非抗生素类化合物与抗生素对铜绿假单胞菌协同抗菌作用的研究

实验材料的筛选抗生素的筛选通过调研按照耐药抗生素、临床在用抗生素、新型抗生素三类抗生素划分，先从多种抗生素中进行初步筛选，随后根据具体的七大类抗生素：β-内酰胺类、大环内酯类、氨基糖苷类、喹诺酮类、糖肽类、林可霉素类、pageid":"22855228167646","searchID":"22855228167646","nPageID":"22855228167646","mip_logid":"22855228167646","masterpage_type":"self","originalUrl":"https:\\/\\/\\/yyk\\/hnote\\/1B9F18mlAFl.html","srcid":"landingpage","name":"\\u81ea\\u5efa\\u9875highlight","id":"highlight"}&sec=2994&di=fe07308dc5307db7&&bdver=2_1&bdenc=1&nsrc=/OPkEndSS1OxJGcxb+QxS4jhudfWfcVQ9kamXIo3uFjQ2m214nYCYEE58xBztsdDC0G80bNw/eeFm+nN5PwfLcA/j35o82mqT6KX2hjACyUUHEDyxZDGYqs0WGh5jAJQUwZAZmX0OdHFdCJzvpDmY8SDEIsufgWNseU9QeEzBDLXJRFaZAKhR+QNhh+vhytSkoYkgznOyoHa/ny10CP0Tg=="四环素类，从中选取每种类别中最具代表的两种抗生素作为备选，最后综合考量耐药率、敏感率及MIC三个指标后，从两种备选抗生素中选出一种作为此类抗生素的代表，如表2.1。表2.1抗生素的初始筛选类别抗生素耐药率%敏感率%MICμg/mL选择耐药青霉素类（β-内酰胺类）阿莫西林97.22阿莫西林氨苄西林100四环素类四环素77.27.81-15.62四环素大环内酯类阿奇霉素8-512阿奇霉素β-内酰胺类二代头孢头孢克洛R≥512mg/L头孢克洛头孢呋辛R≥128mg/L临床在用β-内酰胺类三代头孢头孢他啶2186.78-32头孢他啶头孢哌酮30.283.7四代头孢头孢吡肟9.9586.08-32β-内酰胺类（单环）氨曲南23.968.98-32氨曲南喹诺酮类环丙沙星2989.50.5-2左氧氟沙星左氧氟沙星3280.21-4氨基糖苷类妥布霉素2094.71-4阿米卡星阿米卡星1595.516-64新型碳青霉烯类亚胺培南23.291.32-8美罗培南美罗培南19.391.92-8在初步筛选后，发现美罗培南单独使用即可对铜绿假单胞菌产生较好的抑制效应，很难验证协同抗菌作用。而β-内酰胺类抗生素的抗菌机制类似，所以在头孢克洛、头孢他啶、氨曲南三种抗生素中选择临床在用较多的头孢他啶和耐药性较高的阿莫西林。同时，为保证实验的严谨性增添糖肽类和林可霉素类抗生素中临床在用的硫酸多粘菌素B和克林霉素。最后结合七大类抗生素及临床使用、耐药性三方面筛选出四环素、阿奇霉素、左氧氟沙星、硫酸多粘菌素B、阿米卡星、克林霉素、头孢他啶、阿莫西林这8种抗生素用于本实验中。非抗生素类化合物的筛选非抗生素类化合物的抗菌相关研究近年来，有关非抗生素类化合物抗菌的相关报道越来越多，部分FDA化合物具有独特的抗菌机制，可对抗铜绿假单胞菌等耐药菌[14]，中药小分子同样具有抗菌活性，可通过多靶点、多途径对细菌产生影响。而这样的研究有望从其他方面探寻获得抗菌的新途径，寻找新的抗菌药物来缓解目前因抗生素耐药带来的问题。FDA化合物已有的抗菌研究情况许多FDA批准的化合物已被探索其在抗菌领域的潜在作用，尤其是针对铜绿假单胞菌等耐药菌的研究逐渐增多。