孙克刚注射剂新法规解析及应对方案系列培训班专家讲座

注射制剂无菌确保工艺技术要求一、序言二、注射剂基本技术要求三、无菌确保工艺研究与验证要求四、无菌药品生产关键工艺法规要求(以最终湿热灭菌药品工艺为例)1第1页一、前言2第2页

1970年~1975年，美国因输液污染所造成并发败血症事件有400多起，这在美国国内引发强烈反响。FDA从1975年开始进行了深入、广泛调查，发觉这些事件并不是出于企业违规生产，而是整个生产体系中不稳定原因所致。今后，FDA于1976年首次将验证列入GMP。认可在无确保系统中，过程控制优于结果检验。3第3页30多年过去了，注射剂染菌所致药难事件降临我国，“欣弗”事件使得无菌制剂无菌保障问题成为公众关注焦点。

--------无菌检验不足--------研究无菌确保路径4第4页面临主要问题剂型选择不合理无菌确保工艺选择不合理无菌确保工艺研究不全方面无菌确保工艺缺乏必要验证GMP与发达国家要求还存在差距5第5页《整理和规范药品研制、生产、流通秩序工作方案》（国食药监办〔〕465号）要求:严格审评审批化学药品注射剂、中药注射剂和多组分生化注射剂等安全性风险较大3类品种。6第6页二、注射剂基本技术要求7第7页

审评审批要求:一、国家局已受理但还未同意注册化学药品注射剂和多组分生化药注射剂应参考《技术要求》进行研究。二、已经同意注册化学药品注射剂和多组分生化药注射剂也应参考《技术要求》进行相关研究，并在申报再注册时提供相关研究资料。三、对已上市化学药品注射剂、多组分生化药注射剂进行仿制、改变剂型或者改变给药路径研究时，研究者应该慎重考虑已上市品种研究基础。8第8页以化学药品注射剂为例:一、化学药品注射剂剂型选择必要性、合理性二、化学药品注射剂规格合理性、必要性三、化学药品注射剂原、辅料质量控制及起源四、化学药品注射剂处方及制备工艺合理性、可行性研究，尤其是灭菌工艺选择及验证研究、工艺稳定性研究等9第9页五、化学药品注射剂质量研究及质量标准制订

六、化学药品注射剂稳定性研究

七、化学药品注射剂非临床安全性评价技术要求

八、化学药品注射剂临床研究技术要求

九、仿制化学药品注射剂技术要求

十、化学药品注射剂说明书和标签内容技术要求

10第10页本讲座主要探讨无菌确保工艺研究及评价包含：制备工艺选择工艺参数确实定工艺验证注射剂灭菌工艺及其验证11第11页三、无菌确保工

艺研究与验证要求12第12页最终灭菌产品无菌确保水平要求为:微生物污染概率不超出百万分之一采取无菌生产工艺产品:其无菌确保水平为微生物污染概率不超过千分之一

13第13页与产品无菌确保相关影响原因环境厂房、设备原材料（原辅料、包装材料）无菌确保工艺生产过程控制人员卫生14第14页灭菌方法选择按欧盟1999年8月正式开始执行灭菌方法选择决议树决议树作用是在考虑各种复杂原因情况下辅助选择最正确灭菌方法凡是能够最终灭菌产品务必要最终灭菌15第15页16第16页17第17页决议树越往下，风险越大需要提供必要证据越多18第18页基本标准:无菌产品应在灌装到最终容器后进行最终灭菌（首选）如因产品对热不稳定不能进行最终灭菌时，可采取最终灭菌方法替换方法----过滤除菌和/或无菌生产工艺（退而求其次）19第19页同时明确以下要求：无菌药品生产企业，首先应依据特定处方选择最正确灭菌方法，然后再选择包装材料使用热不稳定包装材料不能作为选择无菌生产工艺理由因其它原因选择包装容器不能进行最终灭菌，药品生产企业仍有责任不停寻找可接收替换容器，使得产品能够在可接收时间范围内采取最终灭菌方法任何商业考虑均不能作为不使用含有最高无菌确保水平最终灭菌方法理由20第20页惯用灭菌方式及其无菌确保水平1、过分杀灭法微生物残余概率＜10-62、残余概率法微生物残余概率＜10-63、无菌生产工艺无菌确保普通只能到达10-3水平21第21页最终灭菌工艺验证要求最终灭菌工艺：过分杀灭法（Fo≥12）残余概率法（8≤Fo＜12）目标：灭菌后微生物残余概率＜10-622第22页过分杀灭设计方法：一个灭菌设计方法，只需要最少关于产品生物负载信息。最差条件生物负载猜测用来确定所产生杀灭力需要取得灭菌物上PNSU为10-6。在使用这个方法时，确效计划必须证实FBIO和FPHY都大于12分钟。23第23页残余概率法：一个灭菌设计方法，当所产生杀灭力需要到达PNSU为10-6时，以（灭菌物品上或内）生物负载特征和产品对热敏感度为基础。应产品而定设计方法24第24页工艺验证要求：过分杀灭法和残余概率法均应进行工艺验证验证内容：空载热分布满载热分布热穿透试验微生物挑战试验（残余概率法）灭菌前微生物污染水平---数量和耐热性---过程控制25第25页热力灭菌动力学原理微生物耐热参数——（D值）温度系数——Z值FT值——T℃灭菌时间F0值——标准灭菌时间无菌确保值（SAL）灭菌率L26第26页对数规则：Arrhenius质量作用定律湿热灭菌对数规则始于1921年Bigeow发表论文---用对数规则阐述灭菌工艺过程，他认为，灭菌过程能够用阿伦尼乌斯一级反应式来描述。依据质量作用定律，在恒定温度及保持其它条件不变情况下，单位时间内被杀灭微生物数正比于t0时原有数目，即：dN/dt＝K(N0－Nk)式中：N0为t＝0时，存活微生物数；Nk为t时被杀灭微生物数；N为t时存活微生物数。由此得出，灭菌时微生物死亡遵照对数规则。27第27页微生物存活数与灭菌时间关系图

