DB63∕T 2494-2026 芜菁种质资源鉴定技术规程 SSR分子标记法

ICS65.020.01

CCSB04

备案号DB63

青海省地方标准

636363

DB63/T2494-2026

芜菁种质资源鉴定技术规程

SSR分子标记法

2026—01—09发布2026—02—10实施

青海省市场监督管理局发布

DB63/T2494-2026

目次

前言.................................................................................II

1范围................................................................................1

2规范性引用文件......................................................................1

3术语和定义..........................................................................1

4仪器设备及试剂......................................................................1

5溶液配制............................................................................1

6操作程序............................................................................2

7数据处理............................................................................3

8判定方法............................................................................3

附录A（规范性）溶液配制.............................................................4

附录B（资料性）推荐引物及序列信息...................................................5

I

DB63/T2494-2026

前言

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由青海省农牧业标准化技术委员会提出。

本文件由青海省农业农村厅归口。

本文件起草单位：青海大学、青海省农林科学院、玉树藏族自治州农牧业综合服务中心。

本文件主要起草人：任延靖、李全辉、尕桑、文军琴、邵登魁。

本文件由青海省农业农村厅监督实施。

II

DB63/TXXXX-2025

芜菁种质资源鉴定技术规程

SSR分子标记法

1范围

本文件规定了利用简单重复序列（Simplesequencerepeats,SSR）标记进行芜菁（Brassicarapassp.

rapaL.）种质资源鉴定的仪器设备及试剂、溶液配制、操作程序、数据处理及判定方法等内容。

本文件适用于芜菁种质资源数据的采集和资源鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4仪器设备及试剂

4.1仪器设备

高压灭菌锅、研磨仪、干燥箱、移液器、电热恒温水槽、低温高速离心机、超纯水系统、微波炉、

水平电泳槽及其制胶套件、电泳仪、制冰机、凝胶成像系统、聚合酶链式反应（PCR）仪、胶片观察灯、

天平、垂直电泳槽及其制胶套件、核酸定量测定仪、超低温冰箱、涡旋混合器、磁力加热搅拌器、水平

摇床等。

4.2试剂

十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、酚：氯仿：异戊醇（25:24:1，pH=8.0）、氯仿：异戊醇（24:1）、

乙醇、琼脂糖、含有染料的2×PCR预混液（2×PCRMix）、SSR引物、核酸染料、DNA分子量标准物、

丙烯酰胺、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺、四甲基二乙胺（TEMED）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四

