微生物的培养技术及应用（第2课时）2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

人教版高中生物学选择性必修3《生物技术与工程》第1章第1节

微生物的培养技术及应用（第二课时）1.概述培养基的配制方法和微生物纯培养的基本操作要求，进行酵母菌的纯培养。2.阐明微生物选择培养的原理3.进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数教学目标

情境导入

自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，更难实现，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。该怎么办？如何从自然界中分离出需要的特定微生物？选择培养基1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌(Thermusaquaticus)，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。这种酶目前已被广泛用于体外扩增DNA片段的聚合酶链式反应(PCR)。筛选水生栖热菌的思路是什么样的？耐高温的酶耐高温生物体高温环境（热泉、火山口）寻找寻找寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。筛选原则1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌(Thermusaquaticus)，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。这种酶目前已被广泛用于体外扩增DNA片段的聚合酶链式反应(PCR)。选择培养基允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。①加富性选择培养基在培养基中加入分离对象“嗜好”的营养物质。(投其所好)②抑制性选择培养基在培养基中加入分离对象对能够抵抗的某种抗菌物质。(取其所抗)1.定义2.类型选择培养基3.举例水生栖热菌酵母菌、霉菌等真菌金黄色葡萄球菌能消除石油污染的微生物自养型微生物固氮菌耐酸菌类型条件分离得到的菌种改变培养条件70～80℃的高温pH调至酸性添加某种化学物质加入青霉素高浓度食盐特殊碳、氮源石油是唯一碳源营养缺陷不加碳源不加氮源选择培养基怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。基础培养基选择培养基那么如果让你分离土壤中分解尿素的细菌，你应该怎么设计呢？微生物的选择培养将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。基本操作：（1）梯度稀释；

（2）涂布平板。稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。1.稀释涂布平板法微生物的选择培养2.操作步骤:细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3~8cm的土壤层。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。（1）土壤取样取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。注意微生物的选择培养（2）样品的稀释（梯度稀释菌液）1×101mL1mL1mL1mL1mL1mL1×1021×1031×1041×1051×1061×1079mL无菌水90mL无菌水10g将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。微生物的选择培养（3）涂布平板①取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。②将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。③将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。注意：各梯度分别涂布3个平板（重复实验）1个不涂布作空白对照。微生物的选择培养（4）培养与观察待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37℃的恒温培养箱中培养1～2d，在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。稀释涂布平板法除可以分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。恒温培养箱稀释103倍稀释104倍稀释105倍空白对照微生物的数量测定1.间接计数法——稀释涂布平板法（1）原理：当样品稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中大约含多少活菌。（2）计数原则①一般选择菌落数为30～300的平板计数；②在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。③适当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。微生物的数量测定（3）结果分析①统计的菌落数往往比活菌的实际数目少；

原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。②统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。每克样品中的菌落数＝(C÷V)×MM代表稀释倍数；C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL);（4）计算公式：微生物的数量测定【例4】某同学在稀释倍数为106

的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL)()A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4B【例3】甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？（80+90+100）/30.1×105=9×107个对点训练微生物的数量测定2.直接计数法——显微镜直接计数（1）原理：利用特定的细菌计数板或血细胞计数板在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数，血细胞计数板常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的观察和计数。（2）不足：①统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和，不能区分死菌与活菌（数值偏大）。②需要相对高的细菌浓度。③不适于对运动细菌的计数（3）优点：快速、直观微生物的数量测定血细胞计数板（厚、深）细菌计数板（薄、浅）微生物的数量测定（4）计数方法：每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数注意：统计结果一般是活菌数和死菌数的总和。（“染色排除法”）微生物的数量测定计算公式=80×400×104×稀释倍数A1+A2+A3+A4+A51mL样品中酵母菌数=A1+A2+A3+A4+A580×400÷0.1mm3×稀释倍数A1、A2、A3、A4、A5分别为五个中方格中的酵母菌数。25×16型A1A2A3A4A51mm3=10-3mL微生物的数量测定计算公式=100×400×104×稀释倍数A1+A2+A3+A416×25型A1A2A4A31mL样品中酵母菌数=A1、A2、A3、A4分别为四个中方格中的酵母菌数。A1+A2+A3+A4100×400÷0.1mm3×稀释倍数1mm3=10-3mL微生物的数量测定微生物的计数方法比较内容直接计数法间接计数法主要用具显微镜、细菌计数板或血细胞计数板涂布器计数依据细菌个数培养基上菌落数优点计数方便、操作简单计数的是活菌计算公式每毫升原液含菌株数＝每小格平均菌株数×400×10000×稀释倍数每克样品中的菌株数:(C÷V)×M缺点不能区分死菌与活菌当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落结果比实际值偏大比实际值偏小微生物的数量测定探究·实践

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数1.实验目的2.实验原理绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。3.实验步骤土壤取样制备培养基样品稀释与取样涂布微生物的培养与观察菌落计数（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌。（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。微生物的数量测定取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。土壤取样制培养基样品稀释涂布平板观察培养菌落计数①土壤要求：酸碱度接近中性且潮湿。②取样部位：距地表约3～8cm的土壤层。①制备选择培养基（尿素为唯一氮源）提供无机盐；调节pH②制备牛肉膏蛋白胨培养基葡萄糖10.0g尿素1.0gKH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g琼脂15.0g蒸馏水1000ml4.实验过程土壤取样制培养基样品稀释涂布平板观察培养菌落计数4.实验过程测细菌数：一般用104、105、106稀释液。测放线菌：一般用103、104、105稀释液。测真菌数：一般用102、103、104稀释液。不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。BAC在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？选用稀释范围更大的稀释液进行平板培养微生物的数量测定土壤取样制培养基样品稀释涂布平板观察培养菌落计数4.实验过程选择培养基（平行重复）牛肉膏蛋白胨培养基①每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏蛋白胨培养基微生物的数量测定土壤取样制培养基样品稀释涂布平板观察培养菌落计数4.实验过程判断选择培养基是否具有筛选作用设置两个空白对照以验证培养基中是否含有杂菌②如何验证培养基中是否含有杂菌？不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基涂布的牛肉膏蛋白胨培养基若对照的培养基中无菌落生长，则说明未被杂菌污染。若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目，则说明选择培养基具有筛选作用。微生物的数量测定土壤取样制培养基样品稀释涂布平板观察培养菌落计数4.实验过程①培养：②观察：根据不同微生物的需要，控制适宜的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。a．观察方法：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而遗漏部分菌落。b．记录菌落的特征：包括菌落的形状、大小和颜色等。微生物的数量测定土壤取样制培养基样品稀释涂布平板观察培养菌落计数4.实验过程稀释度104105106107123平均值123平均值123平均值123平均值菌落数/平板当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数，同一稀释度下至少计数3个平板，求出平均值，并根据所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。设计如下表格记录并计数:微生物的数量测定微生物的数量测定5.结果分析与评价无菌落生长有菌落生长大于30-300得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？不一定，还需要进一步的鉴定微生物的数量测定6.进一步探究在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→酚红变红→脲酶阳性①液体培养基可以直接看液体的变色情况；②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。土壤中分解尿素的细菌的鉴定CO（NH2）2+H2O