江苏高考生物一轮复习：基因工程的基本工具与操作程序（学生卷）

第57讲基因工程的基本工具与操作程序

【课标要求】1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来

的；2.阐明重组DNA技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具；3.阐

明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目

的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。

考点1基因工程的基本工具

考点透析

知识1基因工程概述

基因工程又叫作重组DNA技术。

项目内容

主要技术转基因技术

操作环境—

操作水平—

理论依据基因重组

供体提供_________

受体复制或表达目的基因

基本过程切割一改造和拼接f导入f表达

克服______________的障碍，

优点

定向改造生物的________________

知识2基因工程的基本工具

1.限制性内切核酸酶（限制酶）

识别双链DNA中特定的核甘酸序列并切开

r0特定部位的两个核甘酸之间的

-（5期产生黏性末端或

H举例）EcoRT、SmaI

荏）很强的性

5'GAA-3,

3TmTrm5,

5'TTTGAATTC

TTT阳林i

3'J-LLCTTAAP

r-AAG-

平末端

5,5-AATFC

3'J-J-J-CTTAA-5r

黏性末端

图中可见，限制酶在识别序列中心轴线两侧切开产生的是，在识别序列中心轴线处切开产

生的是O

2.DNA连接酣

（1）作用：在两个核甘酸之间形成以连接两个DNA片段。

（2）主要类型：①£.co〃DNA连接酶：从中分离；②：从T4噬菌体中分离。两

者都能连接和平末端，但前者连接具有平末端的DNA片段的效率远远低于后者。

归纳总结

与DNA有关的酶

酶作用作用相关“键”

切割DNA片段，产生两个（具有相同黏

限制酶破坏磷酸二酯键

性末端或平末端）DNA片段

DNA催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯

形成磷酸二酯键

连接酶键，从而连接起来

将双桂DNA分子局部解旋为单链（ATP

解旋晦破坏氢键（氢键非化学键）

水解供能）

DNA把游离的脱氧核甘酸连接到引物或者已

形成磷酸二酯键

聚合陋有的DNA单链的3'端上

DNA

将DNA水解为脱氧核甘酸破坏磷酸二酯键

（水解）酶

逆转录的以RNA为模板合成cDNA形成磷酸二酯键

3.载体

（1）作用：将基因送入细胞。

（2）种类：质粒、、顼植物病毒等。

（3）重要的载体之一——质粒

①质粒的本质：是一种裸露的、结构简单，独立于真核细胞的细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并

具有自我复制能力的o

②质粒适于作基因载体的特点（载体须具备的条件）

特点（条件）作用

有一个至多个_____________供外源DNA片段插入其中

能在细胞中进行___________,或整合到受体DNA

便于目的DNA在受体细胞中稳定存在

上，随受体细胞DNA同步复制

带有____________（常是人工改造后具有），一般为抗便于重组DNA分子的筛选（鉴定目的基因是否导入

生素抗性基因或荧光基因等成功）

深度指津

最常见的标记基因——抗生素抗性基因

目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生索的能力。当含有抗生素抗性基因的载体注入受体细胞

后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该

种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如下图所示（以氨羊青霉素抗性基因为例）：

在含有氨।—-।

进入受

体细胞

只有含有载体,

含有氨芋青并且教体上的

客索抗性基大肠杆菌中有的氨节青霉素抗

有载体进入,有件基因表达的

因的质粒大肠杆菌才能

的没有教体进入

存活并增殖

限思辨小练

1.判断下列说法的正误：

⑴目前使用的限制酶都是从原核生物中得到的。（）

（2）质粒是存在于细菌细胞中为一种细胞器。（）

（3）重组DNA技术所用的工具酶包括限制酶、DNA连接酶和载体。（）

（4）不同的限制酶切割DNA,可能得到相同的黏性末端。（）

（5）用DNA连接随可连接两种来源不同的DNA。（）

（6）用同一种限制酶切割目的基因和质粒，是为了获得相同的黏性末端，以便连接。（）

（7）限制酶的识别序列都由6个核昔酸组成。（）

2.限制的在原核生物中的作用是什么？它会不会切割自己的DNA分子？请解释。

典题说法

考向1基因工程中工具酶的选择和利用

即1（2023・重庆卷）某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基，短于实际长度）获得了含有目的基因的

DNA片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（）

III

限制悔SpeI5'-ACTAGT-3'N/mI5,-GCTAGC-3,CfoI5'-GCGC・3'

识别序列3,-TGATCA-5,3,-CGATCG-5,31CGCG-5'

ftt

扩增获得5*-AGCTAGCAATGCTC......ATGAACTGCGCA-3'

