《鹅星状病毒病诊断与防控技术规范》地方标准草案

ICS11.220

CCSB41

□B51

地方标准

DBXX/TXXXX-XXXX

鹅星状病毒病诊断与防控技术规范

Technicalspecificationfordiagnosisandcontrolofgooseastrovirusdisease

（征求意见稿）

在提交反馈意见时，请将您知道的相关专利连同支持性文件一并附上。

XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施

四川省市场监督管理局发布

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目次

前言........................................................................................II

1范围.......................................................................................1

2规范性引用文件............................................................................1

3术语和定义................................................................................1

4临床诊断..................................................................................1

4.1流行病学..............................................................................I

4.2临床症状..............................................................................1

4.3剖检病变..............................................................................2

4.4临床诊断结果判定.....................................................................2

£实验室诊断................................................................................2

5.1样本采集与处理.......................................................................1

5.2样本分子检测..........................................................................1

5.3病毒分离鉴定..........................................................................1

5.4实验室诊断结果判定...................................................................1

6防控措施..................................................................................3

6.1隔离..................................................................................3

6.2消毒..................................................................................3

6.3种鹅疫苗免疫.........................................................................3

6.4箱鹅特异性抗体治疗....................................................................3

7无害化处理................................................................................4

附录A（规范性）鹅星状病毒RT-PCR检测方法及结果判定.......................................5

A.1引物（10umol/L）....................................................................6

A.2鹅星状病毒RT-PCR检测方法及结果判定................................................3

附录B（规范性）鹅星状病毒荧光定量RT-PCR..................................................3

B.1引物（10umol/L）...................................................................6

B.2鹅星状病毒荧光定量PCR检测方法及结果判定..........................................6

附录C（规范性）鹅星状病毒分离.............................................................4

C.1材料..................................................................................4

C.2分离方法..............................................................................4

I

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C.3分离结果判定..........................................................................4

附录D（规范性）鹅星状病毒抗体间接ELISA.....................................................4

D.1材料...................................................................................4

D.2鹅星状病毒抗体间接ELISA检测方法及结果判定..........................................5

II

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-i-i~—i—

刖百

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》规定起草。

本文件由四川省农业农村厅提出、归口并解释。

本文件由四川省市场监督管理局批准发布。

本文件起草单位：西南氏族大学

本文件主要起草人：张焕容、杨发龙、张凯、陈果。

III

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鹅星状病毒病诊断与防控技术规范

1范围

本文件规定/鹅星状病毒病临床疑似病例的判断、分子诊断、病毒分离鉴定等诊断依据，疫苗免疫、

病毒抗体间接ELISA检测和特异性抗体治疗、无害化处理等防控技术规范。

本文件适用于鹅星状病毒病的诊断、疫情处理、预防与控制。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注口期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本

文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T541-2016兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范

病死及病害动物无害化处理技术规范(农医发(2017)25号)