一些FDA化合物在单独使用时就具备一定的抗菌活性。比如部分喹诺酮类抗生素，其作用机制主要是抑制细菌DNA旋转酶（细菌拓扑异构酶Ⅱ）和拓扑异构酶Ⅳ，阻碍细菌DNA复制，从而发挥抗菌效能，对包括铜绿假单胞菌在内的多种革兰阴性菌有抑制作用[15]。在协同抗菌方面，部分FDA化合物与其他抗生素联合使用展现出协同效应。例如某些β-内酰胺类抗生素与β-内酰胺酶抑制剂组成的复方制剂，β-内酰胺酶抑制剂能保护β-内酰胺类抗生素不被细菌产生的β-内酰胺酶水解，二者联用可增强对产酶铜绿假单胞菌的抗菌活性[16]。另外，还有一些非抗生素类的FDA化合物也被研究其协同抗菌可能性。像补骨脂素可以通过全局抑制铜绿假单胞菌的群体感应系统，同时破坏其生物膜，使铜绿假单胞菌生物膜厚度减少62%（共聚焦显微镜观察），并抑制胞外多糖（EPS）的合成，提升抗生素渗透性；还可以与抗生素协同作用，提高抗菌治疗效果[17]。总体而言，对FDA化合物已有的抗菌研究不断深入，为应对铜绿假单胞菌等耐药菌感染提供了更多的思路和潜在治疗策略。中药小分子抗菌作用的研究进展近年来研究发现多种中药小分子对不同细菌具有抗菌活性。例如，黄连素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等常见病原菌表现出明显抑制作用，其通过破坏细菌细胞膜等机制发挥抗菌功效[18]。大蒜中的蒜素等小分子成分，对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抗菌效果，抗菌谱较广[19]。在机制方面也取得了诸多进展。一些中药小分子能干扰细菌的细胞壁合成，如某些黄酮类小分子可抑制细菌合成细胞壁相关酶的活性，导致细胞壁结构缺陷，从而抑制细菌生长。还有的中药小分子可影响细菌的蛋白质合成过程，通过与细菌核糖体结合，阻碍翻译的正常进行[20]。另外，部分中药小分子能调节细菌体内的代谢通路，破坏其正常代谢平衡，使其无法正常生存繁殖。同时，有研究还关注到中药小分子与抗生素联合使用的协同抗菌作用。像金银花中的绿原酸等小分子与某些抗生素联用，对耐药菌如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）可产生协同抑制效果[21]，不仅增强了抗菌能力，还有望降低抗生素的使用剂量，减少抗生素耐药性的产生风险，为解决细菌耐药问题提供了新的思路和策略。总体而言，中药小分子抗菌作用的研究不断深入，在抗菌谱、作用机制及联合用药等方面都有新成果，未来有望在抗菌治疗领域发挥更重要作用。筛选方法非抗生素类化合物通过查找MedChemExpress(MCE)数据库获得，MCE公司收录了3097个已经完成了广泛的临床前和临床研究，具有良好的生物活性、安全性和生物利用度且已批准上市的化合物，如图2.1。图2.1MCE化合物库通过实验室现存的实验数据和大量的文献调研筛选出对铜绿假单胞菌有抗菌作用的64种非抗生素类化合物。

抗生素协同使用对于铜绿假单胞菌的抑制抗生素对铜绿假单胞菌最低抑菌浓度的测定实验材料菌株材料菌株：铜绿假单胞菌标准菌株。（实验室现有）生长环境条件：37℃、180rpm。药品材料与培养基制备抗生素：四环素、阿奇霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、头孢他啶、阿莫西林、克林霉素、硫酸多粘菌素B。（以上抗生素均购买于麦克林公司）培养基：LB培养基，用于菌株的培养与传代。液体LB：NaCl（10.0g/L），胰蛋白胨（10.0g/L），酵母提取物（5.0g/L），121℃高温灭菌20min。