（正式版）DB37∕T 2843-2016 《鸭坦布苏病毒双抗体夹心ELISA检测方法》

DB37/T2843—2016 DB37/T2843—2016本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东农业大学。本标准主要起草人：刁有祥、陈浩、唐熠、提金凤、冯强、欧全宾。I1DB37/T2843—2016本标准规定了鸭坦布苏病毒双抗体夹心ELISA方法的样品采集和保存、样品处理、试剂及仪器、检测步骤、结果判定等。2.1.1捕获单抗，抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体。2.1.2检测单抗，辣根过氧化物酶标记(HRP)的另一株抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体2.1.5磷酸盐缓冲液(PBS),见A.1。2.1.6包被液，见A.2。2.1.7洗涤液，见A.3。2.1.8样品稀释液、封闭液，见A.4。2.1.10终止液，见A.5。2.1.11甘油盐水，见A.6。2.2.1酶标仪。死亡鸭采集卵泡膜、脾和脑等组织样品，进行分别处理或同时处理；活鸭采集咽喉或泄殖腔拭子。DB37/T2843—20162样品应放在含有抗生素的pH值7.0～7.4的等渗磷酸盐缓冲液内(无PBS可用25%～50%甘油盐水)。抗生素的选择视当地情况而定，组织和咽喉拭子悬液中应含有青霉素(2000IU/mL)、链霉素(2mg/mL)、庆大霉素(50μg/mL)和制霉菌素(1000IU/mL),加入抗生素后pH值应调至7.0～7.4。在室温放置1h～2h内样品应尽快处理。不能尽快处理的可在4℃存放24h,也可于低温条件下保存(-70℃贮存最好)。反复冻融3次；8000r/min4.1试验试剂预温到20℃~25℃。4.2将捕获单抗用包被液稀释成2.5ng/μL,每孔100μL加入96孔聚苯乙烯板中，4℃孵育过夜。4.3用洗涤液100μL洗3次，每次置于水平振荡器300r/min震荡3min,甩干板上残余液体。4.4每孔加入200μL封闭液，恒温培养箱37℃孵育1h,用4.3方法洗板。4.6将待检样品加入其他各孔，每孔100μL,恒温培养箱37℃孵育1h,用4.3方法洗板。4.7将酶标单抗用样品稀释液按1:1000倍稀释，每孔加100μL,37℃孵育1h,用4.2方法洗板。4.8每孔加100μL底物溶液，37℃避光孵育15min。4.10置酶标仪于450nm测定各孔吸光度(OD)值，该操作需30min内完成。值)/2;阳性对照OD均值等于(A3孔OD值+A4孔OD值)/2。5.2阳性对照平均值减去阴性对照平均值，其差须大于0.4;阴性对照平均值须小于等于0.20。试验条件成立，否则重做。5.3.1阳性样品液OD450nm≥0.40,判断为阳性，即待检样品中含有坦布苏病毒。5.3.2阴性样品液0D450nm≤0.20,判断为阴性，即待检样品中不含有坦布苏病毒。5.3.3样品样品液0.20<0D450nm<0.40,判断为可疑，需要重做。DB37/T2843—20163(规范性附录)NaClKClKH₂PO₄Na₂HPO₄·12H₂O蒸馏水加至A.2包被液(0.05mol/LpH9.6)Na₂CO₃0.2756gNaHCO₃