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1鹅星状病毒病

该病是由鹅星状病毒(gooseastrovirus,GoAstV)感染雏鹅引发的一种病毒性传染病。该病毒主要

感染25日龄以内的雏鹅，病鹅主要表现为跛行、羽毛稀疏、全身多组织器官广泛性尿酸盐沉积。该病为

2015年以来鹅新发的疫病。

4临床诊断

41流行病学

病鹅、隐性带毒鹅、带毒种蛋是主要传染源，自然感染潜伏期3d,既可垂直传播，也可水平传

播。各品种鹅均易感，最早可在3日龄发病。死亡率30%~40%,最高可达50%。

47临床症状

病鹅精神沉郁，食欲减退或废绝，饮水量增加，消瘦，翅下垂，双腿瘫痪倒地，排白色稀便，泄殖

腔周围稀便污染。

45剖检病变

病死鹅心、肝、脾、肺、肾、胃肠道等器官表面，各关节周围及关节腔内，甚至血管周围，均可见

白色尿酸盐沉枳。

1

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d4临床诊断结果判定

符合4.1流行病学特征，病鹅出现4.2临床症状和4.3剖检病变，可判定为鹅星状病毒病疑似病例，

应进一步进行实验室诊断。

5实验室诊断

实验室生物安全婴求按照GB19489执行。

5.1样本采集与处理

按照NY/T541-2016小量采集病鹅泄殖腔棉拭子5g~IOg,濒死鹅剖检取肝、脾、仔等实质器官

5g-10g,置.RNA保存液，・20℃及以下保存，临床样本运输不超过48h,立即按附录A提取RNA并反转

录合成cDNA。无菌操作大量采集典型病变组织器官作为病毒分离的样本，-20C及以下保存。

5.2样本分子检测

以5.1的cDNA为模板，采用附录B鹅星状病毒普通PCR或附录C荧光定量PCR方法检测。

5.3病毒分离培养

5.3.1病毒分离样本的处理

取10~20g在5.2中检测为阳性的病死鹅肝、脾、肾等组织样本并剪碎，与无菌生理盐水按1:5(WN)

比例混合并磨碎,反复冻融三次，8000rmin-\4C离心井min后取上清，0.22滤膜过滤除菌后备

用。

5.3.2细胞分离病毒

5.3.2.1LMH细胞准备

吸弃细胞培养液，用含1%双抗的PBS润洗3次。加入0.25%胰蛋白的消化细胞”2min。吸弃消化液，

加入5mL含0.25%胰酶的DMEM/F12细胞培养液，轻轻吹打至25n?细胞瓶壁细胞全部脱落。消化后分散

I*勺细胞在5%CO2培养箱中37,C培养24h〜36h,当细胞密度达到80%时，用于分离病毒。

53.2.2病毒分离培养

吸弃旧的培养液，用无菌PBS洗涤细胞3次后，将531处理好的样品1n】L接种到25m2细胞版的单

层细胞上，在CO2培养箱中37℃感作培养lh后弃去接种液，添加细胞维持培养液，在CO2培养箱继续

培养。连续培养5d,每天观察细胞状态：待细胞液变黄，-80C反复冻融3次，经5000rpm离心10

min,取上清，用5.2方法进行检测，上清置-80C保存。

5.33鹅胚分离病毒

5.3.3.1鹅胚准备

将非免疫鹅胚置于孵化器中37c下孵育至11〜13日龄，用于病再分离。

5.33.2鹅胚接种

2

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取5.3.1中病毒液0.5mL接种鹅胚尿囊腔，同时设生理盐水接种对照胚，置于孵化器中37c下孵育。

弃去24h内死亡鹅胚，其余鹅胚死亡后及时收获肌体和尿囊液。未死亡鹅胚观察5d后，于4℃冰箱过夜

后收获胚体和尿囊液，用5.2方法进行检测，尿囊液置-80C保存。

5.4实验室诊断结果判定

临床样本分子检测阳性，或LMH细胞或鹅胚分离的病毒经分子检测阳性，均判定为实验室诊断阳性。

6诊断结果判定

6.1可疑临床症状和剖检病变与4.2和4.3相符者，判定为可疑，进一步做实验室诊断。

6.2确诊临床样本分子检测阳性者，或病毒分离时见死胚绒毛尿囊膜增厚、尿酸盐沉积，或胚体尿酸

盐沉积，或剖检胚体见各组织器官尿酸盐沉积，且病料接种细胞的培养物和鹅胚尿囊液样本分子检测阳

性，判定为确诊。

6鹅星状病毒感染综合判定

根据临床诊断和实验室诊断的判定结果，可对鹅星状病毒感染进行综合判定。

e.1若病鹅与4.2和4.3中所描述相符，且临床样本分子检测阳性，或LMH细胞或鹅胚分离的病毒经

分子检测阳性，则可判定为鹅星状病毒感染。

62若病鹅与4.2和4.3中所描述部分相符，但临床样本分子检测阳性，或LMH细胞或鹅胚分离的病

毒经分子检测阳性，则可判定为鹅星状病毒感染。

7防控措施

7.1隔离

发现疑似疫情，立即隔离患病鹅。

7.2消毒

对病鹅污染的场所、用具、物品等彻底消毒。对鹅舍地面和粪尿沟槽清洁后消毒。可采用3~5%来

苏尔溶液喷器消毒，20%生石灰粉涂墙和地面消毒。饲养用具料槽和水槽等5〜10%的热碱水或3%的苛

性钠溶液或3〜5%来苏尔洗涤消毒，消毒后2h~6h,用清水洗净料槽和水槽，待干燥后方可使用。运动

场地清除粪便和杂草后，用5~10%的热碱水或者撒上生石灰消毒。

7.3加强饲养管理

避免饲料发寄和变质，饲料应便于消化，做到蛋白质、维生素和矿物质等的科学搭配。鹅舍环境卫

生，确保通风良好.