固体LB：NaCl（10.0g/L），胰蛋白胨（10.0g/L），酵母提取物（5.0g/L），琼脂（12.0g/L），灭菌（121℃）20min。实验仪器表3.1实验仪器名称仪器型号生产厂地离心机Sigma德国恒温振荡器上海一恒国产高压灭菌锅上海博讯国产超净工作台苏净安泰国产磁力搅拌器大龙国产纯水仪密理博美国电子天平梅特勒瑞士pH计梅特勒瑞士紫外-可见分光光度计日立U2910日本药品制备及菌液制备抗生素的配制硫酸多粘菌素B、阿米卡星、左氧氟沙星用超纯水溶解后，在超净工作台中用0.22μm的滤膜过滤，四环素、阿奇霉素、头孢他啶、阿莫西林、克林霉素用DMSO溶液溶解，需要提前放置室温超声解冻，不可加热。配置抗生素标明：名称、浓度、日期，定期更换。表3.2八种抗生素的溶剂及分子量名称溶解分子量四环素DMSO444.44阿奇霉素DMSO748.98阿米卡星H2O585.6左氧氟沙星H2O361.37头孢他啶DMSO636.5阿莫西林DMSO365.4克林霉素DMSO424.98硫酸多粘菌素BH2O1301.56抗生素配制完成后，用新鲜无菌的LB液体培养基稀释，采取二倍稀释法。算好所使用的量，LB稀释的抗生素不可久置，每次使用前重新稀释。菌液的制备前一天晚上从PA固体板上挑取铜绿假单胞菌单克隆至50ml管（含有5ml液体LB培养基）中，37℃，过夜培养12h-16h，第二天从管中吸取500μlPA菌液至50ml锥形瓶中，37℃培养2.5h。此时OD600=0.40-0.6之间，处于菌的对数生长期，按照比例稀释，可将菌浓度固定在OD600=0.140-0.160之间，此时的菌可直接用于后续实验。PA固体板标明日期，一月更换一次，重新划线。每一次养菌都应从板上重新使用接种环接菌。实验方法通过96孔板采用二倍稀释法测定MIC抗生素梯度稀释：首先按照需求配制1ml最大浓度的抗生素溶液，将其标为试剂1，随后从试剂1中吸取500μL无菌LB液体培养基和500μL试剂1，将其混匀标为试剂2，依此类推，依次配置好试剂3-7；每孔的总体系为120μL（30μL不同浓度抗生素溶液+30μL菌液+60μL无菌LB液体培养基）。A3-A10孔按照抗生素浓度从小到大依次添加，A1孔抗生素浓度为0，因此补30μL无菌LB液体培养基，B3-B10和C3-C10按照A3-A10添加，即做三次重复实验。加完所有液体直接盖封口膜，不测零小时的数据。96孔板上标注清楚抗生素名称、具体时间。放置37℃，180rpm摇床中培养，24h后使用用酶标仪测定OD600处吸光值。实验结果图3.1八种抗生素不同浓度抑菌效果图表3.3八种抗生素的MICDrugsMIC(μm)PA四环素64阿奇霉素64阿米卡星16左氧氟沙星4头孢他啶64硫酸多粘菌素B4阿莫西林1024克林霉素1024小结与讨论通过最小抑菌浓度实验测得8种抗生素对铜绿假单胞菌的MIC（见表），为后续非抗生素类化合物与抗生素的协同抗菌实验探索出实验条件，方便后续实验的开展。非抗生素类化合物与抗生素协同抗菌实验材料菌株：铜绿假单胞菌标准菌株。药物：多种FDA批准的化合物、中药小分子提取物以及四环素、阿奇霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、头孢他啶、阿莫西林、克林霉素、硫酸多粘菌素B。培养基：LB培养基，用于菌株的培养与传代。仪器设备：表3.4实验仪器名称仪器型号生产厂地离心机Sigma德国恒温振荡器上海一恒国产高压灭菌锅上海博讯国产超净工作台苏净安泰国产磁力搅拌器大龙国产纯水仪密理博美国电子天平梅特勒瑞士pH计梅特勒瑞士紫外-可见分光光度计日立U2910日本药品制备及菌液制备非抗生素类化合物的配制非抗生素类化合物的原液浓度均为10mM，按照比例稀释到最大浓度64μm，后根据二倍稀释法稀释七个梯度，稀释方法与测定抗生素的MIC对应，稀释方法同3.1.2。