Sartopore2过滤器重新澄清已经过澄清的裂解液，然后将其加载到MiniKrosHFTFF柱上（表2）。用过滤面积为22的水新的中空纤维过滤器，以冲掉过滤器中的储存甘油，然后用过滤面积为122,000s-1（368mL/min）的剪切率在HFTFF中再循环已经过澄清的裂解液。使用软管旋塞向再循环管路施加背压并进行调整，使整个工艺中的TMP为5psi20液交换。缓冲液交换通过在保持20倍浓缩体积的情况下向样本槽中缓慢加入6个渗滤体积的亲和力平衡缓冲液2来进行。缓冲液交换完成后，收集材料。用1.4倍滞留体积的亲和平衡缓冲液来淋洗HFTFF，并将其与HFTFF产物混合。使用Sartopore2XLG过滤器过滤混合的淋洗和HFTFF产品。通过ddPCR对病毒基因组进行定量使用靶向GFP基因的引物和探针通过微滴式数字PCR（ddPCR）测定每毫升病毒基因组的滴度（vg/mL）。在进行ddPCRDNA。然后，在QX200PCR系统（Bio-Rad）上运行每个样本的连续稀释液，以测定病毒基因组的滴度。表TFF参数。测定完整衣壳的百分比参数设置根据制造商的说明使用ELISAProgen壳滴度。用基因组滴度除以衣壳滴度，以测定洗脱组分中完整颗粒的百分比。样本再循环的剪切率跨膜压（TMP）浓度因子2,000-1<5psi10倍或20倍6个渗滤体积25通过流式细胞仪对转导单位进行定量将HT1080细胞种到孔板的各个孔中，24小时后去除培养基，然后用连续稀释的rAAV6-GFP过程样本和5型腺病毒辅助病毒共同感染细胞。根据用流式细胞仪测定的每个孔的GFP阳性细胞数量来计算每个样本的转导单位（TU/mL）。缓冲液交换体积管路尺寸浊度测量浊度测量全部在ThermoScientific™Orion™AQ3010浊度仪上使用10样本进行。3表亲和纯化方法。流速(cm/hr)300流速(ml/min)0.98孵育时间(min)-方法步骤缓冲液或溶液入口出口CV冲洗工艺用水B6B3B2B1废物废物废物废物5555剥离液1再生0.2M6M盐酸胍2MNaCl3003003000.980.980.9815-剥离液2-50mMTris，1.5MNaCl，0.01%Pluronic™F-68表面活性剂，冲洗液1A2废物53000.98--缓冲液100mMTris150NaCl0.01%PluronicF-68表面活性剂，7.2亲和平衡A1废物53000.98缓冲液100mMTris500NaCl0.01%PluronicF-68表面活性剂，7.2缓冲液100mMTris150NaCl0.01%PluronicF-68表面活性剂，7.2亲和平衡加载A1S1A1废物输出1废物5300300.143000.980.980.98-缓冲液100mMTris500NaCl0.01%PluronicF-68表面活性剂，7.21分钟的停亲和加载变量10留时间缓冲液100mMTris150NaCl0.01%PluronicF-68表面活性剂，7.2缓冲液100mMTris500NaCl0.01%PluronicF-68表面活性剂，7.250mMTris1.5MNaCl0.01%PluronicF-68表面活性剂，亲和平衡-冲洗液1冲洗液2冲洗液3A2A3A4输出2输出3输出45553003003000.980.980.9850mMTrisM尿素，0.01%PluronicF-68表面活性剂，50mMTris，1%Tween™20表面活性剂，0.01%PluronicF-68表面活性剂，9.0缓冲液100mMTris150NaCl0.01%PluronicF-68表面活性剂，7.2缓冲液100mMTris500NaCl0.01%PluronicF-68表面活性剂，7.275mM甘氨酸，50NaCl，500mM酸，0.01%PluronicF-68表面活性剂，2.50.2M亲和平衡洗脱A1A5废物1053000.980.98-1分钟的停输出5300.14留时间剥离液1剥离液1再生B3B3B2输出6废物5253003003000.980.980.98-15-0.2M6M盐酸胍废物缓冲液100mMTris150NaCl0.01%PluronicF-68表面活性剂，7.2缓冲液100mMTris500NaCl0.01%PluronicF-68表面活性剂，7.22MNaCl亲和平衡A1废物53000.98-剥离液2冲洗B1B6A6A7废物废物废物废物55553003003003000.980.980.980.98工艺用水冲洗工艺用水存储20%乙醇4结果Millistak+C0SP过滤器上的最大压力达到2.42psi。