高三生物一轮复习课件：PCR技术

第十单元

生物技术与工程

PCR技术一、目的基因的筛选与获取聚合酶链式反应它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。模板：原料：能量：酶：DNA的两条母链4种游离的脱氧核苷酸解旋酶、DNA聚合酶等引物：细胞代谢提供的ATPDNA聚合酶不能从头合成子链，使DNA聚合酶从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸一、目的基因的筛选与获取聚合酶链式反应参与的组分在DNA复制中的作用含目的基因的DNA4种脱氧核苷酸耐高温的DNA聚合酶引物（2种）缓冲液Mg2+高温使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸打开DNA双链提供DNA复制的模板合成DNA子链的原料催化合成DNA子链维持反应体系的pH激活DNA聚合酶的活性（PCR所用原料实为dNTP）（体外用高温代替解旋酶）(TaqDNA聚合酶)dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP）功能：①提供原料；②提供能量CHOHHHHHOHHCNNNCCCNH2CHHOPO－OOPO－O～OPO－O～O－CHOHHHOHHOHHCNNNCCCNH2CHHOPO－OOPO－O～OPO－O～O－核糖腺嘌呤脱氧核糖腺嘌呤腺苷腺苷一磷酸(AMP)腺嘌呤核糖核苷酸腺苷二磷酸(ADP)腺苷三磷酸(ATP)

腺嘌呤脱氧核糖核苷酸dADPdATP引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。3’5’DNA母链13’5’DNA母链23’5’DNA母链13’5’DNA母链23’5’引物13’5’引物2引物结合在模板链的3’端子链的5’端向

3’端延伸引物的作用：为DNA聚合酶提供了游离的3′端，使DNA聚合酶从引物的3′端延伸子链。（DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能）一、目的基因的筛选与获取聚合酶链式反应第一步：变性5’--3’3’--5’3’--5’5’--3’待扩增的DNA片段变性（不需要解旋酶）：当温度上升到_______以上时，

断裂，双链DNA解聚为两条

。

氢键单链DNA90℃因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。一、目的基因的筛选与获取聚合酶链式反应第二步：复性3’--5’5’--3’5’--3’-5’3’--5’5’-引物1引物23’--3’复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过

_________________与两条单链DNA结合。

碱基互补配对引物结合在DNA模板链

3’端位置，引导子链从5’端→3’端方向复制由于DNA两条链是反向平行的，序列不同，所以需要2种引物一、目的基因的筛选与获取聚合酶链式反应第三步：延伸5’--3’-5’3’--5’5’-5’--3’-5’3’-3’--5’5’--3’延伸：当温度上升到______左右时，溶液中的4种____________在耐高温的____________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

脱氧核苷酸DNA聚合酶72℃72℃是Taq酶的最适温度Taq酶结合在引物的3’端由dNTP水解供能一、目的基因的筛选与获取聚合酶链式反应5’5’

变性

复性

延伸温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。PCR过程可以在

中自动完成PCR扩增仪一、目的基因的筛选与获取聚合酶链式反应(一）选择合适的引物

2

引物

Ⅱ

、

Ⅲ一、目的基因的筛选与获取聚合酶链式反应PCR技术引物设计的原则：①引物长度：一般在20-30个脱氧核苷酸之间，防止随机结合a.引物过短，会降低扩增特异性（只扩增出目标DNA片段）b.引物过长，会影响扩增特异性，降低扩增效率（单位时间内扩增产物的量）采取措施：提高复性温度，使引物与模板链充分结合一、目的基因的筛选与获取聚合酶链式反应PCR技术引物设计的原则：②引物GC含量：一般在40%~60%之间，GC含量过高或过低都会降低扩增特异性和扩增效率a.GC含量过低，复性（退火）温度低，特异性差b.GC含量过高，容易形成发夹结构，不利于引物与模板DNA结合；还会导致变性解链温度增大，因模板解链不充分导致特异性降低③引物自身及引物之间不应存在互补配对的序列引物自身互补形成发夹状结构引物间互补形成引物二聚体一、目的基因的筛选与获取聚合酶链式反应④引物的5’端可以修饰，而3’端不可以修饰PCR技术引物设计的原则：①引物长度：一般在20-30个脱氧核苷酸之间，防止随机结合②引物GC含量：一般在40%~60%之间，GC含量过高或过低都会降低扩增特异性和扩增效率③引物自身及引物之间不应存在互补配对的序列

√

1和引物4

2和引物3

①第1组：____________________________________________；②第2组：______________________________________________。引物

Ⅰ

和引物

Ⅱ

局部发生碱基互补配对而失效

引物2和引物3

引物过短，则会导致引物特异性太弱，出现非特异性扩增，非目标产物增多一、目的基因的筛选与获取PCR技术相关循环计算：【思考】利用PCR技术扩增目的基因时，至少要经过几次循环产生两条单链等长的目的基因？5’3’5’5’3’5’3’3’第三次循环【思考】PCR扩增的是整个模板DNA分子吗？不是，PCR扩增的是两种引物之间所对应的特定DNA片段PCR技术相关循环计算：第1次扩增长链-中长链DNA____个含有引物A的DNA____个含有引物B的DNA____个211共消耗引物对数：_____对1PCR技术相关循环计算：第2次扩增长链-中长链DNA____个2233中长链-短链DNA____个含有引物A的DNA____个含有引物B的DNA____个共消耗引物对数：_____对3PCR技术相关循环计算：第3次扩增短链-短链DNA______个中长链-短链DNA____个长链-中长链DNA____个含有引物A的DNA____个含有引物B的DNA____个24277共消耗引物对数：_____对7PCR技术相关循环计算：2222202462(n-1)00282n-2n137152n-1PCR技术相关循环计算：2n2482482n1372n-10262n-21372n-1①DNA分子有_____个②总链数_____条③不含引物的链数：___④含引物的链数_____⑤含引物1或2的链数：______⑥仅含引物1的DNA数：______⑦仅含引物2的DNA数：______⑧引物1、2均含有的DNA数：_____⑨不含引物的DNA数：______⑩需要引物的总数：______2n2n+122n+1-2循环n次：2n-1112n-202n+1-2（12）等长链DNA分子数为______个（13）不等长链DNA分子数为____个（14）含模板链DNA分子数为____个2n-2n2n2A．第一轮循环得到2个DNA分子，即①②各1个B．第二轮循环得到4个DNA分子，即①②