《生物化学》-第13章

１３.１蛋白质合成体系13.1.1mRNA和遗传密码１.Messen-erRNA(mRNA)———信使核糖核酸mRNA是从脱氧核糖核酸(DNA)转录合成的带有遗传信息的一类单链核糖核酸RNA),它在蛋白质合成过程中作为蛋白质合成的模板,决定肽链的氨基酸排列顺序,是遗传信息的携带者.mRNA存在于原核生物和真核生物的细胞质及真核细胞的某些细胞器(如线粒体和叶绿体)中.虽然同为mRNA,但是原核生物和真核生物的mRNA有不同的特点,具体表现在:下一页返回１３.１蛋白质合成体系

①原核生物mRNA常以多顺反子的形式存在,一条mRNA链编码多个蛋白质,含有多个翻译起始点和多个终止点;而真核生物mRNA一般以单顺反子的形式存在,一条mRNA链编码一个蛋白质,只含有一个翻译起始点和一个终止点.②原核生物mRNA的转录与翻译一般是偶联的,边转录边翻译,而真核生物转录的mRNA前体则需经转录后加工,加工为成熟的mRNA与蛋白质结合生成信息体后才开始工作.③原核生物mRNA半寿期很短,一般为几分钟,最长只有数小时,真核生物mRNA的半衰期较长,如胚胎中的mRNA可达数日.④原核与真核生物mRNA的结构特点也不同.上一页下一页返回１３.１蛋白质合成体系

原核生物mRNA一般５′端有一段非翻译区,称前导区;３′端也有一段不翻译区,中间是蛋白质的编码区,一般编码几种蛋白质.真核生物mRNA(细胞质中的)一般由５′端帽子结构、５′端不翻译区和翻译区(编码区)、３′端不翻译区和３′端多聚腺苷酸尾巴构成,分子中除m７-构成帽子外,常含有其他修饰核苷酸,如m６A等.真核生物mRNA通常都有相应的前体hnRNA(核不均一RNA)的阶段,最终经过选择性剪接,去掉内含子,把外显子连接起来,成为成熟的mRNA,只编码一种蛋白质.２.密码子密码子(codon)是指mRNA链上决定一个氨基酸的相邻的三个碱基,也称为三联体密码.上一页下一页返回１３.１蛋白质合成体系

mRNA在细胞中能决定蛋白质分子中的氨基酸种类和排列次序,也就是说,mRNA分子中的四种核苷酸的序列能决定蛋白质分子中的２０种氨基酸的序列.构成RNA的碱基有四种,每三个碱基决定一个氨基酸,从理论上分析,碱基的组合有４３＝６４种,６４种碱基的组合即６４种密码子.那么６４种密码子怎样决定２０种氨基酸呢?在遗传密码的破译中,美国科学家M.W.Nirenber-等人做出了重要贡献,并于１９６８年获得了诺贝尔生理或医学奖.上一页下一页返回１３.１蛋白质合成体系

早在１９６１年,M.W.Nirenber-等人在大肠杆菌的非细胞体系中外加poly(U)模板、２０种标记的氨基酸,经保温后得到了多聚phe-phe-phe,于是推测UUU编码phe,利用同样的方法得到CCC编码pro、---编码-ly、AAA编码lys.如果利用poly(UC),则得到多聚Ser-Leu-Ser-Leu,推测UCU编码Ser、CUC编码Leu,采用这种方式,到１９６５年就全部破译了６４组密码子仔细分析２０种氨基酸的密码子表,发现同一种氨基酸可以由几个不同的密码子来决定,起始密码子为AU-(甲硫氨酸),另外还有UAA、UA-、U-A三个密码子不能决定任何氨基酸,是蛋白质合成的终止密码子,又称为无义密码子.上一页下一页返回１３.１蛋白质合成体系

４.例外密码子近年来,由于蛋白质和核酸顺序分析技术的发展,密码子可以通过比较蛋白质的顺序、RNA的顺序和DNA的顺序来加以验证.到目前为止,在线粒体、叶绿体中发现通用密码子在此不“通用”了,称为例外密码子.５.第二套密码子一种特定的tRNA只能转运一种特定的氨基酸,但一种氨基酸可以被多种tRNA转运,那么氨基酸如何识别特异的同功tRNA的呢?上一页下一页返回１３.１蛋白质合成体系