Millistak+F0HC过滤器上的最大压力达到1.34psiSartopore2XLG过滤器上的最大压力达到0.8psi9）。澄清步骤将浊度降至1.0370%就亲和层析前培养物的处理对两种不同策略进行了测试。策略1使用离心和过滤来产生澄清的裂解液，然后在HFTFF上进行102使用一系列深层过滤器来产生澄清的裂解液，然后在HFTFF上进行20倍浓缩和6个渗滤体积的缓冲液交换。每项策略的测试结果如下所示。度为8.29x1013vg/L（图2和3）。在HFTFF上进行了52.6分钟的20倍浓缩，平均渗透通量为36.8LMH（图4HFTFF上进行了总共22.96个渗滤体积的缓冲液交换，平均渗透通量为21.4。策略1：离心澄清经过裂解和核酸酶处理的AAV6培养物的浊度为302个散射NTU7.85x1013vg/L（图2和3）。在mNalgeneRapid-Flow过滤装置上经过离心和过滤后，浊度降至16.49NTU，该过程的每步产率为94%，细胞培养的滴度为7.36x1013vg/L（图2和3）。在在HFTFF12.8NTU失降至最低，每步的产率为76%（图2和3）。HFTFF产物在Sartopore2XLG过滤器上进行过滤后，浊度降至7.47NTU。HFTFF上进行了53分钟的倍浓缩，平均渗透通量为28L/m²/h（LMH4HFTFF131NTU，在该步骤中未观察到滴度损失。将HFTFF产物在0.2m的NalgeneRapid-Flow过滤装置上进行离心和过滤后，浊度降至103280信号达到20005载过程中，最大柱前压和柱压均保持在0.05以下。亲和纯化产物产生了5.49x1013vg/L的细胞培养物，每步产率为74%，整体过程产率为70%（图3）。裂解产物澄清产物TFF过滤后的TFF产物策略1策略2图2.OrionAQUAfastAQ30102感染性在整个纯化过程中保持不变；提取的细胞培养物和亲和产物的感染性值均为3.32x103vg/TU（图6不包括富集完整衣壳，所以完整衣壳的百分比在纯化过程的各个步骤中保持相对稳定，其范围约为20-30%（图7）。使用SDS，显示亲和产物的大小和衣壳蛋白质量符合预期（图8）。策略2：深层过滤器澄清提取的细胞澄清产物TFF产物过滤后的TFF亲和产物经过裂解和核酸酶处理的AAV6培养物的浊度为442NTU，细胞培养物的滴度为1.18x1014vg/L（图2和）。通过培养物产物策略1的滴度策略2的滴度策略1的每步产率策略2的每步产率Millistak+C0SP、Millistak+F0HC和图3.每个工艺步骤中细胞培养物的滴度和每步产率。通过ddPCRvg/mLvg/mLmLvg除以每步处理的细胞培养物的总升数，以测定细胞培养物的滴度（vg/L）。通过该值，可以比较每个工艺步骤中两种纯化策略的滴度，而无需考虑每步所处理材料的体积。滴度变化可用于确定每个工艺步骤中的每步产率。Sartopore2XLG过滤器组进行了74分钟的澄清。5提取的细胞培养物澄清产物TFF产物过滤后的亲和产物处理时间（min）TFF产物策略1通量策略1策略2策略2LMH）策略2初始渗滤（LMH）策略1TMP（psi）策略2TMP（psi）图6.每个工艺步骤的感染性。感染性滴度（TU/mL）和分别通过流式细胞仪和ddPCR测定。vg/TU的值通过vg/mL滴度除以感染性滴度计算得出。图4.TFF渗透通量和过滤器跨膜压在处理时间内的变化。将压力传感器连接至过滤器的入口、截留物和透过物上。