备课素材：判断目的基因的接入方向-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

判断目的基因的接入方向

目的基因正反接的判断需通过分子生物学实验验证，最常用且有效的方法依次为：测序确认（金标准）、限制性酶切图谱分析、PCR扩增分析；辅助方法包括功能检测（如报告基因表达）。1.测序确认（金标准）原理：通过Sanger测序直接读取重组质粒中插入片段的序列及方向，与设计的目的基因序列对比，明确是否存在反向插入。

例1、20世纪70年代Fredsanger发明了双脱氧终止法对DNA进行测序，其原理如图：在4支试管中分别加入4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）和1种双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）；ddN'TP可以与dNTP竞争核苷酸链延长位点，并终止DNA片段的延伸，在4支试管中DNA链将会分别在A、G、C、T位置终止，并形成不同长度的DNA片段，这些片段可被电泳分开并显示出来。下列说法中错误的是（）

A．这种测序方法需要引物和耐高温的DNA聚合酶B．电泳图谱中的箭头所指的DNA片段以鸟嘌呤结尾C．测得未知DNA的序列为5'-GATTCGAGCTGA-3'D．ddNTP与dNTP竞争的延长位点是核苷酸链的3'端答案C2.限制性酶切图谱分析

原理：利用插入片段两端的限制酶位点，通过双酶切或单酶切释放插入片段，结合电泳条带大小判断方向。应用：

双酶切法：选择目的基因两端的不同限制酶（如EcoRⅠ和HindⅢ），对重组质粒进行双酶切，若切下的插入片段大小与预期一致，则方向正确；

例2、从图1酶切结果分析，图2中的目的基因（长度为20kb）插入方向正确的重组质粒序号和作出该判断所用的限制酶是（）A．①，EcoRI和HindⅢB．①，BamHIC．②，EcoRI和HindⅢD．②，EcoRI答案：A

单酶切法：若载体和目的基因均含同一酶切位点（如BamHⅠ），单酶切后可产生不同长度的线性化质粒（正向连接与反向连接的片段大小不同），通过电泳区分。

例3、当目的基因和质粒都用HindⅢ处理、连接后，目的基因可能正向插入载体，也可能反向插入载体，为判断目的基因的插入方向，可使用限制酶处理，并进行电泳检测（如图）。下列选项中能判断目的基因插入方向的限制酶是（

）注：EcoRⅠ、BamHⅠ和HindⅢ的识别序列、切割位点均不同，数字表示相邻两个限制酶切点之间的碱基对数（bp），质粒全长20000bp。A．HindⅢ B．EcoRI C．BamHI D．EcoRⅠ和HindⅢ答案B3.PCR扩增分析

原理：设计跨越插入位点的引物（一端与载体骨架互补，另一端与目的基因互补），通过PCR扩增产物的大小判断方向。应用：

引物设计：正向引物（F）结合载体多克隆位点上游，反向引物（R）结合目的基因3’端；若目的基因正向插入，PCR产物大小为“载体片段+目的基因长度”；若反向插入，则无法扩增出预期片段（或片段大小异常）；注：多克隆位点：基因工程载体（如质粒、噬菌体载体等）上一段人工合成的、集中排列了多种不同限制内切酶单识别位点的DNA序列。

当目的基因和载体用同一种限制酶处理，连接后目的基因可能正向插入载体，也可能反向插入载体，为判断目的基因的插入方向，可设计引物进行PCR后再结合电泳检测。图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，其中目的基因的长度为300bp（bp：碱基对数）。下列叙述错误的是（

）A．PCR扩增的原理与生物体内DNA复制的原理相同B．抗性基因作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入目的基因C．选取引物甲、丙，扩增出450bp长度片段时，可以说明目的基因正接D．选取引物甲、乙，扩增出400bp长度片段时，可以说明目的基因反接答案C4.功能检测（辅助方法）

原理：通过目的基因的表达产物（如蛋白质、报告基因）判断方向是否正确（反向插入通常无法正常表达）。应用：

若目的基因含报告基因（如GFP、荧光素酶），可通过荧光显微镜观察或化学发光检测，若正向插入则报告基因表达（有荧光/发光），反向插入则不表达；

若目的基因编码功能蛋白（如酶），可通过酶活性测定（如Westernblot检测蛋白表达），若正向插入则酶活性高，反向插入则无活性；

示例：重组质粒中含RFP基因，正向插入时发红色荧光，反向插入则无荧光，可快速筛选正确克隆。

CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起，使其表达成一条多肽。下图是基因表达载体的一部分，下列叙述错误的是（）A．若该拼接基因在受