半对数座标Y轴：微生物取对数X轴：时间为10进制普通座标Y轴及X轴均为普通座标tlgN102030123tN10203012328第28页微生物灭活曲线红色为理想状态：直线自然界存在芽孢可能为A、B、C生物指示剂测试线性很好LgNtABC生物指示剂29第29页微生物耐热参数（D值）:D值是指在特定灭菌条件下，使微生物数量下降一个对数单位或杀灭90%所需要时间（分钟）。30第30页D-值：在基本温度时使微生物数量下降一个对数值（或90%）所需时间31第31页灭菌温度系数（Z值）:Z值系指使某一个微生物D值改变一个对数单位，灭菌温度应升高或下降度数.在没有特定要求时:湿热灭菌条件下Z值通常取10℃；干热灭菌条件下Z值通常取20℃；干热去热原时Z值通常取54℃。32第32页33第33页

FT值——T(℃):灭菌时间FT值指T(℃)灭菌值，系指一个给定Z值下，灭菌程序在温度T(℃)下等效灭菌时间。FT＝DT×ΔlgN式中:DT为在T(℃)下微生物D值；ΔlgN为T(℃)下灭菌程序使微生物数下降对数单位数。34第34页F0值:标准灭菌时间（用于湿热灭菌），系灭菌过程赋予待灭菌物品在121℃下等效灭菌时间（分钟）。FH值:标准灭菌时间（用于干热灭菌），系灭菌过程赋予待灭菌物品在170℃下等效灭菌时间（分钟）。35第35页灭菌率L：L指在某一温度T(℃)下灭菌lmin所取得标准灭菌时间。L=10(Ti-TR)/Z

Ti——灭菌温度TR——标准参考温度Z——微生物死亡率常数36第36页37第37页时间温度致死率湿热灭菌致死率38第38页无菌生产工艺验证要求无菌生产工艺：过滤除菌＋无菌生产工艺无菌组装工艺39第39页工艺验证要求：---培养基模拟灌装试验对生产系统验证---除菌过滤系统适应性试验包含过滤系统相容性测试、过滤前后滤膜完整性测试、滤膜微生物截留量测试40第40页微生物挑战试验41第41页微生物挑战试验

生物指示剂--简称为BI（biologicalindicator）:是对特定灭菌工艺含有一定耐受性而且能够定量测定灭菌效力微生物制剂，适合用于制备生物指示剂微生物多为芽胞类细菌，这是因为，除辐射灭菌外，芽胞类细菌比常规生长态微生物对灭菌工艺含有更强耐受性。生物指示剂既可用来测定一个给定灭菌工艺条件灭菌效果，也可判别它是否符合无菌确保要求。42第42页微生物挑战试验

所谓湿热灭菌工艺生物指示剂微生物挑战试验，系指将一定量已知D值耐热孢子接入被灭菌产品中，在设定湿热灭菌条件下灭菌，以验证设定灭菌工艺是否确实能赋予产品所需SAL为10－6而进行试验及评价过程。43第43页微生物挑战试验

USP和BP对这方面有专门叙述。普通说来，对生物指示剂选择标准性要求是：——孢子（菌株）稳定——耐热性强于被灭菌物品中常见污染菌——系非致病菌——易于培养，孢子萌发率要在90%以上——使用期长——保留及使用方便——安全性好44第44页微生物挑战试验