这主要是由tRNA分子结构中很小的一部分决定的,这部分甚至只有一个碱基对组成,若从tRNA分子中除去它,则tRNA的功能丧失,不再被任何氨基酸识别.为区别于mRNA上的密码子,故将此称为第二套密码子.虽然第二套密码子尚未完全破译,但是可以看出它比第一套密码子更有决定意义.13.1.2核糖体RNA与核糖体１.核糖体RNA-rRNA(Ribosomalribonucleicacid)上一页下一页返回１３.１蛋白质合成体系

rRNA,即核糖体RNA,是含量最多的一类RNA,占RNA总量的８２％左右,也是３类RNA(tRNA、mRNA、rRNA)中相对分子质量最大的一类RNA.rRNA单独存在时没有功能,但它可以与多种蛋白质结合在一起构成核糖体,作为蛋白质生物合成的“装配机”,如果把rRNA从核糖体上除掉,核糖体的结构就会发生塌陷.(１)rRNA的种类原核生物的核糖体所含的rRNA有５S、１６S及２３S三种,５S含有１２０个核苷酸,１６S含有１５４０个核苷酸,２３S含有２９００个核苷酸.真核生物有４种rRNA,它们分子大小分别是５S、５.８S、１８S和２８S,分别具有大约１２０、１６０、１９００和４７００个核苷酸.上一页下一页返回１３.１蛋白质合成体系

(２)rRNA的功能在核糖体中,rRNA是起主要作用的结构成分,是结构和功能核心,主要功能是:①具有肽酰转移酶的活性.②为tRNA提供结合位点.③为多种蛋白质合成因子提供结合位点.④在蛋白质合成起始时,参与同mRNA选择性地结合,以及在肽链的延伸中与mRNA结合.此外,核糖体大小亚单位的结合、校正阅读、无意义链或框架漂移的校正及抗生素的作用等都与rRNA有关.上一页下一页返回１３.１蛋白质合成体系

２.核糖体１９５３年,Ribinson和Broun在用电镜观察植物细胞时,发现胞质中存在一种颗粒物质;１９５５年,Palade在动物细胞中也看到同样的颗粒,进一步研究了这些颗粒的化学成分和结构;１９５８年,Roberts根据化学成分,将其命名为核糖核蛋白体,简称核糖体,又称核蛋白体.核糖体除哺乳类成熟的红细胞外,一切活细胞中均存在,它是蛋白质合成的重要细胞器,在快速增殖、分泌功能旺盛的细胞中数量尤其多.核糖体的主要成分为RNA和蛋白质,是蛋白质合成的场所.核糖体无膜结构,主要由蛋白质(４０％)和RNA(６０％)构成.上一页下一页返回１３.１蛋白质合成体系

13.1.3转运RNA与氨基酸的活化转运RNA(TransferRibonucleicAcid,tRNA)是具有携带并转运氨基酸功能的一类小分子核糖核酸,一种tRNA只能携带一种氨基酸,如丙氨酸tRNA只携带丙氨酸,但一种氨基酸可被不止一种tRNA携带.同一生物中,携带同一种氨基酸的不同tRNA称作“同功受体tRNA”.组成蛋白质的氨基酸有２０种,根据密码子摆动学说,至少需要３１种tRNA,但在脊椎动物中只存在２２种tRNA,这主要是通过密码子-反密码子配对的简化实现的,使得一种tRNA可以识别一个密码子家族的全部４个密码子,携带同一种氨基酸的细胞器tRNA与细胞质tRNA也不一样.上一页下一页返回１３.１蛋白质合成体系

