血小板功能检测

血小板功能检测

:血小板在止血与动脉血栓形成中得作用包括粘附到受损血管处或破裂得动脉粥样硬化斑块

处，形成止血栓或凝块；加速凝血瀑布导致凝血酶得形成。本文综述了血小板得作用，列举了

遗传性得血小板缺陷及异常出血性疾病，并讨论了各种血小板致聚剂。

本文综述了各种血小板功能检测方法以及它们得优缺点：出血时间测定；利用透光性得改变

来检测枸橡酸钠抗凝得富含血小板血浆中血小板得聚集功能；阻抗聚集仪检测枸橡酸钠抗凝

全血中血小板得聚集功能；高切变力血小板功能分析仪（PFA-100）与Ultegra快速血小板功

能测定仪检测血小板相关得止血功能；用锥板分析仪检测高切变力下血小板得粘附与聚集功

能；检测血小板颗后内容物得分泌（ATP,14C-5-彩色胺，国小板第4因子与B一皮小板俅茶向）

与血栓烷B2得形成；流式细胞术检测体内与体外使用致聚剂得血小板激活情况（包括血小板

膜藕蛋白构象改变，P-选捏素与磷脂酰丝氨酸得表达）；检测遗传性块陷中血小板膜糖蛋白得

水平。

1简介

血小板在止血与血栓中得作用

当血管损伤时，血小板会迅速粘附到损伤处，聚集形成由歼维蛋白固定得止血块。在微血管损

伤处及破裂得动脉粥样硬化斑块处也会发生类似得过程，最终形成血小板一纤维蛋白血栓，

引发动脉硬化症得血栓性并发症。

体内能够激活血小板得诱导剂主要有胶原我白，ADP,血栓烧A2CTXA2）,凝血酶，弱诱导的有5

一羟色胺与肾上腺素。血小板上不仅有针对这些介质得受体，还有纤维蛋白原与VWF得受体。

TXA2得形成与释放以及血小板致密颗粒中分泌得ADP与5—法色胺会加速血小板得激活过程,

促凝表面得暴露促进凝血阵得形成，而凝血酶就是强有效得激活剂。激活也会诱导a-颗粒内

容物得分泌与颗粒跨膜蛋白P-选择素出现在血小板得表面上。所有血小板致聚剂都具有协

同作用，因此当凝集过程得某个途径存在缺陷或被抑制时，血小板得凝集功能将被大大受损。

在血管壁得损伤处，血小板与内皮下细胞外基质中得VonWillebrand因子（VWF）,胶原蛋白

与纤维结合素粘附在一起。在高切变力情况下，血小板糖蛋白GPIb/IX/V复合物与VWF得相

互反应就是升常短暂得，但当VWF与血小板表面将GPIlb/lIla结合，这一过程会变成不可逆

得。血小板表面胶原蛋白受体包括GPIa/lla（a2B1）,它在粘附过程中具有非常重要得作用;

而GPVI在血小板活化引起TXA2得形成与释放以及致密颗粒与a贮存颗粒内容物得分泌过程

中起作用。血小板存在TXA2与ADP受体，在损伤处流动得血小板受刺激后会改变形状，伸出

伪足，进而在粘附血小板周围形成聚集物。

聚集过程需要血小板表面得异二聚体整合素分泌与血小板表面磷脂双分子层翻转暴露促凝

磷脂表面，通常为磷脂酰丝氮酸（PS）翻转到血小板表面。也会产生促凝活性得微粒。PS得暴

露大大加速了凝血途径因子X与凝血酶原酶得反应，产生了最有效得血小板诱导剂一凝血

酶。凝血酶切开血小板表面得蛋白酶激活受体，导致GPIIbGPIIb/llla复合物转变成纤维蛋

白原得受体或某些情况下作为VWF得受体。这些安白会在邻近得受刺激得血小板之间搭桥。

激活得正常得GPIIb/llls在血小板聚集过程中非常重要。

当血小板受胶原蛋白与凝血薛等致聚剂刺激，能引起血小板颗粒得/IIla得激活，形成TXA2

与引起血小板颗粒内容物得分泌。凝血酶同样促使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，包裹在血小