的DNA片段y-TCGATCGTTACGAG•lACrIGACGCGl-5#

①|琳切

5'-CTAGCAATGCTC......ATGAACTGCG-3'

V-GTTACGAG......TACTTGAC-5,

A.其中一个引物序列为5'-TGCGCAGT-3/

B.步骤①所用的酶是SpeI和C力I

C.用步骤①的能对载体进行能切，至少获得了2个片段

D.酶切片段和载体连接时，可使用E.coliDNA连接酶或T4DNA连接酶

度式下表中列出了几种限制前识别序列及其切割位点，图I、图2中箭头表示相关限制酶的防切位点。

请回答下列问题:

限制酶痴阳IHindIIIEcoRISmaI

识别序III

GGATCCAAGCTTGAATTCCCCGGG

列及切

CCTAGGTTCGAACTTAAGGGGCCC

割位点t

EcoRl日的基因EcoR\

III外海

—DNA

BamWISmalHindDI

图1图2

(1)一个图1所示的质粒分子经夕MI切割前后，分别含有个游离的磷酸基团。

(2)若对图中质粒进行改造，插入的S/M【酶切位点越多，质粒的热稳定性越高。

(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用切割，原因是,

(4)与只使用及oRI相比较，使用及加HI和Hi〃dHI两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在

于可以防止O

(5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入酶。

(6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是o

深度指津

限制酶选择的常见考查方向

(1)载体上的标记基因至少保留一个(选择培养基中加对应的抗生素，且受体细胞不能有该标记基因)。

(2)只能切割目的基因两侧的序列，不能切割内部，否则导致目的基因插入失活。

(3)忖的基因应插在启动子和终止子之间。

(4)合理选择单酣切或者双酶切，即注意区分正向插入正常表达和反向插入异常表达。

(5)不能破坏载体上的有用序列，如启动子、终止子和复制原点等。

(6)要破坏对受体细胞不利的DNA片段，如ccdB片段，其表达产物抑制DNA复制，导入细胞后阻碍

受体细胞存活•，难以形成单菌落，

(7)农杆菌转化法中最关键的是T-DNA序列，目的基因必须插在T-DNA上启动子和终止子之间，

最终转化到植物染色体的标记基因也是T-DNA上的。

（8）注意长序列里面是否含有短序列的酶切位点，比如能被A酶（GGATCC）识别的DNA序列，也可被

B醒（GATC）识别。

（9）注意同尾崎拼接产物不一定还能被原先酹识别（限制陋的特征是识别特定核俘酸序列，切割特定位

点，对碱基序列有严格要求）。

（10）双酶切不•定能实现目的基因定向插入正常表达，比如同尾酶，比如双平末端。能实现目的基因

定句插入的可能是“一平一黏”或“双黏不同”。

提醒：如果对限制酶的选择仍有困难，建议考虑“排除法”。

考向2基因载体和标记基因

即2（多选）根据用途可将基因工程中常用的载体分为克隆载体和表达载体两种，克隆载体的目的是复

制出更多的目的基因，而表达载体的目的是使外源基因在受体中高效表达。下列有关叙述错误的是（）

A.克隆载体必须具备的元件是复制原点、启动子和终止子

B.两种载体都要具有一个或多个限制酶切点，以便目的基因的插入

C.表达载体的元件中必须含有标记基因，不一定有复制原点

D.质粒、动植物病毒、噬函体均可作为克隆载体或表达载体

考点2基因工程的操作程序

考点透析

知识1基因工程的基本操作程序

1.目的基因的筛选与获取

川广通过构建获取

从相关己知结获：-------

构和功能清晰或-利用_______技术获取和扩增

的基因中筛选I通过化学方法人工合成（苏教版）

2.基因表达载体的构建（核心工作）

⑴过程

载体（质粒）DNA分子

_______限制酶或一I

I的限制酶I

产生末端获取目的基因

重组DNA分子（重组质粒）

（2）基因表达载体的组成

目的基•因：位于.______之间

启动子:识别和结合

的部位,驱动目的基因转录mRNA

:转录的终点，在转录过

更制原点

程中起调控作用

________：鉴别受体细胞中是否含有

目的基因

深度指津

复制原点W启动子W起始密码子，终止于W终止密码子

(1)启动子：一段有特殊序列结构的，基本组成单位是脱氧核甘酸，其位于基因的上游，

紧挨转录的起始位点，其自身不转录。终止子：一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的下游。一

个DNA上有多个启动子。启动子靠近模板链的3'端。

(2)起始密码子和终止密码子位于上，分别控制翻译过程的启动和终止。起始密码子靠近

mRNA的5'端。

(3)复制原点是DNA上的一段序列，富含A—T,是DNA复制开始的地方，一个DNA有一个或多个

复制原点。

3.将目的基因导入受体细胞

受体细胞常用方法操作过程

方法一：用微量注射器将含目的基因的

DNA溶液直接注入子房；

________________(我国独创)方法二：将DNA溶液滴加在授粉后一定

时间内的花柱切面上，使目的基因借助花

植物细胞(常用体细胞或受精卵)

