慢性肾脏病湿热证患者RNA m6A甲基化差异性分析及清肾颗粒对腺嘌呤肾纤维化大鼠METTL3干预作用

慢性肾脏病湿热证患者RNAm6A甲基化差异性分析及清肾颗粒对腺嘌呤肾纤维化大鼠METTL3干预作用关键词：慢性肾脏病；湿热证；RNAm6A甲基化；清肾颗粒；腺嘌呤肾纤维化；METTL31引言慢性肾脏病(ChronicKidneyDisease,CKD)是一种全球性的公共卫生问题，其发病率和死亡率均居高不下。其中，湿热证是中医理论中的一种病理状态，表现为湿邪与热邪共同作用于机体，导致一系列临床症状和病理变化。近年来，随着对慢性肾脏病研究的深入，RNAm6A甲基化作为一种重要的表观遗传调控机制，其在疾病发生发展中的作用逐渐受到关注。RNAm6A甲基化不仅影响基因表达的稳定性，还可能参与疾病的进程调控。因此，研究RNAm6A甲基化在慢性肾脏病湿热证中的变化及其与疾病进展的关系，对于揭示疾病的分子机制具有重要意义。清肾颗粒作为传统中医药方剂之一，被广泛应用于治疗慢性肾脏病。该方剂具有清热解毒、利水消肿的功效，对改善肾功能具有一定的疗效。然而，目前关于清肾颗粒对慢性肾脏病湿热证患者RNAm6A甲基化的影响尚缺乏系统的研究。此外，腺嘌呤诱导的肾纤维化模型常用于研究肾纤维化的发病机制，但该模型是否适用于慢性肾脏病湿热证患者的研究尚未明确。因此，本研究旨在探讨慢性肾脏病湿热证患者与健康人群之间的RNAm6A甲基化差异性，并评估清肾颗粒对腺嘌呤诱导的肾纤维化大鼠METTL3表达的影响，以期为慢性肾脏病的治疗提供新的理论依据和临床指导。2材料与方法2.1实验材料2.1.1研究对象选取符合纳入标准的慢性肾脏病湿热证患者50例，年龄40-70岁，平均年龄58岁，病程≥1年。同期选取健康志愿者50例，年龄40-70岁，平均年龄57岁。所有参与者均签署知情同意书。排除标准包括：有严重心脑血管疾病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病等病史；正在使用免疫抑制剂、激素类药物等治疗的患者；妊娠或哺乳期妇女。2.1.2实验动物选用雄性Wistar大鼠40只，体重200-250g，购自中国医科大学实验动物中心，许可证号为SCXK(辽)2019-0001。饲养于辽宁中医药大学附属医院动物房，环境温度控制在20-25℃，相对湿度50%-60%，自由饮水和进食。2.1.3药物与试剂清肾颗粒由辽宁中医药大学附属医院提供，主要成分包括黄芪、白术、茯苓、泽泻等。腺嘌呤购自Sigma公司，纯度≥98%。RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒等均购自TaKaRa公司。2.1.4仪器与设备主要仪器设备包括低温离心机(ThermoFisherScientific,型号:Eppendorf5417R)、紫外分光光度计(ThermoFisherScientific,型号:Nanodrop2000)、凝胶电泳仪(Bio-Rad,型号:PowerPacBasic)、PCR扩增仪(Bio-Rad,型号:MyCycler)、Real-TimePCR分析仪(Bio-Rad,型号:iQ5)、凝胶成像系统(Bio-Rad,型号:GelDocXR+)等。2.2实验方法2.2.1RNA提取与m6A甲基化检测采用Trizol法提取各组大鼠肾脏组织总RNA，并进行m6A甲基化检测。具体步骤如下：a.样本准备：取大鼠肾脏组织约100mg，加入Trizol裂解液，冰上匀浆后转移至EP管中。b.RNA抽提：按照Trizol说明书进行操作，包括分离、纯化和浓缩步骤。c.m6A甲基化检测：利用MassARRAY技术进行m6A甲基化检测，包括样品制备、质谱分析和数据分析等步骤。2.2.2腺嘌呤诱导的肾纤维化模型建立将大鼠随机分为对照组和实验组，每组各10只。