易错点12双标记基因载体

易错点12双标记基因载体[名师支招]1.双标记基因载体的作用双标记基因载体具有两个标记性状，如四环素抗性和青霉素抗性，在基因表达载体的构建中会破坏其中一个，如破坏四环素抗性，含有目的基因的基因表达载体此时只有青霉素抗性，而空载体依然具有四环素抗性和青霉素抗性，通过在培养基中添加四环素，可以区分出含有目的基因的载体和空载体。2.双标记原理(1)单标记的区分问题：仅有一个标记基因时，含有目的基因的载体和空载体都有标记，在筛选时无法区分。(2)双标记方法：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果目的基因插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图所示，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。筛选方法：将细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组载体的细菌和含空载体的细菌，如图中1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布将上述5个菌落影印到含有四环素的培养基上，如上图，能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图中1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。提醒①标记基因本身也是一个能正常表达的基因，具有自己的启动子和终止子。②受体细胞不同，标记基因的种类也不同；受体细胞为细菌时，标记基因通常是抗生素抗性基因；受体细胞为真核细胞，尤其是动植物细胞时，抗生素很多时候不能杀死未标记的细胞，无法起到筛选的效果，此时标记基因通常选择荧光基因等。[典例赏析]1.(2024·山东青岛期末)研究人员将大麦细胞的LTP1基因导入酵母中，让酵母产生LTP1蛋白。下图为该实验过程的部分流程。下列说法正确的是()A.运用PCR扩增LTP1基因时，应选择图1的A和D作为引物B.为方便构建重组质粒，可在引物5′端添加限制酶的识别序列C.筛选导入重组质粒的啤酒酵母时，只需配制含青霉素的培养基D.为了让大麦的基因在酵母中表达，需要在目的基因两侧添加大麦的启动子和终止子答案B解析DNA复制子链延伸的方向只能从5′端到3′端，也就是DNA聚合酶只能从引物的3′端延伸DNA链，由图可知，构建前利用PCR技术扩增目的基因时，应选取B和C作为引物，A错误；为构建目的基因和质粒连接的重组质粒，往往需要在引物5′端适当增加限制酶识别序列方便切割，B正确；由图可知，构建基因表达载体时，四环素抗性基因被破坏，而青霉素抗性基因没有被破坏，因此将导入C的酵母菌分别在含有青霉素和四环素的两种选择培养基上培养，则在含有青霉素的培养基上能存活，但在含有四环素的培养基上不能存活的才是导入重组质粒的啤酒酵母，C错误；为了让大麦的基因在酵母中表达，需要在目的基因上游添加酵母的启动子，下游添加酵母的终止子，D错误。2.(2024·山东日照模拟预测)工程菌是指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系。下图是利用大肠杆菌生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。(1)质粒上ori序列为复制的起始区域，该区域的碱基中________所占比例较高，图中胰岛素基因以________链作为模板进行转录。(2)为使胰岛素基因能够在大肠杆菌中表达出正确的蛋白质，获取目的基因时通常先________，然后再通过逆转录得到胰岛素基因。(3)设计PCR引物对胰岛素基因进行扩增时，最好在引物的5′端添加限制酶________的识别序列；n次循环后，至少消耗引物________个。(4)β－半乳糖苷酶可以分解无色的X－gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将转化后的大肠杆菌接种到添加了X－gal和________的培养基上，若出现白色菌落，则该菌落即为含有重组质粒的大肠杆菌菌落。答案(1)A和TA(2)提取胰岛B细胞中的mRNA(3)EcoRⅠ和XhoⅠ2(n＋1)－2(4)氨苄青霉素解析(1)A—T碱基对之间有2个氢键，而C—G碱基对之间有3个氢键。氢键的数量影响了DNA双链的稳定性，氢键越多，双链结构越稳定，氢键数少则有利于解旋。因此质粒ori序列的碱基中A和T占比例较高，这有助于DNA复制的启动。由图可知，转录的方向为从左到右，且是从RNA的5′端→3′端，DNA链的－OH端为3′端，故应该以A链为模板进行转录。(3)启动子和终止子之间含有SalⅠ、NheⅠ识别序列，目的基因中也含有其识别序列，若用它们切割，会破坏目的基因，若选择MunⅠ则会破坏质粒上的标记基因，所以为使PCR产物与质粒正确连接，设计引物时可将限制酶EcoRⅠ和XhoⅠ的识别序列添加在对应引物的5′端。每合成一条新链会消耗一个引物，n次循环后一共有2(n＋1)条链，其中有两条母链不需要消耗引物，故n次循环后，至少消耗引物2(n＋1)－2。(4)β－半乳糖苷酶可以分解无色的X－gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色，将胰岛素基因与质粒连接后，重组质粒的lacZ(β－半乳糖苷酶基因)基因被破坏，氨