湿热灭菌工艺验证用生物指示剂起源主要有两类:一类是采取标准生物指示剂，这类生物指示剂可从市场购置；另一类需用从日常生产污染菌监控分离出最耐热微生物孢子制备，并测得相关参数（最正确生长条件、耐热性等）后方可使用。45第45页菌种名称常规D121℃值/min嗜热脂肪芽胞杆菌Bacillusstereathernophilus1.5～3.0枯草芽胞杆菌BacillussubtilisATCC52300.3～0.7凝结芽胞杆菌Bacilluscoagulans0.4～0.8梭状芽胞杆菌Clostridiumsporogenes0.4～0.8湿热灭菌工艺验证中惯用生物指示剂46第46页例:国产非治病性嗜热肪芽胞菌芽胞（ATCC7953）D值-------------D121值1.74存活时间------121oC饱和蒸汽下,存活时间不少于3.9分钟死亡时间------121oC饱和蒸汽下,死亡时间不少于19分钟孢子量----------5×105-6cfu/支47第47页使用方法:将生物指示剂和被灭菌物品一起放置在灭菌柜（锅）内，上、中层、中央和排气口（冷点处）灭菌后取出，然后直接置于56–60oC培养24–48小时，并另取一支未经灭菌生物指示剂一起培养，作为阳性对照。结果判断:依据颜色判断灭菌效果，培养后全部保持紫色灭菌合格。若由紫色变为黄色判为灭菌不合格。对照管应紫变黄色为该指示剂有效。48第48页例:进口3MTMATTESTTM(1262)蒸汽灭菌生物培养指示剂(嗜热脂肪杆菌芽胞菌片)在121℃饱和蒸汽条件下，存活时间大于或等于5分钟，杀灭时间小于或等于15分钟。灭菌完成，取出生物指示剂后最少冷却10分钟以上，方可挤破生物指示剂内安瓿。不然有可能造成安瓿碎片伤人。只有对照管为阳性，其生物结果才算有效。49第49页使用方法1、将压力蒸汽灭菌生物培养指示剂放于一标准测试包中；2、按照国家规范，分别将测试包放于锅内不一样位置；3、灭菌完成，取出生物指示剂；4、挤破内含安瓿，与一支对照管一起放于56℃培养锅培养；5、48小时后，阅读结果。50第50页微生物挑战试验挑战试验合格标准生物指示剂选取应组成挑战性必要条件：可用药典，如USP<1035>中要求生物指示剂；对存活概率灭菌程序产品而言，应该强调，所用生物指示剂耐热性应大于产品中常见污染菌耐热性，生物指示剂用量也应大于产品中该污染菌水平。经生物指示剂验证后，应能证实在设定F0条件下，产品无菌确保水平低于10-6。51第51页微生物挑战试验方案制订制订验证方案时，应该综合考虑相关法规要求、灭菌热分布及热穿透试验数据、产品热稳定性、日常生产监控中所取得灭菌前产品中微生物污染水平和污染菌耐热性数据。方案还包含验证统计各种表格。52第52页微生物挑战试验湿热灭菌程序通常分为两类：过分杀灭程序（OverkillDesignApproach）

残余概率程序（Product-SpecificDesignApproach）53第53页微生物挑战试验挑战试验(生物指示剂验证试验):生物指示剂装载灭菌检验和培养结果评价验证试验频率

54第54页微生物挑战试验

作为一项生物挑战性试验，尽管生物指示剂验证不能替换物理验证，但它能如实反应灭菌工艺条件对微生物杀灭效果，从而证实该灭菌工艺所赋予相关产品无菌确保水平是否符合要求。生产指示剂在试验中饰演了各种可能原因造成产品中“污染菌”角色，以这种方式进行验证更切合实际，更能说明所设定灭菌程序是否安全。55第55页微生物挑战试验

对热稳定性很好产品而言，通常采取过分杀灭程序，该程序能赋予产品足够大安全系数，使在121℃下D值约为1.0min细菌孢子最少下降12个对数单位。在过分杀灭程序二分之一时间时，可使该孢子最少下降6个对数单位。因为杀灭微生物孢子（生物指示剂）灭菌条件极为苛刻，所以，从灭菌程序标准灭菌时间F0来看，毋须担心产品灭菌后无菌确保问题。56第56页微生物挑战试验

并不是全部灭菌程序都可进行生物指示剂验证。有些产品热稳定性相当差，灭菌温度仅能控制在100℃左右，整个灭菌程序F0值还不到1min，对这类程序进行生物指示剂验证就没有太多意义。这类产品无菌确保水平主要是经过无菌生产工艺来实现，灭菌仅能作为提升产品无菌确保水平伎俩。57第57页微生物挑战试验