乙酸二钠（EDTA-Na2）、硼酸、Tris-硼酸盐-EDTA（TBE）溶液、过硫酸铵（APS）、硝酸银（AgNO3）、

氢氧化钠（NaOH）、甲醛溶液（37%），本文件所用的试剂为分析纯试剂，水应符合GB/T6682中规定

的三级水。

5溶液配制

溶液配制按附录A执行。

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DB63/T2494-2026

6操作程序

6.1样品选择

选取幼嫩、无病虫害的叶片，每份样品包含5～9片叶片的混合样，并设置三个重复。

6.2DNA样品制备

DNA提取方法及步骤如下：

a)选取约0.2g叶片组织样本子放置于干净的、装有2粒直径为6mm灭菌钢柱的2mL离心管中，

放入液氮中速冻后，使用高通量组织研磨仪迅速研磨至粉末，时间30s～60s；

b)向离心管中加入710μL65℃预热1h的1.5×CTAB提取液，混匀样品粉末和提取液；将离心

管放入65℃烘箱或水浴锅中温浴30min，中间每间隔5min轻摇一次；

c)取出离心管，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）的混合物，轻摇10min充分混匀，

10000r/min4℃离心10min；

d)取上层液相650μL转移于无菌的1.5mL离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），轻

摇10min充分萃取杂质，12000r/min室温离心10min；

e)取上清液500μL，加入2倍体积的预冷无水乙醇，颠倒混匀，-20℃条件下沉淀30min，4℃

条件下6000r/min离心2min；

f)保留沉淀后晾干，充分溶解至超纯水中，检测OD260和OD280。

注：以上为推荐的DNA提取方法，DNA质量能满足PCR扩增要求的其他DNA提取方法均适用于本文件。DNA溶液的紫外

吸光度OD260与OD280的比值宜介于1.7～2.0。

6.3PCR扩增

6.3.1引物选择

扩增引物见附录B。

6.3.2反应体系

PCR反应体系为20.00μL，包括200ng/μLDNA模板1.00μL，10μmol/L上、下游引物各0.80μL，

2×PCRMix10.0μL，用超纯水补足至20.0μL，可依据试验条件调整。

6.3.3PCR扩增程序

PCR扩增程序：95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重复35个循

环；72℃延伸10min；4℃保存。反应程序中各反应参数可根据PCR扩增仪型号、酶、引物等不同而作

适当的调整。

6.4产物检测

6.4.1非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

6.4.1.1凝胶准备

取一套玻璃板（一块光滑的和一块带磨砂边条的），冲洗干净，晾干，固定在配套的橡皮条上。用

完全溶解的1.0%琼脂糖凝胶封底，静置晾干凝胶，制成铸胶槽。在100mL小烧杯中依次加入30%的丙

烯酰胺溶液7.5mL、5×TBE溶液5.0mL、10%APS250μL、补超纯水至25mL、TEMED25μL，混匀后注

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DB63/TXXXX-2025

满铸胶槽，轻敲玻璃板，防止气泡产生，插入42孔或50孔样孔梳至2/3处，室温下静置直至凝胶完全

聚合后使用。溶液体积可根据胶板的大小、胶槽的尺寸做适当的调整。

6.4.1.2电泳

将含有样孔梳的玻璃板固定在垂直电泳槽上并拧紧，光滑的玻璃板向内，注入1×TBE缓冲液，外

槽电泳液没过梳孔，内侧电泳液约2cm～3cm高。垂直向上拔掉梳子，清除点样孔余胶，接通电源，预

电泳至阴极铂丝上有气泡生成。暂停电源，用移液器取1.5μLDNA分子量标准物点入点样孔中，再取

1.5μLPCR扩增产物点入其他点样孔中。设置电压220V，电流60mA/板，电泳约1.5h，待二甲苯氰

迁移至胶底部，停止电泳。

6.4.1.3银染显色

将电泳完毕的玻璃板从胶槽中卸出，在水中将凝胶从玻璃板上剥离下来。将剥离下来的凝胶放入盛

有蒸馏水的盘子里，漂洗2～3次。将胶转入染色液中震荡染色8min～10min。将染色结束的凝胶转入

蒸馏水中漂洗2～3次。将冲洗完毕的凝胶转入显色液中显色至条带清楚显示，用蒸馏水冲洗胶片2～3

次，沥干后扫描或拍摄成像。

注：染色液、显色液、蒸馏水的用量，以淹没凝胶为准。

7数据处理

根据扩增产物的电泳结果，在相同迁移位置处，选择100bp～300bp之间、清晰条带记为“1”，

无条带的记为“0”，从而形成0-1矩阵，数据模式见图1。

材料1材料2材料1材料2

SSRX-1

SSRY-1

SSRY-2

SSRX-2

SSRY-3

SSRX-3

SSRX-4

图1材料PCR扩增带型数据模式图