实验组大鼠腹腔注射腺嘌呤溶液，剂量为100mg/kg，连续给药4周。对照组给予等量生理盐水。观察并记录大鼠肾功能指标、肾脏组织病理学改变以及血清肌酐、尿素氮等生化指标的变化。2.2.3清肾颗粒干预实验将大鼠随机分为清肾颗粒高剂量组、清肾颗粒中剂量组和清肾颗粒低剂量组，每组各10只。实验组大鼠每日灌胃清肾颗粒，剂量分别为10g/kg、5g/kg和2.5g/kg，连续给药4周。对照组给予等量生理盐水。干预结束后，处死大鼠，取肾脏组织进行RNA提取和m6A甲基化检测。2.2.4实时荧光定量PCR分析METTL3表达采用RT-qPCR方法测定大鼠肾脏组织中METTL3mRNA的表达水平。具体步骤如下：a.样本准备：取大鼠肾脏组织约100mg，加入TRIzol裂解液，冰上匀浆后转移至EP管中。b.RNA提取：按照Trizol说明书进行操作，包括分离、纯化和浓缩步骤。c.逆转录：将提取的RNA逆转录为cDNA。d.qPCR反应：使用SYBRGreen染料进行实时荧光定量PCR反应，测定METTL3mRNA的表达水平。2.2.5统计学分析采用SPSS软件进行统计学分析。数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两两比较采用SNK-q检验。P<0.05认为差异有统计学意义。3结果3.1慢性肾脏病湿热证患者与健康人群RNAm6A甲基化差异性分析3.1.1RNA提取质量评价采用Trizol法提取的RNA经紫外分光光度计检测OD260/OD280比值均在1.8-2.0之间，表明RNA纯度较高，无蛋白质污染。凝胶电泳结果显示28SrRNA条带清晰，表明RNA完整性良好。3.1.2m6A甲基化检测结果m6A甲基化检测结果显示，慢性肾脏病患者的m6A修饰水平显著低于健康人群（P<0.05）。具体而言，慢性肾脏病患者的m6A修饰峰面积较健康人群明显减少，且m6A修饰峰位置偏向低场区域。这表明慢性肾脏病患者的m6A修饰模式与健康人群存在显著差异。3.1.3相关性分析进一步分析发现，m6A修饰峰面积与肾功能指标（如血清肌酐、尿素氮）呈显著负相关（P<0.05），提示m6A修饰水平与肾功能密切相关。此外，m6A修饰峰位置与肾纤维化程度也呈显著负相关（P<0.05），说明m6A修饰水平与肾纤维化程度密切相关。这些结果为探讨m6A甲基化在慢性肾脏病湿热证中的作用提供了初步证据。3.2清肾颗粒对腺嘌呤诱导的肾纤维化大鼠METTL3表达的影响3.2.1METTL3表达水平变化RT-qPCR结果显示，腺嘌呤诱导的肾纤维化大鼠中，METTL3mRNA表达水平显著升高（P<0.05）。与对照组相比，高剂量、中剂量和低剂量清肾颗粒干预组大鼠的METTL3mRNA表达水平分别下降了35.7%、32.4%和29.8%（P<0.05）。这表明清肾颗粒可以有效抑制腺嘌呤诱导的肾纤维化大鼠中METTL3的表达。3.2.2METTL3蛋白表达变化Westernblot结果显示，腺嘌呤诱导的肾纤维化大鼠中，METTL3蛋白表达水平显著升高（P<0.05）。与对照组相比，高剂量、中剂量和低剂量清肾颗粒干预组大鼠的METTL3蛋白表达水平分别下降了47.8%、44.8%和39.4%（P<0.05）。这表明清肾3.2.3对肾纤维化大鼠肾脏病理的影响通过HE染色和Masson染色观察，发现腺嘌呤诱导的肾纤维化大鼠肾脏组织出现明显的纤维化改变，而清肾颗粒干预后，大鼠肾脏组织的纤维化程度明显减轻。此外，RT-qPCR和Westernblot结果显示，清肾颗粒可以显著降低METTL3蛋白表达水平，进一步验证了清肾颗粒对腺嘌呤诱导的肾纤维化大鼠中METTL3表达的抑制作用。这些结果为探讨清肾颗粒在慢性肾脏病湿热证治疗中的应用提供了实验依据。综上