高三生物二轮复习课件限制酶的选取与基因表达载体的构建

限制酶的选取与基因表达载体的构建（图表结合分析）高中生物

二轮复习真题引领明晰方向第分部一(2025·陕晋宁青卷)马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题：(1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、含Mg2＋的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的延伸步骤中起作用。解析：(1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、含Mg2＋的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。PCR反应一般分为变性、复性和延伸三步，其中DNA聚合酶在PCR的延伸步骤中起作用。4种脱氧核苷酸延伸(2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的5′端(填“5′端”或“3′端”)添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5′­-AGATCT­-3′，切割载体时应选用的两种限制酶是BamHⅠ、EcoRⅠ，PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。5′端AGATCTBamHⅠ、EcoRⅠ解析：(2)为了使目的基因能够被限制酶切割，扩增目的基因时，需要在引物的5′端添加限制酶的识别序列。结合图表分析，在载体的启动子和终止子之间有BamHⅠ、EcoR

Ⅰ和Xba

Ⅰ的识别序列，而S基因内部含有Xba

Ⅰ、Nde

Ⅰ和BamHⅠ的识别序列，要用BamHⅠ、EcoRⅠ或Xba

Ⅰ切割载体，又不能用Xba

Ⅰ、Nde

Ⅰ和BamHⅠ切割S基因，再根据各种限制酶的识别序列及切割位点可知，需要用BamHⅠ、EcoRⅠ切割载体，用BamHⅠ的同尾酶Bgl

Ⅱ和EcoRⅠ切割S基因，故PCR扩增S基因时需在上游引物添加的碱基序列是5′­-AGATCT-­3′。(3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T­DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上，抗性基因2可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。解析：(3)T­-DNA属于可转移DNA，用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T­DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上，抗性基因1位于T­DNA外部，可用于筛选含有重组载体的农杆菌，而抗性基因2位于T­DNA内部，可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上2再分化【思维导图】限制酶选取与基因表达载体的构建过程知识归纳拓展思维第分部二1．限制酶的选择技巧(1)根据限制酶切割位点的位置确定限制酶的种类①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图1可选择PstⅠ。②不能选择切割位点位于目的基因和标记基因内部的限制酶，如图1、图2不能选择SmaⅠ。③为避免目的基因和质粒的自身环化及随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图1也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类(3)根据Ti质粒的T­DNA片段选择限制酶图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)，分析如下：2．基因表达载体的构建过程追踪集训融会贯通第分部三C1．(2025·江西宜春二模)为了能够便于被限制酶切割，科研人员将限制酶的识别序列添加在了改造后的基因两侧。下图表示三种限制酶在改造后的β­淀粉酶基因和pLN23质粒载体上的酶切位点。有关说法不正确的是(

)

A．为了保证目的基因和质粒能够正确连接，切割含有β­淀粉酶基因的DNA片段应当选择的限制酶是EcoRⅠ和BamHⅠB．PCR扩增目的基因时先要将温度上升到90℃以上，使DNA变性C．有时为满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活目的基因的表达D．终止子使转录在所需要的地方停下来，是一段有特殊序列结构的DNA片段解析：由图可知，切割质粒只能用EcoRⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶，但由于用Sau3AⅠ切割含目的基因的DNA片段会破坏目的基因，所以切割含有目的基因的DNA片段不能用Sau3AⅠ，但BamHⅠ与Sau3AⅠ切出的黏性末端相同，所以可以用EcoRⅠ和BamHⅠ切割含有目的基因的DNA片段，得到中间区段的DNA片段，在左端为EcoRⅠ切出的黏性末端，右端为BamHⅠ切出的黏性末端，其两端与质粒上用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切出的黏性末端相同，保证了目的基因和质粒正确连接，A正确；PCR扩增时，第一步是高温变性，将温度上升到90℃以上，使DNA双链解开成为单链，为后续引物结合等反应做准备，B正确；有时为满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达，C错误；终止子是一段有特殊序列结构的DNA片段，能使转录在所需要的地方停下来，这是终止子的基本功能，D正确。2．(2025·湖北武汉一模)如图为pUC18质粒图谱，已知目的基因两侧的酶切位点为EcoRⅠ和BamHⅠ。现需将目的基因插入质粒的LacZ基因内，形成重组质粒并导入受体细胞。注：图中AmpR为氨苄青霉素抗性基因，ori为复制原点，LacZ表达产物可使X­gal的培养基呈现蓝色。D下列限制酶组合选择及后续处理最合适的是(