粉管通道进入胚囊

将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上一

农杆菌-感染植物细胞一整合

—T-DNA

到受体细胞染色体的DNA上一表达

将含有目的基因的表达载体提纯一取卵

动物细胞(常用受精卯)(受精卵)一显微注射一受精卵发育一获得

—

具有新性状的动物

Ca?+处理细胞一感受态细胞一重组表达

____________(感受态

微生物细胞载体DNA分子与感受态细胞混合一感受

细胞法)

态细胞吸收周围环境中的DNA分子

解疑释惑

(1)目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为o实质是目的基

因整合到受体细胞染色体基因组中。

(2)农杆菌转化法原理：农杆菌易感染植物细胞，并将其Ti质粒上的转移并整合到受体细

胞染色体DNA上。

4.目的基因的检测与鉴定

(I)通过等技术检测目的基因是否导入或是否转录出mRNAo

(2)利用技术检测目的基因是否翻译。

(3)进行个体生物学水平的抗虫、抗病、功能活性等鉴定。

注：若用报告基因，如绿色灵光蛋白基因与目的基因构建融合基因，可根据荧光情况进行定性、定量

和定位的研究分析。

知识2PCR技术

1.原理：和DNA的热变性。

2.特点：可在短时间内目的基因。

3.PCR反应所需的条件及作用

条件作用

有一段已知目的基因的核甘酸序列便于合成__________

在一定的____________中进仃提供相对稳定的pH环境

4种脱氧核昔酸(实际上用脱氧核昔三磷酸，即dNTP)作为合成DNA子链的_______,同时提供_________

DNA母链作为DNA复制的模板

_________的DNA聚合酶(hqDNA聚合酶)催化合成DNA子链

引物(是一小段___________，作为DNA复:制的起始使DNA聚合酶能够从引物的__________端开始连接

序列，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对)脱氧核甘酸

4.过程及图解

3335

5IIII口口口I彳55

3

|约94t：引物I

3

3,11111111111555r

5，」」」」i」」i」」」y3r

②：降前③________:升温

______：

到50七左右(约

超过9()七时.到72t：左右，DNA

55七)，两种引物通

双桂DNA解新链由端

过碱基互补配对与向端延伸

聚为单链两条DNA单链结合

循环重复上述过程，〃次循环后，目的基因的量将被扩增________倍。

的思辨小练

I.判断下列说法的正误:

(1)利用PCR技术扩增目的基因时，两种引物的碱基序列应互补。()

(2)体内DNA复制和PCR技术都需要解旋前打开DNA双螺旋。()

(3)体内DNA复制和PCR过程中，都是一条链连续复制(前导链)，一条链不连续(后随链)。()

(4)构建基因表达载体时，须将H的基因插入启动子与终止子之间。()

(5)农杆菌转化法常用的受体细胞是花粉细胞。()

（6）目的基因必须整合到受体细胞的DNA中才能复制。（）

（7）农杆菌转化法实质是将Ti质粒转移到宿主细胞的染色体Iio（）

2.要合成有生物活性的胰岛素，为什么受体细胞最好用单细胞真核生物？

3.自然界中生物的DNA复制和人工合成中的多聚酶链式反应（PCR）之所以需要引物，是因为在DNA

合成时DNA聚合酶只能来合成子链（延伸方向是5'-3'）。

典题说法

考向1基因表达载体的构建

圆1（2023・湖北卷）用氨苇青霉素抗性基因（4〃/产）、四环素抗性基因（布，作为标记基因构建的质粒如图

所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制陋陋切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化

到受体菌中。下列叙述错误的是（）

A.若用从加011酶切，目的基因转录的产物可能不同

B.若用酶切，在含Tel（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因

C.若用S/力I酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否

D.若用S/MI酸切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨茉青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落