板聚合物表面形成坚固得止血块或血栓。

在磷脂酶A2作用下膜磷脂释要目得在于确定异常出血得原因或确保在手术或牙科侵入性操

作（包括拔牙）过程中得正常止血功能。多种方法尝试来证实高血小板活性有血栓形成得倾向,

这个专题最近被Thiagarsjan与Wu等进行综述。

异常出血常见得原因为血小板减少症，这可通过血小板计数来确定。当血小板计数低放出花

生四烯酸时可产生TXA2。在环氧化酶（C0X-1）与血栓烷合酶作用下，花生四炸酸转变为TXA2。

TXA2只能短期存在，很快形成无活性得稳定产物TXB2。C0X-1被阿司匹林不可逆地灭活，因

此血小板生成TXA2得能力受到它们在外周循环停留时间得影响。

任何一项血小板功能受损,都会削弱凝血功能。血小板功能检测得主于50-70X109/1,就会

导致瘀斑与凝血异常。血小板减少症会影响大多数血小板功能检测方法，但对流式细胞术除

外。

1、1遗传性与获得性血小板功能锹陷

表1列举了部分遗传性疾病，它们得血小板功能存在某种程度得受损，有明显得出血症状。除

VonWillebrand病（VWD）外，大多数缺陷非常罕见。

虽然某些食物与天然物质中含有抑制物，但就是药物因素仍就是最主要得引起获得性血小板

功能低下得原因。抑制血小板功能得药物中有能抑制C0X得阿斯匹林与其它非给醇类抗感染

药，抗生素如青霉素，thienopyridines（噬氯匹定与clopidogrel）,GPIlb/1IIa拮抗剂，影响

cAMP水平得药物，抗凝剂如肝素，纤溶制剂，心血管药物，神经科药物与麻醉药物等。到目前

为止阿司匹林就是最常见得抑制剂，至少有250种药物中含有这种成分。阿司匹林得作用就

是长期得，它对C0X-1得乙酰化作用就是不可逆得。

非血液系统疾病引起血小板功能降低得疾病有：尿毒症，受性肝病，骨髓增殖性疾病与获得性

VWDo

表1遗传性出血疾病

Glanzmann血小板机能不全：GPIlb/lIla（aIlbB3）缺失或异常它就是纤维蛋白原与VNF得

受体，对任何血小板致聚前无反应。

Bernard-SouIier巨大血小板综合症:GPIb/IX/V缺失或异常它参与血小板与内皮下程VWF

粘附。对篇斯霉素无反应。

GPIa/lla（a201）缺失或异常。不能粘附胶原蛋白

GPVI缺失或异常。不能被胶原蛋白激活

P2Y12缺失或异常。它就是ADP与腺昔酰环化酶得受体。非常罕见

贮存池疾病包括血小板分泌缺陷

初级分泌缺陷。就是由于颗粒内容物缺陷或放大途径缺陷之外得原因引起将一大类分泌性疾

病一最常见得先天性分泌缺陷病

致密颗粒蚊陷（6一颗粒）（如Hermansky-PudIack综合症，Chediak-Higashi综合

症）

a一颗粒缺陷（a一颗粒）（灰血小板综合症）

致密颗粒与a—颗粒缺陷

Quebec血小板综合症

Jacobsen或Paris-Trousseau综合症

Scott综合症。刺激后不形成促凝表面

花生四怖酸动员，环氧化酶,血栓烷酶或TXA2受体、VWF缺陷

1型VWD-VWF部分减少（占80%病例）

2型VWD-VWF异常（占15-20%病例）

3型VWD—VWF块失（罕见）

血小板型VW。GPIb/IX/V表型功能增强

纤维蛋白原缺乏症

2血小板功能检测

最早得检测血小板功能得方法就是出血时间。Thiagarajan与Wu定义得皮肤表面出血时间

为：在上臂处用血压绷带加压到40mmHg,然后采用一次性得自动得设备在前臂得掌侧皮肤表

而上划一道长10mm,深Im标准得切口，每隔30秒吸去伤口处得血液，直到出血停止。正常

得出血时间少于10分钟。当血小板计数小于100X109/1时，出血时间会延长，因此这一方法

“在血小板减少得患者测定血小板功能得抉陷时作用有限”。它得优点在于操作简单，快速，

不需要对血液进一步得检测与处理，缺点就是受技术人员得操作技术，皮肤厚度与温度得影

响。本方法抉乏一致性，在判断出血倾向方面就是不敏感指标。

其它血小板功能检测方法需要小心抽血与处理。患者不能加绷带与一周不能服用影响血小板

