《生物制药工艺》课件-项目四：酶工程技术制药

固定化细胞法制备L-天冬氨酸《生物制药工艺》L-天冬氨酸（L-asparticacid，L-Asp），含一个氨基两个羧基，分子式C4H7NO4，相对分子量为133.10。湖北生物科技职业学院理化性质：L-天冬氨酸

别名：丁氨二酸、L-天冬酸、L-天门冬氨酸或L-氨基琥珀酸。L-Asp是氨基酸输液的重要组成部分。L-天冬氨酸钾和L-天冬氨酸镁是钾、镁的有效补充剂，可用于心脏病的治疗，也可作为肝功能促进剂和氨解毒剂，对洋地黄等强心苷类中毒引起的心律失常也有较好治疗作用，并可解除恶心、呕吐等中毒症状，还可用于维生素B6及抗肿瘤药物的合成。湖北生物科技职业学院理化性质：L-天冬氨酸（L-Asp）湖北生物科技职业学院提取原理：酶催化延胡索酸转化生成天冬氨酸HOOC-CHHC-COOHNH2-CH-COOHCH2-COOHNH3天冬氨酸酶延胡索酸（富马酸）L-天冬氨酸大肠杆菌AS1.881菌种+湖北生物科技职业学院提取原理：固定化细胞法生产L-天冬氨酸

以卡拉胶为包埋材料固定化高天冬氨酸酶活性的大肠杆菌细胞。将固定化大肠杆菌细胞制成生物反应器实现L-天冬氨酸的连续生产。湖北生物科技职业学院制备方法：L-天冬氨酸固定化生产工艺流程图湖北生物科技职业学院制备方法：步骤一大肠杆菌细胞活化及扩大培养菌种活化扩大培养湖北生物科技职业学院制备方法：步骤二大肠杆菌细胞收集湖北生物科技职业学院制备方法：步骤三大肠杆菌细胞的固定化1g卡拉胶20ml无菌生理盐水45℃，5g/L的大肠杆菌悬浮液混匀固化洗涤切块固定化大肠杆菌细胞加热、溶解再降温至45℃100mL0.3mol/LKCl溶液浸泡4h4℃冷藏30min湖北生物科技职业学院制备方法：步骤四固定化反应器转化及产物分离纯化延胡索酸+铵pH9.01mmol/LMgCl2固定化生物反应器（15cm×30cm）转化率95%转化液37℃活化24h1.0mol/L恒速流过湖北生物科技职业学院制备方法：步骤五转化产物的分离纯化酶反应液脱色液L-天冬氨酸晶体结晶、抽滤、干燥富马酸调pH至等电点活性炭脱色L-Asp是氨基酸输液的重要组成部分。用于蛋白质摄入不足、吸收障碍等氨基酸不能满足机体代谢需要的患者。亦用于改善手术后病人的营养状况。湖北生物科技职业学院扩展知识：L-天冬氨酸产品临床应用①无需进行酶的分离和纯化，减少酶的活力损失，同时大大降低了成本；②对于活细胞来说，保持了酶的原始状态，酶的稳定性更高，对污染的抵抗力更强；③细胞生长停滞时间短，细胞多，反应快等等。湖北生物科技职业学院课后思考：通过固定化细胞技术生产的L-天冬氨酸有优势有那些？卡拉胶优良无毒机械性能较好操作方便稳定性较好包埋条件温和对酶活性和细胞代谢无影响湖北生物科技职业学院课后思考：为什么用卡拉胶作为包埋材料？大肠杆菌发酵提取法生产门冬酰胺酶《生物制药工艺》导入湖北生物科技职业学院

大肠杆菌门冬酰胺酶对治疗白血病有显著疗效。门冬酰胺酶L-天门冬酰胺酶天门冬酰胺酶左旋门冬酰胺酶爱施巴湖北生物科技职业学院作用机制：药用L-天冬酰胺酶L-天冬酰胺门冬酰胺酶水解L-天冬氨酸NH3＋