鹰式我国科研人员将寒带地区海鱼中的抗冻基因转入千禧果（番茄品种）细胞中，成功培育出抗冻千禧

果,下图为培育过程使用的Ti质粒示意图，历■区的基因活化能促进T-DNA的加工和转移。下列叙述错

误的是（）

限制和川限制解［I

限制前I\/

四环素

抗性基因^^T-DNAAA

n>Ix-片口_卡那霉素

的嬴喂炉抗性基因

限制酶

A.选择图示Ti质粒构建基因表达载体，应选择限制酶HI

B.利用PCR从海鱼基因组中扩增抗冻基因需要添加一对特异性引物

C.用含卡那霉素的选择培养基筛选成功导入抗冻基因的受体细胞

D.可用抗原一抗体杂交技术检测抗冻基因在转基因千禧果中的表达量

考向2基因工程的操作过程

即2（2024・淮安调研）乙烯具有促进果实成熟的作用，ACC氧化酶和ACC合成酶是番茄细胞合成乙烯

的两个关键酶。利用反义DNA技术（原理见图1）,可以抑制这两个基因的表达，从而使番茄具有耐储存、

宜运输的优点，图2为融合ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因的反义表达载体的结构示意图。

细胞原有基因

（靶基因）

DNAII-

靶mRNAU〜----------〜「印监感黜

反义RNA”jiX的蛋日产物

反义基因糖体结合或被RNA醐降解

图1反义基因技术示意图

（1）从番茄体内提取RNA作为模板，通过合成ACC氧化酹和ACC合成前基因，合成

的基因中（填“含”或“不含”）启动子区域。

（2）该技术首先需要合成ACC氧化酶和ACC合成酶的融合基因，通过PCR合成出的ACC氧化酶基因

两端分别含限制酶Ba,nWI和X加I的酶切位点，ACC合成酶基因两端含SacI和XbaI的酣切位点，用

限制悔对上述两个基因进行能切，再用DNA连接酹处理形成融合基因，相应的表达载体应用

限制酶进行切割，确保融合基因能够插入载体中。

（3）图2中的启动子2Ali为特异性启动子，为了达到目的，启动子2Ali应在番茄的果实（器官）中特异

性启动基因转录。将融合基因（填“正向”或“反向”）插入启动子下游即可构成反义融合基因。

将图中表达载体与农杆菌菌液混合后，接种在含有的培养基中，可筛选出含有反义融合基因的

农杆菌，再利用农杆菌转化法获得转基因番茄。2A11启动子和反义融合基因都应该位于T—DNA片段内，

原因是O

图2反义基因表达载体

（4）在检测番茄细胞中是否存在反义融合基因时，（填“能”或“不能”训放射性标记的ACC

氧化的基因片段做探针进行检测，理由是o

（5）研究人员尝试从个体水平鉴定转基因是否成功，请设计实验方案并预测实验结果：

课后及时课后小结，学清吃透

猿示请老师布置同学们又快又准确地完成《配套精练》！

配套精练

第57讲基因工程的基本工具与操作程序

一、单项选择题

1.下列有关重组DNA技术的基本工具的叙述，正确的是（）

A.限制酶能够识别RNA分子的特定核甘酸序列

B.携带外源DNA片段的质粒可在受体细胞中进行复制

C.DNA连接酶不能连接双链DNA片段的平末端

D.DNA连接酶能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键

2.（2025•扬州期初）目前研究混杂DNA群体中的特异DNA序列，一般基于两种不同的方法，即DNA

克隆和DNA分子杂交，如图所示。下列有关叙述错误的是（）

①

混杂②

DNA群体

4特异性检测HDNA分子杂交

③

A.方法①需要限制酶和DNA连接酶

B.方法②需要解旋酹和DNA聚合能

C.方法③需要对探针进行特殊标记

D.方法①②③都遵循碱基互补配对原则

3.（2024•湖南卷）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原

因并提出解决方法。下列叙述错误的是（）

A.限制的失活，更换新的限制能

B.酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等

C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA

D.酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶

4.（2023・新课标卷）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和前4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两

端含相应限制睡的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制的的切割位点

如绍所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（）

5'-GAATTC-3'5'-GGATCC-3'

3'-Cn'AAG-5,3'-CCTAGG-5'

fifil酶2

5-CCCGGG-35'-AGATCT-3'

3-GGGCCC-53'-TCTAGA-5,

醐3

A.质粒和目的基因都用酶3切割，用Eco〃DNA连接酶连接

B.质粒用前3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA连接前连接

C.质粒和目的基因都用酶I和酶2切割，用T4DNA连接酶连接

D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割,用E.co〃DNA连接酶连接

5.如表为四种限制能所识别的核苜酸序列及相应的切割位置（箭头所指），下列叙述正确的是（）

限制酶种类序列及切点

5。(i\ATTC-3，

①EcoRI

3'-CTTAN；-5'