)A．用BamHⅠ酶切质粒和目的基因，将细胞涂布于含氨苄青霉素的培养基中B．用EcoRⅠ酶切质粒和目的基因，将细胞涂布于含氨苄青霉素和X­gal的培养基中C．用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切质粒和目的基因，将细胞涂布于含X­gal的培养基中D．用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切质粒和目的基因，将细胞涂布于含氨苄青霉素和X­gal的培养基中解析：双酶切(EcoRⅠ和BamHⅠ)确保目的基因定向插入LacZ基因内部，破坏其表达，将细胞涂布于含氨苄青霉素和X­gal的培养基中，含重组质粒的受体细胞形成的菌落在含X­gal的培养基上呈白色，含非重组质粒的受体细胞形成的菌落呈蓝色，氨苄青霉素筛选仅保留含质粒的细菌，D正确。3．(2025·安徽黄山质量检测)抗冻蛋白基因TmAFP是从黄粉虫幼虫体内分离得到的基因，其编码的蛋白质具有很强的抗冻活性。科学家成功将TmAFP基因导入甘薯中，并使甘薯获得抗冻能力，减少霜冻对甘薯的损害，提高甘薯的产量和质量。图1为基因工程操作可能用到的6种限制酶的识别序列(箭头表示切割位点)，图2表示培育抗冻甘薯新品种的流程。回答下列问题：(1)有人认为用不同的限制酶切割DNA形成的片段可能在DNA连接酶的作用下拼接在一起。分析图1信息，概括出支持该观点的两点理由：不同的限制酶切割DNA形成的平末端可以拼接；不同的限制酶切割DNA形

成相同的黏性末端可以拼接。解析：(1)不同的限制酶切割DNA形成的平末端或相同的黏性末端可以拼接，因此用不同的限制酶切割DNA形成的片段有可能在DNA连接酶的作用下拼接在一起。

不同的限制酶切割DNA形成的平末端可以拼接；不同的限制酶切割DNA形成相同的黏性末端可以拼接(2)分析图1信息，进行①过程前，选择限制酶SmaⅠ、XbaⅠ切割质粒P1，选择限制酶EcoRⅤ、SpeⅠ切割抗冻蛋白基因TmAFP，这样可以防止质粒、目的基因自身环化和反向拼接。SmaⅠ、XbaⅠEcoRⅤ、SpeⅠ解析：(2)据图分析可知，为使目的基因能表达出蛋白质，目的基因应插入质粒的启动子和终止子之间，该位置有三种限制酶SmaⅠ、XbaⅠ和HindⅢ的识别序列，目的基因的左端要接在靠近启动子的位置，若切割质粒选择限制酶HindⅢ，则不能使目的基因左端接在靠近启动子的位置，而SmaⅠ和EcoRⅤ切割后产生平末端，XbaⅠ和SpeⅠ切割后产生相同的黏性末端，因此根据目的基因两端的序列，为了成功得到重组质粒P2，确保TmAFP基因插入载体中的方向正确，应选用限制酶SmaⅠ、XbaⅠ切割质粒P1，选用限制酶EcoRⅤ、SpeⅠ切割目的基因。(3)重组质粒P2可能的作用是将

目的基因即TmAFP基因导入Ti质粒的T­DNA区段上。解析：(3)重组质粒P2是由质粒P1与目的基因构建而成的，其作用是将目的基因即TmAFP基因整合到根瘤农杆菌的Ti质粒的T­-DNA区段上，因为Ti质粒的T­-DNA可转移并整合到受体细胞的染色体DNA上，从而便于将目的基因导入甘薯细胞。将目的基因即TmAFP基因导入Ti质粒的T­DNA区段上(4