tRNA是真正的翻译者,是氨基酸的运载工具,是遗传信息的转换器.核糖核酸到蛋白质的转换就是通过tRNA实现的,它含有两个关键的部位:一个是氨基酸的结合部位,它是通过氨基酸臂实现的;另一个是与mRNA的结合部位,它是通过反密码子实现的.通过这两个关键的部位实现了翻译.上一页返回13.2蛋白质的合成过程13.2.1氨基酸的活化、转运与校对在蛋白质生物合成过程中,各种氨基酸在掺入肽链之前必须先经过活化,然后再由其特异的tRNA携带、转运至核糖体上,才能以mRNA为模板缩合成肽链.氨基酸活化及以后与相应的tRNA结合的反应,均是由特异的氨基酰-tRNA合成酶(aminoacyl-tRNAsynthetase,aaRS)催化完成的.１.氨酰-tRNA合成酶氨酰tRNA合成酶存在于所有的生物体中,定位于细胞浆.目前已从许多生物组织中提纯,其相对分子质量为２.２７×１０４~２.７×１０５,下一页返回13.2蛋白质的合成过程有的由单一肽链组成,有的由几个亚基组成,通常称为α、β亚基.单个肽链的大小差别较大,从嗜热杆菌(Bacillusstearo-thermophilus)的TrpRS含３２７个氨基酸残基到E.coli的IleRS含９３９个氨基酸残基不等.来源于不同生物的同种aaRS,其序列保守性也不同,如酵母和细菌的同种aaRS比较,其同源性在２０％~５０％范围内.氨酰tRNA合成酶的特点是具有高度的专一性,每种氨基酸的活化至少需要一种特定的氨酰-tRNA合成酶,因有２０种氨基酸,故至少应有２０种氨基酰-tRNA合成酶.上一页下一页返回13.2蛋白质的合成过程２.氨基酸的活化、转运与校对氨酰-tRNA合成酶参与的合成分两步进行:①氨酰-tRNA合成酶在二价阳离子(如M-２＋)存在下,识别它所催化的氨基酸及另一底物ATP,氨基酸的羧基与AMP上的磷酸之间形成一个酯键,同时释放出一分子焦磷酸:氨基酸＋ATP→氨酰-AMP-E＋PPi.这称为氨基酸的活化,这时氨酰-AMP仍然紧密地与酶分子结合.上一页下一页返回13.2蛋白质的合成过程②氨酰-tRNA合成酶催化的反应是通过形成酯键,将氨基酸连接到tRNA３′端的核糖上的:氨酰-AMP-E＋tRNA→氨酰-tRNA＋AMP＋E,各种tRNA的３′端都有同样的三个核苷酸的序列-CCA-OH,氨基酸即结合在tRNA的３′-CCA末端腺苷酸(A)的核糖２′或３′游离-OH上,以酯键相连,这个过程称为氨基酸的转运.氨酰-tRNA合成酶还有校对功能,能对氨基酸“身份”进行检查、校对,一旦发生tRNA装载了错误的氨基酸,它能把错误的氨基酸水解下来,换上正确的氨基酸.这种校对作用也保证了翻译的正确性.上一页下一页返回13.2蛋白质的合成过程13.2.2肽链合成的起始１.核糖体３０S小亚基结合于mRNA起始信号部位原核生物中,在每一个mRNA的起始密码子AU-上游都有一个８~１３个富含嘌呤碱的一致性序列,如-A--A---,它是１９７４年由J.Shine和L.Dal-arno发现的,故称为Shine-Dal-arno序列,简称SD序列,又称为核糖体结合位点(ribosomalbindin-site,RBS).他们是通过比较多种原核细胞蛋白质mRNA的５′端核苷酸序列之后发现的,在１６SrRNA３′端有一段富含嘧啶碱基的序列,可以与SD序列互补配对,上一页下一页返回13.2蛋白质的合成过程因而被称为反SD序列.正是SD序列与反SD序列的互补关系,才使得位于mRNA的SD序列下游的第一个AU-用作起始密码子,这种互补就意味着核糖体能选择mRNA上AU-的正确位置来起始肽链的合成,这种结合反应由起始因子３(IF-３)介导,另外,IF-１促进IF-３与小亚基的结合,故先形成IF３-３０S亚基-mRNA三元复合物.２.３０S前起始复合物的形成在起始因子２(IF-２)作用下,甲酰甲硫氨酰起始tRNA与mRNA分子中的AU-相结合,即密码子与反密码子配对.同时,IF-３从三元复合物中脱落,形成３０S前起始复合物,即IF２-３０S亚基-mRNA-fMet-tRNAfmet复合物,此步需要-TP和M-２＋参与.上一页下一页返回13.2蛋白质的合成过程３.７０S起始复合物的形成５０S亚基与上述的３０S前起始复合物结合,同时IF-２脱落,形成７０S起始复合物,即３０S亚基-mRNA-５０S亚基-mRNA-fMet-tRNAfmet复合物.此时fMet-tRNAfmet占据着５０S亚基的肽酰位,即P位点,而A位则空着,等待对应mRNA中第二个密码的相应氨基酰tRNA进入,从而进入延长阶段.真核生物蛋白质合成的起始过程基本和原核生物的类似,但也有差别,真核细胞蛋白质合成起始复合物的形成中需要更多的起始因子参与,因此起始过程也更复杂.上一页下一页返回13.2蛋白质的合成过程13.2.3肽链合成的延伸肽链的延伸是在核糖体上连续性循环式进行的,又称为核糖体循环(ribosomalcycle),每循环一次增加一个氨基酸,这一过程包括进位、转肽和移位等三个步骤.肽链合成的延长需两种延长因子(Elon-ationfactor,EF),分别称为热不稳定的E(Unstabletemperature,EF)EF-Tu、热稳定的EF(stabletemperatureEF,EF-Ts)及依赖-TP的转位因子,此外,尚需-TP供能加速翻译过程.上一页下一页返回13.2蛋白质的合成过程１.进位进位即新的氨基酰-tRNA进入５０S大亚基A位,并与mRNA分子上相应的密码子结合,在７０S起始复合物的基础上,原来结合在mRNA上的fMet-tRNAfMet占据着５０S亚基的P位点(当延长步骤循环进行两次以上时,在P位点则为肽酰-tRNA)新进入的氨基酰-tRNA则结合到大亚基的A位点,并与mRNA上起始密码子随后的第二个密码子结合.氨基酰tRNA在进位前需要-TP、延长因子及M-２＋的参与,EF-Tu首先与-TP结合,然后再与氨基酰tRNA结合成三元复合物,这样的三元复合物才能进入A位,此时-TP水解成-DP,EF-Tu和-DP与结合在A位上的氨基酰tRNA分离(图１３-１０).上一页下一页返回13.2蛋白质的合成过程２.