取入口和截留物压力的平均值，然后减去透过物压力，以计算出跨膜压（TMP）。用软管旋塞来调整截留物的背压，使达到目标值5。在TFF期间，每隔2-5分钟收集一次透过物并进行称重。用以kg为单位（与升相关）的透过物除以处理时间，以确定透过物的流速（升/时）。然后用透过物流速除以过滤器面积（m2），以测定渗透通量（L/m²/h，LMH）。这两种策略的渗透通量都是随着浓度系数的增加而衰减。在策略2的缓冲液交换期间，由于浓度在这一步保持不变，通量比较稳定。在整个过程中，策略2的透过物通量明显较高，这表明进料更清洁。提取的细胞培养物澄清产物过滤后的TFF亲和产物产物策略1UV吸光度280nm策略1UV吸光度260nm策略2UV吸光度280nm策略2UV吸光度260nm策略1策略2图7.每个工艺步骤中完整衣壳的百分比。vg/mL和capsids/mL的值分别通过ddPCR和ELISAvg/mLcapsids/mL计算出完整衣壳的百分比。图5.在1mLPOROSGoPureAAVX预装柱上进行亲和层析。在亲和层析过程中，使用KTAFPLC系统测得UV吸光度为260nm和nm。初始宽峰（A）与流经亲和柱但未与之结合的污染蛋白质有关。高陡峰（B）与捕获到的从色谱柱上洗脱的AAV有关。6浊度降至7.47策略1无产物损失。在亲和加载过程中，1280信号仅达到，这表明一BluePlus2标准品5整个加载过程中，最大柱前压和Δ柱压保持在0.07以下。23亲和流穿液41235亲和纯化产物产生了5.78x13vg/L的细胞培养物，提供了49%3取的细胞培养物（3.68x103vg/TU）和亲和产物（2.79x103）保持6富集完整衣壳，所以完整衣壳的百分比在纯化过程的各个步骤中保持相对25-40%（图用SDS，显示亲和产物的大小和衣壳蛋白质量符合预期（图8）。678亲和剥离液9BluePlus2标准策略21BluePlus2标准BluePlus2标准234亲和流穿液51236结论78本文介绍了两种使用AAV-MAX系统对生产的rAAV62–4L的细胞培养物）纯化的策略。这两种策略都能获得高质量和高产量的rAAV61和策略2的总产率分别为70%和49%2深层过滤过程中的产物损失较大。9亲和剥离液BluePlus2标准图8.亲和工艺步骤的样本SDS。在还原条件下，将亲和步骤样本和Invitrogen™SeeBlue™Plus2预染蛋白标准品加载到Invitrogen™NuPAGE™Bis-Tris凝胶上，然后在200V下运行35分钟。接着使用Invitrogen™SimplyBlue™SafeStain对凝胶进行染色。处理时间（分钟）Sartopore2XLG过滤器C0SP过滤器F0HC过滤器开始淋洗图9.2中处理期间的过滤器压力。在处理过程中，将三个压力传感器添加到过滤器组中。在Millistak+C0SP过滤器前面添加压力传感器1Millistak+C0SP和Millistak+F0HC过滤器之间添加压力传感器。在Millistak+F0HC过滤器和Sartopore2XLG过滤器之间添加压力传感器3。在处理过程中，每隔5分钟记录一次压力读数。使用传感器1和传感器2之间的Δ压力测定Millistak+C0SP23之间的Δ压力测定Millistak+F0HC过滤器3的压力读数测定Sartopore2XLG10psi即表明过滤器堵塞。在运行期间，过滤器的压力均未超过psi。7两种策略之间的显著区别是，策略2产生的中间产物浊度值更TFF通量更大、亲和流穿液的280值更低。策略2的澄清产物和TFF1分别低94%和90%2在浓缩过程中的TFF通量比策略1高33%280值比策略1低89%此类差异，但两种策略的最终亲和产物在感染性、完整衣壳的百分比和产量方面是相当的。我们建议用策略1进行初始发现或小规模的考察研究。策略2适用于工艺开发工作，因为深层过滤步骤可以利用任何堆叠式或互锁过滤系统和过滤器支架进行扩展。