5CdbATCC-3*

②痴〃HI

3,-CCTA(3G-5,

5Z-MiATCT-3'

③Bglll

3，TCTAGjA-5f

1

5'-(xi；GCCGC-3'

@Notl

3-CGCCGqCG-5'

1

A.①②③④可催化磷酸二酯键和氢键断裂，形成黏性末端

B.①切出的DNA片段，只有用Eco〃DNA连接酶才能连接起来

C.②③切出的末端连接后形成的片段，不能再被②或③识别切割

D.构建基因表达载体时，用②③进行双酶切，可防止目的基因与载体的反向连接

6.重组质粒可以携带目的基因进入受体细胞，则下列不一定可以说明目的基因成功导入受体细胞的是

（）

A.大肠杆菌中检测到人胰岛素基因的mRNA

B.水稻细胞中检测到氨节青霉素抗性基因

C.棉花细胞中检测到抗棉铃虫基因

D.鲤鱼细胞中检测到人的生长激素

7.（2025•如皋期初）科研人员将四种酶的基因（氏。八OsGLO\、EcGCL、7SR）与叶绿体转运肽（引导合

成的蛋白质进入叶绿体）基因连接，构建多基因表达载体（载体中部分序列如图），在水稻叶绿体内构建了一

条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列说法正确的是（）

-溜雕氏W+-鼐髓，

---------------------------------------T-DNA-----------------------------------------------►

注：◎扇动了n终止于勿叶绿体转运肽基因

A.限制的需要识别特定的序列，具有专一性，DNA连接酶不具有专一性

B.含卡那霉素的培养基上不能存活的植物受体细胞未成功导入四种目的基因

C.OsGLOX>&C47基因转录时以DNA的不同单链为模板

D.利用PCR等技术检测OsGLOl基因是否转录时，需要的的是TagDNA聚合酶

8.如图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况，①@③④表示相关物质，L、R表示方向。下列叙

述正确的是（）

①链humIIminIIinIIitIIminIIifififIIif

L5'/^3'3'④5'R

②链UiuuiiiinnuuiiiiiuiuiuiiiiiiuiiiL

A.②链从L到R的方向为3'-5',①②链均可作为子琏合成的模板

B.PCR过程需要通过解旋醒断开氢键，且为边解旋边史制

C.以1个DNA为模板经3次循环需消耗8个引物③

D.物质③的5'端添加了某序列，至少需经2次循环才可获得含该序列的双链产物

9.在基因工程中，常采用花粉管通道法和土壤农杆菌转化法将FI的基因导入植物细胞。如图为花粉管

通道法的一般原理示意图。相关叙述正确的是（）

花粉

落.滴管蘸取外源DNA领蹦丽R崂契

柱头

上JI

刺外源DNA沿花粉管进入受精卵机搐合

激花

粉

管

萌发

并

生溶液涂抹通道进入

长至

房

子雌性柱头胚囊

A.外源DNA进入胚囊最终获得的种子均含有目的基因

B.植物生长各个时期均可通过花粉管通道导入外源DNA

C.花粉管通道法最大的优点是无需植物组织培养，技术简单

D.含外源DNA的种子发育成植株后均具有相应性状

二、多项选择题

10.（2024・海安中学）反向PCR是一种通过已知序列设计反向引物对未知序列（图中L、R）法行扩增的技

术，其过程如下图所示。相关叙述正确的有（）

已知序列

_Q_

碑切

化并

环

人根

福切位点丽切位点加

已知

据②

合

序列

引

成

的

物

A.过程①可用同•种限制酶对未知序列两端进行切割

B.过程③和①获得的DNA片段长度相同，序列不同

C.过程②需使用DNA连接酶，形成氢键和磷酸二酯键

D.该技术可检测T-DNA整合到植物细胞染色体DNA上的位置

11.（2024・湖南卷）最早的双脱氧测序法是在PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苻三磷

酸fddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP）,子链延伸时，双脱氧核甘二磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加

入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP,延伸终止；若配对的为脱氧腺甘三磷酸（dATP）,继续延伸；

PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述

正确的是（）

tddAIP♦ddCTP+ddCiTPtddTIP+ddATAP4ddeCTP+ddGTP+dd1TTP

-电

-泳

-二

方

一

-向

二-

者

对

照S-

A.上述PCR反应体