转肽在大亚基上肽酰转移酶的催化下,将P位点上的tRNA所携带的甲酰蛋氨酰(或肽酰基)转移给A位上新进入的氨基酰-tRNA的氨基酸,即由P位上的氨基酸(或肽的３′端氨基酸)提供α-COOH,与A位上的氨基酸的α-NH２形成肽链.许多证据表明大肠杆菌肽酰转移酶是由核糖体上５０S亚基上的２３SrRNA承担的.此后,在P位点上的tRNA成为无负载的tRNA,而A位上的tRNA负载的是二肽酰基或多肽酰基,随后５０S亚基P位上无负载的tRNA(如tRNAfMet)脱落,此步需M-２＋及K＋的存在.上一页下一页返回13.2蛋白质的合成过程３.移位移位指在EF--和-TP的作用下,核糖体沿mRNA链(５′→３′)做相对移动,每次移动相当于一个密码子的距离,使得下一个密码子能准确地定位于A位点处,而tRNA与mRNA保持相对静止,这样原来处于A位点上的二肽酰tRNA在核糖体移位后处于核糖体的P位点上,空出A位点,随后再依次按上述的进位、转肽和移位步骤进行下一循环,即第三个氨基酰-tRNA进入A位点,然后在肽酰转移酶催化下,P位上的二肽酰tRNA又将此二肽基转移给第三个氨基酰-tRNA,形成三肽酰tRNA,同时,卸下二肽酰的tRNA又迅速从核糖体脱落,像这样继续下去,延长过程每重复一次,肽链就延伸一个氨基酸残基,多次重复,就使肽链不断地延长,直到增长到必要的长度.上一页下一页返回13.2蛋白质的合成过程通过实验已经证明,mRNA上的信息的阅读是从多核苷酸链的５′端向３′端进行的,而肽链的延伸是从N端开始的.13.2.4肽链合成的终止肽链合成的终止,需要终止因子或释放因子(releasingfactor,RF)参与.在E.coli中已分离出三种RF,分别是RF１(MW＝３６０００)、RF２(MW＝３８０００)和RF３(MW＝４６０００),其中,只有RF３与GTP(或GDP)能结合,它们均具有识别mRNA链上终止密码子,使肽链释放,核糖体解聚的作用.上一页下一页返回13.2蛋白质的合成过程１.识别多肽链合成完毕,这时,虽然多肽链仍然附着在核糖体及tRNA上,但mRNA上肽链合成终止密码子UAA(也可以是UAG或UGA)已在核糖体的A位点上出现,终止因子用以识别这些密码子,并在A位点上与终止密码子相结合,从而阻止肽链的继续延伸.RF３的作用目前还不能肯定,可能具有加强RF１和RF２的终止作用.RF１和RF２对终止密码子的识别具有一定特异性.RF１可识别UAA和UAG,RF２可识别UAA和UGA.RF与EF在核糖体上的结合部位是同一处,它们重叠的结合部位可以防止EF与RF同时结合于核糖体上,从而扰乱正常功能.上一页下一页返回13.2蛋白质的合成过程２.水解终止因子还可以使核糖体P位点上的肽酰转移酶发生变构,酶的活性从转肽作用改变为水解作用,从而使tRNA所携带的多肽链与tRNA之间的酯键被水解切断,多肽链从核糖体及tRNA释放出来.３.解离核糖体与mRNA分离,同时,在核糖体P位上的tRNA和A位上的RF也自行脱落,与mRNA分离的核糖体又分离为大小两个亚基,可重新投入另一条肽链的合成中.上一页下一页返回13.2蛋白质的合成过程13.2.5蛋白质合成过程中能量的消耗蛋白质合成过程需要消耗能量.原核生物合成蛋白质时,如果合成一个二肽(形成一个肽键),需８个高能键,其后每加一个氨基酸需４个高能键.如果合成２００个氨基酸残基的多肽,则消耗高能磷酸键的个数为８＋１９８×４＝８００,即４n＝４×２００＝８００.真核生物蛋白质合成中,起始过程比原核生物多消耗１个ATP和１个GTP,如果合成一个二肽(形成一个肽键),需１０个高能键,其后每加一个氨基酸,需４个高能键,如果合成２００个氨基酸残基的多肽,则消耗高能磷酸键的个数为１０＋１９８×４＝８０２,即４n＋２＝４×２００＋２＝８０２.上一页下一页返回13.2蛋白质的合成过程13.2.6蛋白质合成的抑制剂影响蛋白质生物合成的物质非常多,它们可以作用于DNA复制和RNA转录,对蛋白质的生物合成起间接作用,这里介绍的主要是蛋白质翻译过程的阻断剂.１.抗生素类阻断剂许多抗生素都是以直接抑制细菌细胞内蛋白质合成而对人体副作用最小为目的而设计的,它们可作用于蛋白质合成的各个环节,包括抑制起始因子、延长因子及核糖体的作用等.(１)链霉素、卡那霉素、新霉素(２)四环素和土霉素上一页下一页返回13.2蛋白质的合成过程(３)氯霉素(４)嘌呤霉素(５)白喉霉素２.干扰素对病毒蛋白合成的抑制干扰素(interferon)是病毒感染后,感染病毒的细胞合成和分泌的一种小分子蛋白质.从白细胞中得到α-干扰素,从成纤维细胞中得到β-干扰素,从免疫细胞中得到γＧ干扰素.干扰素结合到未感染病毒的细胞膜上,诱导这些细胞产生寡核苷酸合成酶、核酸内切酶和蛋白激酶,在细胞未被感染时,不合成这三种酶,一旦被病毒感染,有干扰素或双链RNA存在时,这些酶被激活,并以不同的方式阻断病毒蛋白质的合成.上一页下一页返回13.2蛋白质的合成过程干扰素和dsRNA(double-strandedRNA,dsRNA)激活蛋白激酶,蛋白激酶使蛋白质合成的起始因子磷酸化,使它失活.另一种方式是mRNA的降解,干扰素dsRNA激活２,５-腺嘌呤寡核苷酸合成的酶的合成,２,５-腺嘌呤寡核苷酸激活核酸内切酶,核酸内切酶水解mRNA.由于干扰素具有很强的抗病毒作用,因此在医学上有重大的使用价值,但组织中含量很少,难以从生物组织中大量分离干扰素,现在已应用基因工程合成干扰素以满足研究与临床应用的需要.上一页返回13.3蛋白质合成后的加工与定向运输13.3.1蛋白质合成后的加工从核糖体释放出的新生多肽链不具备蛋白质生物学活性,必须按照一级结构中氨基酸侧链的性质,自行卷曲,形成一定的空间结构,才转变为天然构象的功能蛋白.过去一直认为,蛋白质空间结构的形成是由其一级结构决定的,不需要另外的信息,近些年来发现许多细胞内蛋白质的正确装配都需要一类称作“分子伴侣”的蛋白质帮助才能完成,这一概念的提出并未否定“氨基酸排列顺序决定蛋白空间结构”这一原则,而是对这一理论的补充.分子伴侣这一类蛋白质能介导其他蛋白质正确装配成有功能活性的空间结构,而它本身并不参与最终装配产物的组成.返回下一页13.3蛋白质合成后的加工与定向运输