菌液的制备同.2.实验方法非抗生素类化合物的购买从MCE公司购买选中的非抗生素类化合物。协同作用的测定采用微量棋盘稀释法测定非抗生素类化合物与抗生素对铜绿假单胞菌的协同抗菌作用。做8*8、120μl体系，即：在每个孔中加入菌液60μl+抗生素30μl+LB培养基30μl。并在A1、H1、A12、H12四个孔加入120μlLB作对照组，确认是否染菌。加完所有液体直接盖封口膜。在96孔板上标注抗生素名称，中药单体名称、具体时间。放置37℃，180rpm摇床中培养，24h后使用酶标仪测数据。测得数据后，采用分级抑制浓度指数（FICI）来判断药物间的相互作用类型，计算公式见公式3.1。在大批量筛选后，设置四个协同等级，FICI≤0.2为协同效应最佳等级为三颗星，0.2＜FICI≤0.4为两颗星，0.4＜FICI≤0.5为一颗星，FICI＞0.5为无协同作用。公式（3.1）实验结果筛选出的64种非抗生素类化合物与八种抗生素进行协同筛选共得到512种协同组合，发现等级为三颗星的有3种；两颗星的有11种；一颗星的有5种，其余均无协同效应，如下是部分结果及分析。图3.2协同效应为三颗星如图3.2所示，化合物D05与左氧氟沙星、B04与头孢他啶、E11与左氧氟沙星对铜绿假单胞菌的抑制具有协同效应，协同指数FICI分别为0.187、0.125、0.156，其中B04与头孢他啶组的FICI最小，协同效应最好。图3.3协同效应为两颗星如图3.3所示，化合物B05与左氧氟沙星、B03与头孢他啶、B09与头孢他啶、D06与头孢他啶、D10与头孢他啶、D11与头孢他啶对铜绿假单胞菌的抑制具有协同效应，协同指数FICI分别为0.281、0.312、0.281、0.375、0.257、0.281，其中D10与头孢他啶组的FICI最小，协同效应最好。图3.4协同效应为一颗星如图3.4所示，化合物D03与头孢他啶、C11与四环素、A02与头孢他啶对铜绿假单胞菌的抑制具有协同效应，协同指数FICI均为0.5。图3.5无协同效应如图3.4所示，化合物E02与四环素、D08与左氧氟沙星、B02与头孢他啶协同指数FICI均大于0.5，对铜绿假单胞菌的抑制无协同效应。小结与讨论研究发现少部分非抗生素类化合物与抗生素对铜绿假单胞菌有协同抗菌作用。虽然比列较小，但这种协同作用为治疗铜绿假单胞菌感染提供新的思路，合理联用非抗生素类化合物与抗生素有望成为应对铜绿假单胞菌感染及耐药问题的新策略，改善现有抗生素治疗效果不佳的困境。讨论协同抗菌作用机制探讨非抗生素类化合物与抗生素具有协同作用，抗菌机制可能是多方面的：一是可以促进细菌细胞壁、细胞膜的通透性，帮助抗生素进入菌体发挥效能；二是通过阻断细菌代谢途径，抑制细菌关键酶活性，影响细菌能量的合成或细菌物质代谢；三是在某些情况下，可阻断细菌信号传导系统使细菌不能正常控制毒力因子的表达。可在不同层次发挥协同作用，抑制铜绿假单胞菌生长。中药小分子与抗生素协同抑制铜绿假单胞菌的机制可能涉及以下四方面：一、破坏细菌细胞壁与膜有些中药的小分子可能会影响细菌细胞壁的合成，或者破坏其完整性，提高抗生素进入到细菌体内的概率，如有的含有生物碱类的小分子，能够抑制细菌细胞壁肽聚糖的合成过程；或是改变细菌细胞膜的通透性，促进抗生素进入细菌体内抵达作用靶点，从而达到更好的杀灭细菌的效果。二、抑制细菌耐药泵出功能铜绿假单胞菌存在多种耐药机制，其中主动外排泵可将进入菌体内的抗生素泵出，降低其在菌体内的浓度而导致耐药。某些中药小分子或许能够抑制这些外排泵的活性，使抗生素能在菌体内维持有效浓度，进而与抗生素协同发挥抗菌作用。