注：标记SSRX在所有材料中共扩增出4条大小不同的条带，按照条带从大到小依次编号为SSRX-1、SSRX-2、SSRX-3、

SSRX-4；标记SSRY在所有材料中共扩增出3条大小不同的条带，按照条带从大到小依次编号为SSRY-1、SSRY-2、

SSRY-3；若材料1显示的条带为SSRX-1、SSRX-3、SSRY-4、SSRY-1、SSRY-3，则其带型数据为1011101，若材料

2显示的条带为SSRX-1、SSRX-2、SSRY-2、SSRY-3，则其带型数据为1100011，同样可给出其它参试材料的带型

数据。由此，可建立每份材料的数字化指纹，每一数字对应一个扩增条带或位点。

8判定方法

按照由带型数据赋予的数字化指纹，可单独或联合使用的标记鉴定材料的异同，具体如下：

a）当样品间差异位点数≥2，判定为“不同”；

b）当样品间差异位点数＝1，判定为“高度相似”；

c）当样品间差异位点数＝0，判定为“极近似或相同”。

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DB63/T2494-2026

A

A

附录A

（规范性）

溶液配制

A.1DNA提取溶液的配制

称取十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）15.0g、氯化钠（NaCl）81.816g、二水乙二胺四乙酸二钠

（EDTA-Na2·2H20）7.444g、三羟甲基氨基甲烷（Tris）12.114g于1000mL烧杯中，加入800mL超纯

水溶解，调整pH为8.0，转移至1000mL容量瓶中，用超纯水定容至1000mL，在103.4kPa（121℃）

条件下灭菌20min。

A.2PCR扩增所需的SSR引物的配制

用超纯水配制浓度为10μmol/L的SSR引物工作液。

A.3聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制

A.3.130%丙烯酰胺溶液

分别称取丙烯酰胺300.0g和甲叉双丙烯酰胺20.0g于1000mL烧杯中，加入500mL超纯水溶解，

后转移至容量瓶中定容至1000mL，避光保存。

A.3.2TBE缓冲液

A.3.2.15×TBE缓冲液

称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）54.0g和硼酸27.5g于1000mL烧杯中，加入20mL0.5mol/L乙

二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液，加入800mL超纯水溶解，调整pH为8.0，转移至1000mL容量瓶中，

用超纯水定容至1000mL。

A.3.2.21×TBE缓冲液

量取5×TBE缓冲液200mL于1000mL容量瓶中，用超纯水定容至1000mL。

A.3.310%过硫酸铵溶液

称取10.0g过硫酸铵，溶于100mL超纯水中，避光保存。

A.4银染溶液的配制

A.4.1染色液

称取1.0g硝酸银于1000mL烧杯中，加800mL超纯水溶解，转移至1000mL容量瓶中，定容至1000

mL，避光保存。

A.4.2显色液

称取10.0g氢氧化钠于1000mL烧杯中，加入800mL超纯水溶解，量取5mL甲醛，转移至1000mL

容量瓶中定容至1000mL。

4

DB63/TXXXX-2025

B

B

附录B

（资料性）

推荐引物及序列信息

引物系根据芜菁种质资源W21和W25转录组数据开发，并采用设计的30对引物对50份芜菁种质资

源进行测试，组合运用一些引物可将参试材料完全区分。为此，选择14对扩增条带清晰、多态性信息

含量大于0.50的引物作为芜菁种质资源鉴定的推荐引物。推荐引物及序列信息见表B.1。

表B.1推荐引物及序列信息

序号引物名称正向引物序列（5’-3’）反向引物序列（5’-3’）退火温度

1Cluster-30924.171259F：TGTGAACCCAAGCTCCGTACR：GCCGTCTTCATCACATTCGC60℃

2Cluster-30924.151200F：AAGGAGGCTGCAAGAGTGACR：CCAGTGGGTGTCTCAGGTTC60℃

3Cluster-30924.41968F：CGCAGTTGGTTGTCACACAGR：CGTCTCACTCGGTGTTCCAA60℃

4Cluster-30924.28557F：TCTTCATGCGGCTTCCTCTGR：AGCAAAGCTCCCATCAGACC60℃

5Cluster-30924.164312F：GGAGACTGAGGGGATGAGGTR：AGAAATCGGACCCGGGTTTC60℃

6Cluster-9993.0F：GCGAGTCAGGCCTAAAGGTTR：TCAATTTCCCTGGCGTCTCC60℃

7Cluster-30924.71367F：GCTGTCGGTGGTGTTCAAACR：TAACAGGGACCGGCAAAGAC