7.4种鹅疫苗免疫

灭活疫苗于种鹅开产前每隔2周免疫一次，共免疫2~3次，用附录D的抗体检测方法检测种鹅抗

体水平，确保种鹅生产期内维持高水平抗体。

7.5雏鹅特异性抗体治疗采用高免卵黄抗体对发病初期的雏鹅进行特异性治疗。

3

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8无害化处理

病鹅按照农业部关于“病死及病害动物无害化处理技术规范(农医发(2017)25号)”进行无害

化处理。

4

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附录A

（规范性）

核酸提取及反转录

A.1核酸提取

a）取300HL样本处理液置于1.5mL去酶EP管中，加入7（）（）pLTrizol,剧烈混合15s,冰上静置

10min,加入200RL氯仿，剧烈混合15s,冰上静置10min,4℃12000rpm离心15min；

b）取500nL上清液至新管，加入500ML异丙醇，上下颠倒混勾10次，冰上静置10min,4*C12000

rpm离心15min：

c）弃上清，加入1n1L75%DEPC冰乙想洗涤一次，4℃12000rpm离心10min；

d）尽量吸除上清,室温干燥5Tomin,用20pLDEPCK?^,-80oC保存。

A.2反转录

反转录试剂购置成都南蓉为基因生物科技有限公司。

按照下表所示体系（20gL）,25,C10min,55℃15min,85c5min,将RNA反转录成cDNA。

试剂用量

RNA模板7|4L

DEPC-trcatcdWater6pL

5xReactionMix*44pL

SupremeEnzymeMix3pL

附录B

(规范性)

鹅星状病毒普通PCR

E.1引物(lOgmol/L)

GAstV-F:5'-AAGCCTCTTTTCTGGCGGATAC-3'

GAstV-R:5-GACACAAGCCTATCATCGCCATAG-3,

E.2鹅星状病毒普通PCR检测方法及结果判定

E.2.1反应体系及条件

反应体系（30pL）：2xTaq的15pL,上、下游引物各1吐，cDNA模板3pL,ddH2O10pLo反

应条件：94c预变性5min；94c变性30s、62c退火30s、72c延伸45s,35个循环：72℃延伸

10min,反应结束。

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E.2.2结果判定

阳性对照出现329bp特异性扩增条带，而阴性对照无条带，判定鹅星状病毒普通PCR检测结果有效。

阴性对照和阳性对照结果要求在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。

在阴阳性结果有效的前提下，待检样品出现329bp的扩增条带，则判定待检样品为鹅星状病毒阳性。

若样品无条带，则为鹅星状病毒阴性。

附录C

(规范性)

鹅星状病毒荧光定量PCR检测

A.1引物(lOpmoVL)

GAs(V-qPCR-F:5'-TGAAGCAACAGACAGAACGG-3'

GAstV-qPCR-R:5-GGACAGGAAAAAGTAACGCA-3'

A.2鹅星状病毒荧光定量PCR检测方法及结果判定

卜2.1反应体系及条件

反应体系为(25gL)：2xFastSYBRGreenqPCRMasterMixUDG10gL,上、下游引物各0.4pL,

模板1PL,加入dd&O补足至25回。最佳反应条件：95c变性5s、60C退火30s,共40个循环。

熔解曲线：95c15s、60C60s、95℃15s。

C.2.2结果判定

C.2.2.1阈值设定

检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值直接读取检测结果，Ct值为每个反应管的荧光信号达到设

定的阈值时所经历的循环数。阈值设定原则是根据仪器噪音情况进行调整，以阈值线刚好超过正常院性

样品扩增曲线的最高点为准。

C.2.2.2质控标准

阴性对照无Ct值，且无典型扩增曲线：或阴性对照Ct值＞35.0,出现扩增曲线，但熔解曲线于80c左

右未出现明显的峰值。

阳性对照Cr值＜30.0,并出现典型的扩增曲线，熔解曲线于80℃左右