三、调控细菌代谢途径中药小分子可能干扰铜绿假单胞菌的代谢关键环节。例如，通过影响细菌能量代谢相关的酶系统，使细菌处于能量匮乏状态，此时再联合使用抗生素，细菌因缺乏足够能量来启动耐药机制或维持正常生理功能，从而增强了抗菌协同效果。四、影响细菌群体感应系统细菌群体感应系统可调控其多种毒力因子表达及生物被膜形成等与耐药和致病性相关的行为。部分中药小分子有望干扰该系统，减少细菌毒力因子分泌及生物被膜生成，使抗生素能更有效地接触并杀灭细菌，实现协同抗菌。结论研究主要成果总结该研究主要成果如下：实验表明部分非抗生素类化合物与抗生素联用对铜绿假单胞菌有较强的协同抑菌作用。同时，明确各组合的最适协同浓度配比，提高该菌的抑制效果，可以作为治疗耐药铜绿假单胞菌感染的一种新思路，通过探究这些化合物和抗生素联用的可能性可以发展更多更好的抗菌药物，开发出更高效的抗菌治疗方案。研究成果的应用前景及意义这一研究结果的应用前景是能够发现一些具有抗菌活性的非抗生素类化合物，并将它们用于指导临床治疗铜绿假单胞菌感染或用以辅助抗生素，形成新的联合用药，以期提高治疗效果。另一方面，它可以加强我们对抗菌活性比较弱的物质和中药小分子以及天然产物的探索，有助于发现新型抗菌物质和组合物并为其开发提供理论支持；同时也能中药的研发途径，发展其在抗菌领域的作用和功能，有助于寻找抗耐药的新方法。对临床治疗铜绿假单胞菌感染的潜在应用价值对临床治疗铜绿假单胞菌感染的潜在应用价值如下：提高抗菌疗效：除抗菌外，非抗生素类化合物与抗生素有协同作用还可能提升杀菌效能，在临床实践中面对耐药性日益增强的铜绿假单胞菌，仅使用单一抗生素往往效果不佳，如果同时添加其他与之有协同作用的抗菌物质可以更有效清除感染灶内的细菌、缓解患者的症状、缩短疗程并提高治愈率拓展治疗方案：为临床医生提供更多的治疗手段，当普通的抗生素效果不好时，可以通过联合非抗生素类的药物来杀灭或抑制病原体，再根据患者的自身情况，调整出更适合的方案来治疗疾病，让医生更有选择性，更方便地针对患者的不同情况进行治疗。应对耐药问题：有助于缓解铜绿假单胞菌的耐药压力，协同抗菌可减少单独使用抗生素，从而降低细菌发生耐药突变的可能性，达到延缓抗生素耐药性产生和发展的目的，使现有的抗生素能够继续用于临床对抗铜绿假单胞菌感染，维持对铜绿假单胞菌感染治疗的可持续性。促进中西医结合治疗：中药小分子参与的协同抗菌研究为中西医结合治疗铜绿假单胞菌感染奠定基础。利用其多成分、多靶点优势，可发挥中药特色与西药抗生素优势互补，在临床上开发出更具有针对性的新疗法，且可降低药物使用成本，降低药物副作用，增加用药安全性。参考文献TimothyJ.Close.Dehydrins:Acommonaltyintheresponseofplantstodehydrationandlowtemperature[J].PhysiologiaPlantarum,1997,100(2):291-296.郭艳,刘畅,刘璐,杨永洁.临床药师参与碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌抗感染治疗的意义[J].青岛大学学报(医学版),2025,61(01):149-151.李永峰.重症医学科铜绿假单胞菌血流感染的危险因素分析及风险预测模型[J].济宁医学院学报,2024,47(05):398-401.Aloush,Valerieetal.“Multidrug-resistantPseudomonasaeruginosa:riskfactorsandclinicalimpact.”

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