L-天冬酰胺酶在血液中特异性的催化天冬酰胺水解形成L-天冬氨酸和氨，而天冬酰胺是细胞合成蛋白质及增殖生长所必需的氨基酸。正常细胞有自身合成天冬酰胺的功能，而急性白血病等肿瘤细胞则无此功能，因而当外来天冬酰胺酶使天冬酰胺急剧缺失时，肿瘤细胞因既不能从血中取得足够天冬酰胺，亦不能自身合成，使其蛋白质合成受阻，增值受抑制，细胞大量死亡。因此临床上用于治疗急性淋巴细胞白血病，是第一种用于治疗癌症的酶。

编号：EC3.5.1.1。存在于细菌中的一种水解酶，能特异水解天冬酰胺的酰胺键。大肠杆菌能产生两种L-天冬酰胺酶，即L-天冬酰胺酶Ι和II，其中L-天冬酰胺酶II的抗癌活性较强。湖北生物科技职业学院理化性质：L-天冬酰胺酶（L-Asparaginase）

呈白色粉末状，微有湿性，溶于水，不溶于丙酮、氯仿、乙醚及甲醇。其20%水溶液，室温贮存7d，5℃保存14d，均不减少酶的活力。干品50℃，15min酶活力降低30%；60℃，1h内失活。最适pH为8.5，最适温度为37℃。湖北生物科技职业学院理化性质：L-天冬酰胺酶湖北生物科技职业学院制备方法：L-天冬酰胺酶大肠杆菌菌种活化及扩大培养发酵罐培养提取、沉淀及热处理精制、冻干湖北生物科技职业学院制备步骤：第一步菌种活化及扩大培养菌种活化扩大培养湖北生物科技职业学院制备步骤：第二步发酵罐培养玉米浆培养基+大肠杆菌8%接种量37℃，通气搅拌，培养6-8h离心分离发酵液得菌体加2倍量丙酮搅拌，压滤，滤饼过筛自然风干成菌体干粉湖北生物科技职业学院制备步骤：第三步提取、沉淀、热处理菌体干粉+0.01MpH8硼酸缓冲液37℃搅拌1.5h降温至30℃加入5M醋酸调节pH至4.2-4.4压滤湖北生物科技职业学院制备步骤：第三步提取、沉淀、热处理静置4h过滤滤液[沉淀]2倍体积丙酮粗酶[搅拌，离心]0.3%甘氨酸pH8.8上清液[热处理]甘氨酸60℃，30min酶溶液湖北生物科技职业学院制备步骤：第四步精制、冻干[精制]聚乙二醇不同pH处理无热原酶液[冻干]无菌包装天冬酰胺酶冻干制剂酶溶液湖北生物科技职业学院制备方法：

L-天冬酰胺酶提取工艺流程图pH4.2~4.4大肠杆菌[菌种培养]肉汤培养基37℃，24h肉汤菌种[种子培养]玉米浆37℃，4~8h种子液[发酵]玉米浆37℃，6~8h发酵液[压滤、风干]丙酮干菌体[提取]硼酸缓冲液pH8.3，37℃提取液[沉淀]乙酸粗酶[热处理]甘氨酸60℃，30min酶溶液[精制]聚乙二醇不同pH处理无热原酶液[冻干]无菌包装天冬酰胺酶冻干制剂湖北生物科技职业学院提取原理：

蛋白质沉淀法丙酮pH4.2~4.4聚乙二醇加热60℃30min等电点沉淀高分子聚合物沉淀热变性有机溶剂沉淀湖北生物科技职业学院培门冬酶（Pegaspargase）湖北生物科技职业学院聚乙二醇在药物制剂中的应用湖北生物科技职业学院聚乙二醇在药物制剂中的应用聚乙二醇会通过一些化学反应与蛋白质和多肽类药物相连，这个过程被称作聚乙二醇化(PEGylation)体积增大，不易被肾脏过滤覆盖保护层，防止被酶解水溶性大大增加有助于药物更好地在体内发挥作用湖北生物科技职业学院小结：大肠杆菌发酵提取法大肠杆菌菌种活化及扩大培养发酵罐培养提取、沉淀及热处理精制、冻干湖北生物科技职业学院展望：L-天冬酰胺酶其他生产工艺欧文菌发酵提取法粘质赛氏杆菌发酵提取法重组大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ湖北生物科技职业学院课后思考：如何保护L-天冬酰胺酶酶活在提取过程中可采用哪些措施来保护酶的活性？大肠杆菌发酵提取法生产门冬酰胺酶《生物制药工艺》导入湖北生物科技职业学院