作者NilsWilliston、KatyIrvin、JacquelineHill、CollinRasmussen、NatalieLindoMariahWeinkaufChaoYanLiuEmilyJackson-Holmes、KennethThompson和JonathanZmuda，ThermoFisherScientific附录：2L下游方案为确保将所有空气从过滤器中排出，夹住出口管和排气管，让过滤器的压力上升到<10psi，然后再打开排气管。继续执行该步骤，直至过滤器排气管没有气泡排出。用手或橡胶锤轻轻敲击过滤器也可以帮助清除过滤器中的气泡。裂解1.收获时，在培养物中加入10倍裂解缓冲液，直至最终浓度为1倍（222）。B.用水以600L/m2/hr（270mL/min）的流速冲洗C0SP保将所有空气从过滤器中排出，夹住出口管和排气管，让过滤器的压力上升到<10psi，然后再打开出口管。继续执行该步骤，直至过滤面积为100L/m2（2.7L管没有气泡排出（以较晚者为准）。2.在培养物中加入1MMgCl22（4.45）。3.在培养物中加入核酸酶，直至最终浓度为90（Benzonase™核酸酶或Pierce通用核酸酶）（0.8Pierce通用核酸酶）。4.搅拌裂解液，以确保各种成分充分混合。5.将裂解液倒入两个2.8L6.在37℃下将裂解液以的速度振荡2小时。离心澄清3.冲洗Millistak+F0HC过滤器。将C0SP过滤器的出口管连接至F0HC过滤器的入口处，并在入口前安置一个压力传感器。将管路连接至F0HC过滤器的排气口和出口。1.将裂解液以6,000xg30分钟。B.夹住出口管并打开排气管，开始用水以2/hr（270mL/min）的流速冲洗C0SP和F0HCF0HC过滤器中排出，夹住F0HC出口管和排气管，让过滤器的压力上升到<10psi，然后再打开F0HC排气管。继续执行该2.将含有的上清液倒入0.2的NalgeneRapid-Flow一次性无菌过滤装置中。3.真空收集澄清的裂解液。4.2-8℃的环境F0HC排气管没有气泡排出。用手或橡步骤，直至中保存一夜。胶锤轻轻敲击过滤器也可以帮助清除过滤器中的气泡。用深层过滤器进行澄清组装和平衡过滤系统：1.将管路连接到Millistak+C0SP口，并在入口前安置一个压力传感器。2.冲洗Millistak+C0SP过滤器。夹住出口管并打开排气管，开始用去离子（DI）水以600L/m2270mL/minC0SP过滤器。8C.继续用水以600L/m2/hr（mL/min）的流速冲洗C0SP和F0HC过滤器，同时夹住排气管并打开F0HC出口管。为确保将所有空气从F0HC过滤器中排出，夹住F0HC出口管和排气管，让过滤器的压力上升到<10psi，然后再打开F0HC出口管。100L/m（2.7L）的水通过过滤器，或者直至过滤器排气管没有气泡排出（以较晚者为准）。注意：不要让色谱柱超过其能承受的最大压力，并将跨膜压（TMP）保持在5psi或以下。C.用至少2mL/cm2的和管路引向废弃物。3.测试中空纤维过滤器的完整性。倒出中空纤维中的所有DI水（注意此时的滞留体积）。4.平衡过滤系统。B.夹住管路，打开管路，慢慢向中空纤维中泵将F0HC过滤器的出口管连接至Sartopore2XLG过滤器的入口，并在入口前安置一个压力传感器。将管路连接至Sartopore2XLG过滤器的出口。入空气，直至TMP达到5-7左右。C.注意TMP在12psi/min时合格。B.打开Sartopore2XLG以150L/m2/hr（67.5mL/min）的流速流经所有三Sartopore2XLG倍的总深层过滤器滞留体积（975mL）流经过滤器。4.平衡中空纤维过滤器。将管路和管路放入所需的平衡缓冲液中。B.打开管路和管路的流量大致相等。澄清处理：C.用至少12的平衡缓冲液冲洗中空纤维，将管路引向废弃物。1.以150L/m2（67.5）的流速将所有用核酸酶处理过的细胞裂解液泵入过滤器组。压力不应超过10psi。TFF2.用1.5倍过滤器组滞留体积（1,008mL）淋洗产物。1.浓缩样本。将管路和管路放入样本槽。B.切向流过滤（TFF）如果澄清的裂解液之前已置于2-8