WHOGMP中强调，化学或生物指示剂可用于灭菌过程监控，但不得代替物理监控（温度、时间）。FDA均认为生物指示剂验证并不能取代物理验证，这是由生物指示剂验证复杂性所决定。58第58页容器密封性试验59第59页容器密封性试验FDA----GMP211.94（药品容器和密封材料）要求，药品容器和密封材料应是清洁，按药品性质指示进行灭菌和去热原。标准及检测方法、清洁方法、去热原及灭菌方法应形成书面文件，并遵照执行。EU----应采取经验证适当方法完成产品密封。(无菌产品最终处理)60第60页容器密封性试验

在对产品包装进行评定测试早期，常采取物理和微生物学检测伎俩。物理检测有许多优点，如灵敏度较高、使用方便、检测快速及低成本等。在产品使用期内，均可使用物理检测方法来确定包装完整性是否符合要求要求。进行包装完整性检测一个主要原因在于，确保无菌产品一直保持无菌状态。所以，在产品包装研发阶段，应考虑采取微生物侵入试验，或采取经验证过而且比微生物检测更为有效物理试验方法，来检测产品包装完整性。不过，对于效期内成品稳定性试验来说，因进行微生物侵入试验较为困难，故提议采取物理检测方法。61第61页容器密封性试验

微生物侵入试验是对最终灭菌容器／密封件系统完好性挑战性试验。在验证试验中，取输液瓶或西林瓶(小瓶)，灌装入培养基，在正常生产线上压塞、压盖灭菌。今后，将容器密封面浸入高浓度运动性菌液中，取出、培养并检验是否有微生物侵入，确认容器密封系统完好性。此同时，需作阳性对照试验，确认培养基促菌生长能力。62第62页过滤系统验证63第63页过滤系统验证法规要求FDAAsepticProcessingGuidelinesFDA无菌工艺指南:与过滤器完整性相关性能测试应包含：模拟生产条件，在最苛刻生产环境下进行微生物挑战试验。EUGMP欧盟GMP无菌药品附录全部除菌工艺必须进行验证64第64页PIC/S无菌工艺验证(年7月)9.5.1不论使用什么样过滤器或过滤器组合,验证都应包含微生物挑战试验,模拟“最差情况”生产条件.用于挑战试验微生物(如缺点假单胞菌)选择必须证实适当.产品性质可能影响过滤器,所以验证应在有产品时候进行.假如产品含有细菌抑制作用或杀菌性,应使用产品替换品进行试验,该替换介质不含产品有效成份.能够将类似产品归类,然后只对其中一个产品做试验.过滤器完整性试验程度应来自过滤器验证数据.过滤器生产商也应评定过滤器前后允许最大压差,这应对照批统计做检验确保在无菌过滤期间没有超出这个数值.9.5.2除了过滤器类型验证,每个日常生产中使用单个产品过滤器完整性也应在使用前后分别做试验.65第65页过滤器验证证实及过滤器生产工艺完整测试标准–起泡点及扩散流最大操作温度最大操作压力能够最多灭菌次数－次数，温度，时间确保其过滤器符正当规要求无纤维脱落溶出物评定66第66页滤器选择与特征表现滤器类型滤器组能粒子脱落可抽取物化学配伍性吸附作用热压迫阻抗性水力压迫阻抗性毒性试验物理完整性试验67第67页完整性试验完整性试验理论完整性试验结果与细菌滞留关系制品-湿润完整性试验VS水-湿润完整性试验制品-湿润起泡点（比值）制品-湿润起泡点（统计方法）制品-湿润扩散性流动/前推流动试验规格使用自动化完整性试验仪执行不需下游端操作上游端试验一个减菌级滤器何时必须执行完整性试验失败分析/寻找并处理问题68第68页69第69页非破坏性物理完整性试验起泡点试验扩散性流体/前推流体压力保持/消退试验自动化完整性试验仪器压力保持/消退与扩散流体/前推流体之间关联性70第70页滤孔大小估测毒性与滤器可抽取物试验对计算之制品-湿润起泡点之统计调整71第71页四、无菌药品生

产关键工艺法规要求72第72页无菌药品生产标准为降低微生物、微粒和热原污染风险，无菌药品生产应有各种特殊要求。这在很大程度上取决于生产人员技能、所接收培训及其工作态度。质量确保极为主要，无菌药品生产必须严格按照精心制订并经验证方法及规程进行。产品无菌或其它质量特征绝不能仅依赖于任何形式最终操作或成品检验。73第73页注射剂无菌确保要求人员厂房设施、设备