病毒核酸检测统一标准操作作业规程荧光法

EB病毒（EBV）核酸检测原则操作规程

（荧光PCR法）

1.目

规范EB病毒核酸DNA（荧光PCR法）检测操作流程，精确进行EB病毒DNA分析。

2.应用范畴

使用中山大学达安基因股份有限公司EB病毒核酸扩增（PCR）荧光定量检测试剂盒（荧光

PCR法）和Mx3000P荧光定量PCR仪、Roche480荧光定量PCR仪进行EB病毒DNA检测。

3.职责

由PCR实验室制定程序文献，专业技术人员负责执行，实验室主管负责监督实行。

4.内容

4.1实验原理及其临床应用

本试剂盒用一对EB病毒（EBV）特异性引物和一条EB病毒（EBV）特异性荧光探针，配以

PCR反映液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、核甘酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩增法检测EB

病毒（EBV）DNAo用于人血中EB病毒DNA测定，为临床提供参照，

4.2标本采集

4.2.1使用标本类型：全血。

4.2.2标本采集；由合伙单位按照如下规定进行采集。

4.2.2.1全血：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入EDTA（乙二胺四乙酸二钠）

或枸檬酸钠抗凝剂玻璃管，及时轻轻颠倒玻璃管混合5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，

密闭送检。

4.2.3标本保存和运送：标本可及时用于测试，也可以保存于-20C待测，保存期为6个月。

标本运送采用0（冰壶。

4.3试剂准备

4.3.1供应商：中山大学达安基囚股份有限公司。

4.3.2此实验试剂应放在冰箱-20C保存，在实验前5分钟取出备用，实验后应及时放回冰

箱-20℃。

4.3.3如果试剂浮现了封口蜡破损导致液体外漏以及过期试剂，应及时更换。

4.4质控品

4.4.1质控品来源：随试剂盒，由厂家提供。

4.4.2质控品保存条件：置于-20℃冰箱中保存。

4.4.3质控频度：每次实验均需做质控。

4.5操作过程阐明

4.5.1DNA提取

4.5.1.1质控品解决：取出阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品。8000rpm离心数

秒，吸50ul至0.5ml灭菌离心管中,加入50U1DNA提取液充分混匀，10CTC恒温解决

10±1分钟；1rpm离心5分钟，备用。

4.5.1.2样本解决

4.5.1.2.1取全血500ul至干燥玻璃试管中，加入生理盐水500ul轻摇混匀；

4.5.1.2.2取干燥玻璃试管加入1ml淋巴细胞分离液;

4.5.1.2.3将稀释好全血用移液器缓慢加入加有淋巴细胞分离液试管中（注意沿着管壁，速

度要慢）；

4.5.1.2.4rpm离心20分钟（建议用水平离心机）；

4.5.1.2.5吸取白细胞层（从上往下第二层），加入1.5ml离心管，Irpm离心5分钟；

4.5.1.2.6去上清，沉淀中加入50ulDNA提取液充分混匀，1001恒温解决10±1分钟；Irpm

离心5分钟，上清备用。

4.5.2.1加样：取PCR反映管若干，加入解决后样品（标本、阴性质控品、临界或强阳性质

控品）上清液5ul,800Drpm离心数秒，放入仪器样品槽。

4.5.3PCR扩增

将准备好PCR反映管放置于PCR仪上，编辑样本信息并按下列循环参数进行扩增反

映：37℃-2min；94℃-2min；（94℃-15ses；55℃-45ses）X40cyclics；

EBV检测荧光素：FAV；反映体系：50ul；荧光信号收集：55℃-45ses,末端收集。

4.5.3Mx3000P荧光定量PCR仪设立及成果分析

4.5.3.1打开计算机电源。

4.5.3.2将Mx3000P电源开关打开，在大概1分钟时间内，仪器将会自检并且能听到滤镜轮

转动声音。打开电脑上Mx3000P软件，拟定软件界面右下面联机标志呈现绿色

这时只需要继续稍等半晌，待仪器自检完毕，会自动连接计算机。

$dec<W

RMHWE

•Asie”PCA魅s

「£ov<>«aBv«QurM4icnfCdbatal

「StBR?G»h*[«MomCw)

「£va6*M»^(w*tC^nacwtanC«TM|

「AMeCMomtor./$«*»RM»Tm

广MatocUtffiMcmM<noCuw

n

「Qj

「R^eRMI/XMDtomtor.

4.5.3.3在软件弹出框中选取您要进行实验类型,普通选取第一项

uQuantitivePCR（MultipleStandards）”进行绝对定量分析。

4.5.3.4拟定卤鸨灯已经打开。9（绿色）则阐明卤铝灯已经打开；4J（黄色）则阐明卤

铝灯正在预热；91（红色）则阐明卤鸨灯没有被打开，这时需要用鼠标点击这

个标志将光源打开。在卤鸨灯已经被打开状况下，软件界面右下方会显示

——■（绿色）0

4.5.3.5最佳在仪器与光源预热20分钟后开始实验。

4.5.3.6在JPlateSetup」里,对所选孔进行设定，在Welltype中设定Standard

（原则品）、NTC（阴性对照）、unkown（样品）等，并选取对的荧光通道（FAM,

HEX,ROX,Cy5）,参比荧光（Referencedye）选None。对于原则品,在We11type

中设定为“Standard”后，再设定其模板浓度。办法为：点击

Standardquantity:|jHW°0e+0U7,10倍浓度梯度可以直接点击.ato-Increment：10

在下拉菜单中选取不同系数关系后，依次点击设定为原则品此外几种孔，浓度将实

时显示。也可以直接点击原则品各个孔位，在Standardquantity:|FAM二]14e+0007―一

栏，手工输入浓度。若要对不同样品进行编号，则双击所选孔，在name框中输入样

品号，点击就能显示样品编号。或者点击版面右上方Import,导入

此前使用96孔板设定。

01:00;