目前认为“分子伴侣”蛋白有两类:第一类是一些酶,例如蛋白质二硫键异构酶可以识别和水解非正确配对的二硫键;使它们在正确的半胱氨酸残基位置上重新形成二硫键;第二类是一些蛋白质分子,它们可以和部分折叠或没有折叠的蛋白质分子结合,稳定它们的构象,免遭其他酶的水解或都促进蛋白质折叠成正确的空间结构,总之“分子伴侣”在蛋白质合成后折叠成正确空间结构中起重要作用.对于大多数蛋白质来说,多肽链翻译后还要进行下列不同方式的加工修饰才具有生理功能.上一页下一页返回13.3蛋白质合成后的加工与定向运输

１.氨基端和羧基端的修饰在原核生物中,几乎所有蛋白质的合成都是从N-甲酰甲硫氨酸开始的,真核生物从甲硫氨酸开始,甲酰基经酶水解而除去,甲硫氨酸或者氨基端的一些氨基酸残基常由氨肽酶催化而水解除去,如信号肽序列.因此,成熟的蛋白质分子N-端没有甲酰基,或没有甲硫氨酸,某些蛋白质分子氨基端要进行乙酰化,在羧基端也要进行修饰.２.共价修饰许多蛋白质可以进行不同类型化学基团的共价修饰,修饰后可以表现为激活状态,也可以表现为失活状态.上一页下一页返回13.3蛋白质合成后的加工与定向运输