功能得药物。19-20号针头与塑料注射器用于捋脉穿刺，从静脉穿刺到实验得间隔时间必需

标准化，这就是因为血样中丢失得C02会使pH值升高，增加血小板对致聚剂得反应能力。必

须防止溶血，因为溶解得红细胞会释放出血小板得诱导剂ADP。容器必须就是些料得或硅化

玻璃以防止血小板吸附到容器表面。抗凝剂得选择以及温度也会影响血小板得功能，抗凝血

应置于室温或37'C,而不隹置于4C。一般不推荐使用真空管，除非使用自动血小板功能分析

仪（见2、4与2、5）o

最常见得抗凝剂就是枸椽酸钠，它可以将钙离子得浓度降到微摩尔级（枸株酸钠终浓度为

10、9mM,钙离子得浓度为40HM；枸株酸钠终浓度为12、钙离子得浓度V5HM）。如果使

用EDTA抗凝剂，钙离子得浓度将能低至不能使血小板凝集。肝素得效果不好，因为血小板经

常粘附到试管壁，并且会使血小板集聚，在离心中沉积到红细胞中，使富含血小板血浆中得血

小板数目减少。水蛭素与PPACK通过抑制凝血酶得活性枭抗凝，它们可以维持生理性浓度得

钙离子，而某些实验中正需要这种浓度，但水蛙素得价格非常昂贵无法常规使用。

2、1血小板聚集

到目前为止评价血小板功能最常见得方法就是测定血小板得聚集功能，抗凝血在离心力

135g离心15分钟,制备富含血小板血浆（PRP）。如果可能，血小板计数应当标准化（如在浓度

为250X109/I时测定），这可以通过加入少血小板血浆来实现。1毫升（或0、5毫升）PRP

在37℃加入到装有金属磁棒得破墙试管中，在聚集仪中磁棒以1100rpm转动，通过比色计记

录穿过PRP得光强度。大多数诱导剂加入后，血小板形态由片状转变为圆形，形成伪足，引起

短暂得光透过率得下降，然后由于血小板聚集，光透过率大幅度增加。光透过率增加得速度与

程度会被记录下来。致聚剂主要为ADP,肾上腺素，胶原蛋白，花生四端酸，TTXA2得类似物如

U46619,或凝血■酶使体活化肽如SFLLRN。（凝血酶不能作为PRP符促凝剂，因为会引起凝结）。

正常情况下枸椽酸抗凝得PRP,对高浓度致聚剂反应得聚集程度，与TXA2得形成，颗粒内容物

得分泌与血小板表面P-选择素得形成有关。

低血小板计数会影响血小板聚集试脸，如果PRP中血小板计数低于100X109/1结果就不可

靠。如果就是脂血，也不能进行此试脸。

如果血小板改变了形态，但不能与所有得致聚剂发生聚集，则其原因可能就是罕见得

Glanzmann血小板减少症。

与胶原蛋白或凝血酶相比.ADP就是弱得致聚剂，在枸榛酸抗凝得PRP中，低浓度ADP只引起

初步得，不完全得，可逆得聚集。但当浓度高于1-3uMB寸，初级得血小板聚集将不可逆，而且

紧接着会引起第二相不可逆得过程（图1）。这个两相血小板聚集过程依赖TXA2得形成。高

浓度ADP情况下，这两相聚集过程会融合，形成一个平滑得曲线（图1）,类似于胶原蛋白或凝

血酶得刺激效果。药物，如阿司匹林，会抑制TXA2得形成，阻碍了ADP介导得第二相乘集过程。

在生理性得钙离子介质中，只会发生第一相得聚集反应。

ADP诱导聚集严重减弱，以及胶原蛋白与凝血酶诱导聚集受损，提示为罕见得P2Y12ADP受体

异常。噬氯匹定与clopidogrel通过此受体作用，产生类以得对ADP诱导选择性抑制。

弱得致聚剂，肾上腺素（570uM）,可聚集PRP中得血小板，而不改变血小板得形态，但肾上腺

素得致聚作用并不一致。如果服用了阿司匹林或其它抑制TXA2形成得药物，血小板对任何浓

度得肾上腺素都不反应，不会产生聚集。

胶原纤维（1-5ug/ml）会引起特征性滞后（可达1分钟）得血小板聚集，聚集需要TXA2形成与

颗粒内容物得分泌，而且基本上就是不可逆得。虽然血小板形态发生了变化，但就是阿司匹林

及其它抑制TXA2形成得药物可以阻断低浓度得胶原蛋白引起得聚集反应。罕见得GPVI缺陷

症表现为血小板受胶原蛋白刺激后并不发生聚集，但在受到其它致聚剂得刺激后通常会发生

聚集。

花生四饰酸可以转变为TXA2,因此可作为聚集剂。阿司匹林与其它可以抑制环氧化酶得药物

具有抑制作用。但就是TXA2得类似物U46619,却可以在此类抑制剂得存在状况下产生聚集