4.5.3.7点击ThermalProfileSetup,进行PCR循环设定，可以直接点击温度、时间

化各项温度、时间、循环数等。在选定大环节之后添加环节可选定该大环节后,

Segment],或点击鼠标右键，在弹出对话框中，选取AddSegment,

扩增曲线，6田熊:谢/逅藏Ct值列表，钎西涵向凰谴原则曲线，

1•述近通圆亚城样本起始浓度，6斤面嬴T成果excel表格输出，

616ns茶茴;扇。混合并面板，涉及设立、程序设定、样本Ct值、扩增曲线四个面

板。

Options

OpticsConfiguration...

AnalysisTernSettings...

4.5.3.11分析曲线时，如果曲线不够光滑，还能用IEreferewces;___________^Smoothing

对曲线进行调节，普通Amplificationaverage是3,可按需要将其调至较大数值,

Amplxfxcatxonaveraging修三］如5、7、9,调节后曲线将更光滑，但是Ct值会稍微

靠后一点，使数据失真，普通状况下，不建议这样做。

Options

OpticsConfiguration...

AnalysisTernSettings...

4.5.3.12如果需要对每条曲线进行单独基线设立，点击L"eferences.^_______________|中

BaselineCorrection,点击Adaptivebaseline,在下面相应各孔，单独进行基

线起始和终结位置调节。

4.5.3.13关于Mx3000P调用前一次实验原则曲线补充阐明。点击桌面Mx3000P软件图标,

弹出话框：选取MultipleExperimentAnalysis(多项实验成果分析)选项，

点击“0K”,浮现如下对话框，建议选取"Usecommonthreshold”进行分析

进算，然后点击Experiments.」,导入需要一起分析上机文献，点击“Finish”

即可。

4.5.3.14这里选取时要注意：1.两个或者各种实验成果要有相似实验程序；2.每次程序

中循环数应当一致。在分析栏可以选取不同实验不同反映孔进行同步分析。

4.5.3.15分析质控成果：

阴性质控品：EBV(FAM)Ct值=40或“NoCt”.

阳性质控品:EBV(FAM)Ct值＜33,且有较好对数增长曲线。

以上规定需在同一次实验中同步满足，否则本次实验无效，需重新检测。

4.5.3.16记录实验数据。

4.5.3.17取出结束后扩增仪内扩增产物需用一次性手套包好、封口后，丢入医疗废物垃圾

桶内，以防止扩增管破裂而导致污染。

4.5.4Roche480荧光定量PCR仪设立及成果分析

4.5.4.1先打开电脑，再打开荧光定量PCR仪器，然后双击图标“伞”，打开仪器数据库。

4.5.4.2双击图标“7”，启动罗氏480软件。

4.5.4.3在弹出对话框中，输入顾客名和密码，进入软件设立界面。

4.5.4.4在弹出界面中，点击____z〜—poMEH______・"，进入新实验设立界面:

・l.ithtC,clrr7480SoftwarerolaaaeI.b.0

Mrument-VirtualtiqbtCycUf180%SytfemI/NaConn«cl>4DAUbMe:MyComfMH”（T，wbl-）

Wlndwr|N*WfrperianenlSyviemA4mln

JUnPretocelRu«Nos

mi.例口皿

4.5.4.5在“1.”菜单栏里，“厂RWH一子菜单下。

4.5.4.6将“DetectionFormatM选取为Daul或3color探针杂交类型。

4.5.4.7将“ReactionVolumew设立为“50ul”。

4.5.4.8在“Programs”下:通过“⑥”来增长总循环阶段及阶段循环数，并在“变

性-*延伸f退火"循环阶段"AnalysisModev下选取Quantification。

4.5.4.9在“TemperatureTargets"下：通过“⑥I”来增长每个循环阶段里小环

节,并在采集荧光小环节AcquisitionModeM里选取"single”,采集荧光。

4.5.4.10在“三1”菜单栏下，通过“画）◎”增长或者减少实验项目类型，通过右边孔

位选取，设立不同项目区域，然后点击“Apply”保存。

4.5.4.11在“罔”菜单栏下，Step1处，选取“AbsQuant"；Step2处，编辑原则品及

样本。

4.5.4.12原则品设立：在Step2下96孔面板中，选中原则品反映孔，然后选取右侧模板

检测通道,如“483-533”，然后将下方孔位uQuantificationStunpleType"

选取为"Standard"，并在wConcentrationv处输入其浓度即可。

4.5.4.13样本设立：类似于原则品设立，但仅需要编辑其"SampleName”即可。

4.5.4.14返回“三”菜单,在“厂。〃。2―1”子菜单右下角点击

，，:*ERun卜，,运营实验。

4.5.4.15实验结束后，在"臼”菜单下，选取"AbsQucint/FitPointsM,进入成果分

析界面：

〔.r?r/x:•,1^,，T7rm^m:：・

Instrument:NoactiveinstrumentDatabase:MyComputer(Research)等〉

Window:|2O1O.11.27CT-PM2Us«r:SystemAdmin

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尸湍吗3—既能»［您T忖"三

［Analysis］：在此菜单下对阈值线进行调子；

［NoiseBand］：对实验信噪比进行调节；

［FilterComb］：对不同荧光通道进行选取；

［StdCurve］：对定量参照品进行选取，涉及实验中参照品、导入原则品等;

4.5.4.16在上述操作完毕后，点