(１)磷酸化磷酸化多发生在多肽链丝氨酸、苏氨酸的羟基上,偶尔也发生在酪氨酸残基上,这种磷酸化的过程受细胞内一种蛋白激酶催化.磷酸化后的蛋白质可以增加或降低它们的活性,例如促进糖原分解的磷酸化酶,无活性的磷酸化酶b经磷酸化以后,变成有活性的磷酸化酶a,而有活性的糖原合成酶Ⅰ,经磷酸化以后变成无活性的糖原合成酶D,共同调节糖元的合成与分解.上一页下一页返回13.3蛋白质合成后的加工与定向运输

(２)糖基化质膜蛋白质和许多分泌性蛋白质都具有糖链,这些寡糖链结合在丝氨酸或苏氨酸的羟基上,例如红细胞膜上的ABO血型决定簇,这是N连接的糖基化;有些也可以与天冬酰胺连接,这些寡糖链是在内质网或高尔基氏体中加入的,这是O连接的糖基化.(３)羟基化胶原蛋白前α链上的脯氨酸和赖氨酸残基在内质网中受羟化酶、分子氧和维生素C作用产生羟脯氨酸和羟赖氨酸,如果此过程受阻,胶原纤维不能进行交联,极大地降低了它的张力强度.上一页下一页返回13.3蛋白质合成后的加工与定向运输

(４)二硫键的形成mRNA上没有胱氨酸的密码子,多肽链中的二硫键是在肽链合成后,通过二个半胱氨酸的巯基氧化而形成的.二硫键的形成对于许多酶和蛋白质的活性是必需的.(５)亲脂修饰蛋白质亲脂修饰后可以改变膜结合能力和特定的蛋白与蛋白之间的相互作用.最常见的亲脂修饰是酰化和异戊二烯化.豆蔻酸在真核细胞中很罕见,但是豆蔻酰化却是最常见的酰化形式之一,N-豆蔻酰化能增加特定G蛋