作用。在罕见得环氧化晦缺失得病人，花生四烯酸不诱导血小板聚集，但U46619会引起血小

板得聚集。

SFLLRN（TRAP）具有凝血酶得诱导血小板强聚集作用得功能，只有当TXA2形成障碍8寸，这一作

用才会稍有减弱。

分泌缺陷，特别就是致密颗粒然少ADP得增强作用，会造成异常得聚集，即存在正常得第一相

过程，而无第二相过程。分泌缺陷时低浓度得胶原蛋白与SFLLRN诱导血小板聚集会减弱。

2、2篇托霉素聚集血小板

这一试脸同样用聚集仪对枸椽酸抗凝得PRP进行测试。抗生素瑞托霉素可作为致聚剂，终浓

度常见为1、5mg/mlo正常得样本就是第一相聚集后紧接着会发生第二相聚集。缺乏反应提

示为BernardSouIier综合症或VW「缺乏。

2、3全血血小板聚集

用阻抗血小板聚集仪可测定稀释得抗凝全血得血小板聚集功能。将两个电极插入样本中，当

有电流通过时，血小板会林附到电极上。然后添加致聚剂加以搅抨，在电极上得血小板周围血

小板聚集，记录阻抗变化得速率与幅度。这一试脸得优点在于不用制备PRP,而且脂血中得血

小板功能也可测量，但不适合血小板计数极低得病人。

2、4血小板功能分析仪一100

DadeBehring血小板功能分析仪（PFA—100）就是微处理器控制得仪器，它可定量测定高切变

力下血小板与血小板相关得止血功能。试脸过程为0、8ml枸株酸抗凝血加到装有一次性试

脸管得槽内（要求4小时内血样），预温到37'C,然后利用真空吸力使血样通过一个直径200

pm得不锈钢毛细管与直径为150|im得硝酸纤维膜微孔，膜上包被胶原蛋白与肾上腺素

（CEPI）或胶原蛋白与ADP：CADP）o在5000-6000/s得高切变与诱导剂得作用下，血小板产生

聚集，阻碍血液穿过微孔，堵塞微孔得时间称为终止时间①T）,最大测定值为300秒。血小板

最初通过GPIb/IX/V与VWF间得相互作用以及GPIa/lla,VWF得直接连接粘附到膜上得胶原

蛋白上导致聚集，而不就是由纤维蛋白原连接到活化血小板得GPHb/llla引起聚集。

12、9mM得枸株酸钠抗凝时得到得CT值比浓度为10、91nM枸株酸钠抗凝CT值要大，因此选

择合适得抗凝剂浓度就是非常重要得。PPACK也可用作抗凝剂。

仅在CEPI管CT时间延长，可能就是较微得遗传性血小极功能缺陷（如贮存池异常）与阿司匹

林抑制。CEPI管与CADP管CT时间均延长，可能为严重得遗传性血小板功能障碍（如

GIanzmann血小板机能不全与Bernard-SouIier综合症）与VWD。实际上PFA-100就是有效得

筛选VWD得手段，特别就是1型一VWD,而且对妇女月经过多及儿童得鼻出血怀疑有血小板异

常或VWD进行鉴别就是非常有用得。它同时有利于监测1型一VWD患者对DDAVP得反应与PTCA

患者对GPIIb/llla拮抗剂得反应，也可用于评估血库提供得浓缩血小板质量与血小板输注

得效果。

PFA-100具有操作简单，快速，重复性好，全血用量少得优点。血小板计数少于50X109/L与

红细胞比容V25%叶会引起CT时间延长。

2、5Ultegra快速血小板功能检测

Accumetrics快速血小板功能实验（RPFA）提供了一种简单，快速，准确得血小板功能检测方

法，它用于床边监测接受GPIlb/1Ila拮抗剂得患者。枸椽酸钠抗凝全血采集后，马上班0、

16nli样本加到有2个样本通道得一次性试管中。通过由微处理器驱动得钢珠运动，血液与血

小板致聚剂（is。-S）FLLRN与纤维蛋白原包被得聚苯乙烯珠混匀70秒，检测样本得透光强度。

激活得血小板与包被纤维蛋白原得珠子之间发生凝集，沉入底部，引起光透过率得增加。凝集

得速度与强度可用血小板凝集单位（PAU）计算，当有GPIIb/llla拮抗剂存在，PAU值会迅速下

降，这就是因为凝集发生与活化血小板上得未被阻断得GPIIb/llla受体成正比关系。RPFA

用来监测GPIlb/1Ila拮抗剂abciximab,tirofiban,eptifibatide与orofiban对血小板得

阻断效果.