大肠杆菌门冬酰胺酶对治疗白血病有显著疗效。门冬酰胺酶L-天门冬酰胺酶天门冬酰胺酶左旋门冬酰胺酶爱施巴湖北生物科技职业学院作用机制：药用L-天冬酰胺酶L-天冬酰胺门冬酰胺酶水解L-天冬氨酸NH3＋

L-天冬酰胺酶在血液中特异性的催化天冬酰胺水解形成L-天冬氨酸和氨，而天冬酰胺是细胞合成蛋白质及增殖生长所必需的氨基酸。正常细胞有自身合成天冬酰胺的功能，而急性白血病等肿瘤细胞则无此功能，因而当外来天冬酰胺酶使天冬酰胺急剧缺失时，肿瘤细胞因既不能从血中取得足够天冬酰胺，亦不能自身合成，使其蛋白质合成受阻，增值受抑制，细胞大量死亡。因此临床上用于治疗急性淋巴细胞白血病，是第一种用于治疗癌症的酶。

编号：EC3.5.1.1。存在于细菌中的一种水解酶，能特异水解天冬酰胺的酰胺键。大肠杆菌能产生两种L-天冬酰胺酶，即L-天冬酰胺酶Ι和II，其中L-天冬酰胺酶II的抗癌活性较强。湖北生物科技职业学院理化性质：L-天冬酰胺酶（L-Asparaginase）

呈白色粉末状，微有湿性，溶于水，不溶于丙酮、氯仿、乙醚及甲醇。其20%水溶液，室温贮存7d，5℃保存14d，均不减少酶的活力。干品50℃，15min酶活力降低30%；60℃，1h内失活。最适pH为8.5，最适温度为37℃。湖北生物科技职业学院理化性质：L-天冬酰胺酶湖北生物科技职业学院制备方法：L-天冬酰胺酶大肠杆菌菌种活化及扩大培养发酵罐培养提取、沉淀及热处理精制、冻干湖北生物科技职业学院制备步骤：第一步菌种活化及扩大培养菌种活化扩大培养湖北生物科技职业学院制备步骤：第二步发酵罐培养玉米浆培养基+大肠杆菌8%接种量37℃，通气搅拌，培养6-8h离心分离发酵液得菌体加2倍量丙酮搅拌，压滤，滤饼过筛自然风干成菌体干粉湖北生物科技职业学院制备步骤：第三步提取、沉淀、热处理菌体干粉+0.01MpH8硼酸缓冲液37℃搅拌1.5h降温至30℃加入5M醋酸调节pH至4.2-4.4压滤湖北生物科技职业学院制备步骤：第三步提取、沉淀、热处理静置4h过滤滤液[沉淀]2倍体积丙酮粗酶[搅拌，离心]0.3%甘氨酸pH8.8上清液[热处理]甘氨酸60℃，30min酶溶液湖北生物科技职业学院制备步骤：第四步精制、冻干[精制]聚乙二醇不同pH处理无热原酶液[冻干]无菌包装天冬酰胺酶冻干制剂酶溶液湖北生物科技职业学院制备方法：

L-天冬酰胺酶提取工艺流程图pH4.2~4.4大肠杆菌[菌种培养]肉汤培养基37℃，24h肉汤菌种[种子培养]玉米浆37℃，4~8h种子液[发酵]玉米浆37℃，6~8h发酵液[压滤、风干]丙酮干菌体[提取]硼酸缓冲液pH8.3，37℃提取液[沉淀]乙酸粗酶[热处理]甘氨酸60℃，30min酶溶液[精制]聚乙二醇不同pH处理无热原酶液[冻干]无菌包装天冬酰胺酶冻干制剂湖北生物科技职业学院提取原理：

蛋白质沉淀法丙酮pH4.2~4.4聚乙二醇加热60℃30min等电点沉淀高分子聚合物沉淀热变性有机溶剂沉淀湖北生物科技职业学院培门冬酶（Pegaspargase）湖北生物科技职业学院聚乙二醇在药物制剂中的应用湖北生物科技职业学院聚乙二醇在药物制剂中的应用聚乙二醇会通过一些化学反应与蛋白质和多肽类药物相连，这个过程被称作聚