2、6锥板分析仪

Varon及其同事开发了锥板分析仪（CPA）,在高切变力得条件下使用维板粘度计检测血小板

得粘附与聚集。这一装置通过锥体得旋转在板表面产生均一得切变压力引起层流。0、2ml

得枸稼酸钠抗凝全血加到聚苯乙烯板上，以1800/s切变速度旋转2分钟，随后染色。图形分

析仪分析粘附得血小板与血小板聚集，可提供大小分布得得直方图，表面覆盖得百分比（SC）

与平均大小（AS）。血小板粘附到聚恭乙饰板上依赖于板上包被得VWF与纤维蛋白

原，GPUb/lIla,GPIb/IX/V以及血小板得激活。CPA可快速确定先天性与获得性得血小板缺

陷及VWD,也可测试抗血小板疗效与确定血小板功能亢进患者得血栓前形成状态。

CPA得优点在于快速，端单，只需0、2ml全血。

2、7颗粒内容物分泌得检测

发光聚集仪可同时检测血小板聚集与ATP（一种致密颗粒得组成部分）得释放。用荧光索酶检

测ATP,ATP得浓度参照正常人PRP与已知ATP浓度制备潺标准曲线进行计算。

加入诱导剂，检测已标记血小板得14C-5-羟色胺得分泌状况可指示致密颗粒得分泌情况。

当诱导分泌内容物时，a颗粒跨膜蛋白P-选择素会出现在血小板得表面，这可通过流式细胞

仪检测（见2、9）o

血小板第4因子（PF4）与6—血小板球蛋白就是血小板特异性蛋白，贮存于a颗粒，在血小板

激活时释放。可用放射性免疫方法测定，但应注意静脉穿刺对结果影响比较大。

2、8花生四炖酸将动员与血栓烷B2得形成

在正常情况下，诱导剂可将花生四燥酸从血小板得磷脂层中动员出来，并通过血小板转变为

血栓烧B2。血栓烷B2就是一种稳定得复合物，可通过商用得放射性免疫测定法与酶免法来

测定。

2、9流式细胞术

流式细胞术可快速检测抗凝血、稀释全血、PRP、人工介质中悬浮得少量血小板。使用全血

可以避免操作过程中血小板被激活。通常血小板与联接不同光谱得荧光素得两种单克隆抗体

（MoAbs）反应。为确定血小板得特异性,第一个MoAb特异性针对GPIb,lib或Illa,并在近饱

与溶液中使用。为确定血小板上得抗原决定簇，血小板还与另一标记MoAb反应。这种MoAb

特异性针对表位，也在饱与溶液中使用。与抗体孵育后，稀释样本以1000-100,000细胞/min

得速度在流式细胞仪上检测。聚焦激光束在其相应得吸收光谱内激发了联接得荧光。血小板

通过标识得荧光素以及前向角与侧向角得特性进行确认。第二个单抗发出得焚光强弱与某一

抗原决定簇得密度成正比.并可通过获取上千个血小板来计数。这些数据均可用软件来分析。

因为激发光谱有部分被重叠，每一混合荧光需设置补偿。

如果抗原决定簇得表达随着时间而变化（如膜GPs得滑动），着色前血小板可先用1%得多聚

甲醛固定，它不干扰抗体结合。如果不就是立即进行流式细胞仪检测，血小板也可在加入着色

剂后再固定（原理同上）。

许多荧光素标记得抗体及非抗体源得探针均可标记血小板抗原决定簇。MoAbs除可以与未被

活化血小板得GPs结合外，某些激活依赖MoAbs可检测GPs构象变化（如PAC1可检测

GPIlb/llla）或颗粒膜蛋白表达（如抗P一选择素）。非抗体探针包括PKH亲脂性膜染料，可用

摊亲与素标记荧光检测得生物素与用于检测血小板活化促凝表面得暴露情况得荧光标记得

annexinVo

流式细胞仪可有效评估离