人教版高中生物选修一讲义：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

课题2

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1.明确用培养基对微生物进行选择的原理。(重点)

2.学会统计微生物数量的方法。(重点)

3.能进行实验设计与操作，并对实验结果进行分析和评价。(难点)

菌株的筛选及统计菌落数目的

方法

1.筛选菌株的思路

(1)自然界中目的菌株的筛选

①依据•：根据它对生存环境的要求,到相应的环境中去寻找。

②实例：PCR技犬过程中用到的耐高温的7?©DNA聚合酶,就是从热泉中

筛选出来的刀的细菌中提取出来的。

(2)实验室中目的菌株的筛选

①原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，

同时捶制或阻止其他微生物的生长。

②方法：利用选择培养基分离。

a.选择培养基：允许特定独类的微生物生长，同时阻止或抑制其他种类微

生物生长的培养基。

b.实例：选择分解尿素的细菌的培养基，以尿素作为唯一氮源,只有能合

成胭酸的微生物才能分解尿素。

2.统计菌落数目

(1)常用方法：稀释涂布平板法。

当样品的稀释度足够高时,培养基表面

生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的

①原理＜一个活菌

b.通过统计平板上的菌卷数来推测样品中

＜大约含有的活菌数

②计算公式：每克样品中的菌株数=(C・V)XM。

C：代表某一稀释度下平板上生长的壬均趣客数。

v：代表涂布平板时所用的稀释液的傕拉

M：代表稀释倍数。

③注意事项

a.为了保证结果准确，一般设置三个平板，选择菌落数在30〜300的平板

进行计数，并取平均值。

b.统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。原因是当两个或多个细胞连在

一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而只是用

活菌数来表示。

c.设置对照：主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响,提

高实验结果的可信度。

(2)其他方法：利用显微镜直接计数。

［合作探讨］

探讨I：根据选择培养基的原理，如何筛选出耐酸菌？

提示：可将培养基的pH调至酸性，再接种培养。

探讨2：如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？

提示：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平

板上菌落数的平均值，然后按照公式进行计算。

探讨3：稀释涂布平板法和显微计数法对微生物计数产生的实验误差如何？

试分析原因。

提示：稀释涂布平板法计数的值比实际值偏小，原因是当两个或多个细胞连

在一起时，平板上观察到的只是一个菌落；显微计数法计数的结果比实际值偏大，

原因是显微镜下无法区分细胞的死活，计数时包括了死细胞。

［思维升华］

1.选择培养基的选择作用

(1)原理：根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性

不同而制备培养基。

(2)方法:

①在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉

菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。

②改变培养基中的营养成分。例如，缺乏氮源时可以分离固氮微生物；石油

作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物；用含无机碳源的培养基

分离自养型微生物。

③改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境中培养可以得到耐

高温的微生物；用普通培养基在无氧条件下分离外氧型和兼性厌氧型微生物。

2.显微镜直接计数法

(1)原理：此法利用特定细菌计数板或血球计数板，在显微镜下计算一定容

积的样品中微生物的数量。

(2)方法：用计数板计数。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的

面积为1mn?和高为0」mm的计数室，在1mm2的面积里又被划分成25个(或

16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，但计数室都是由400

个小格组成的。如下图所示。

(3)计算公式：每毫升原液所含细菌数=每小格平均细菌数X400X10000X

稀释倍数。

(4)缺点：不能区分细菌的死活。

3.用稀释涂布平板法对微生物进行计数时的注意事项

(1)为了保证结果准确，一般设置3〜5个平板，选择菌落数在30〜30()的平

板进行计数，并取其平均值。

(2)统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，原因是当两个或多个细胞连在

一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活

菌数来表示。

4.直接计数法与间接计数法的比较

微生物生长量的测定有计数法、重量法、生理指标法等，但是一般使用计数

法，计数法可分为直接计数法和间接计数法。二者比较如下:

直接计数法间接计数法

主要用具显微镜、细菌计数板培养基

计数依据菌株本身培养基上菌落数

优点计数方便、操作简单计数的是活菌

缺点死菌、活菌都计算在内操作较复杂，且有一定误差

每毫升原液含菌株数=每毫升原液含菌株数=

计算

400X10000X每小格平平均菌落数X稀释件数

公式所用涂布液的体积(mL)X怖包口数

均菌株数X稀释倍数

1.分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是()

①加尿素②不加尿素③加琼脂④不加琼脂⑤加葡萄糖⑥不加葡

萄糖⑦加硝酸盐⑧不加硝酸盐

A.①③⑤⑦B.②©©⑧

C.©©⑤⑧D.①④⑥⑦

【解析】要分离土壤中分解尿素的细菌，培养基中尿素应是唯一的氮源，

不能加硝酸盐；在固体培养基上形成菌落，要加琼脂作凝固剂：分解尿素的细菌

是异养生物，要加有机碳源(如葡萄糖)。

【答案】C

2.自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它

们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请

回答有关问题：

实验步骤：

(1)制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。

(2)选用法接种样品。

(3)适宜温度下培养。

结果分析：

(1)测定的大肠杆菌数，在对应稀释倍数为1(户的培养基中，得到以下几种统

计结果，正确可信的是()

A.一个平板，统计的菌落数是23

B.两个平板，统计的菌落数分别是22和26,取平均值24

C.三个平板，统计的菌落数分别是21、5和52,取平均值26

D.四个平板，统计的菌落数分别是21、30、24和25,取平均值25

(2)一同学在稀释倍数为1。6的培养基中测得平板上菌落数的平均值为234

那么每毫升样品中的菌株数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.2

mL)。

(3)用这种方法测定密度，实际活菌数量要比测得的数量_______,因为

_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________0

(4)某同学在测定大肠杆菌的密度时发现，在培养基上还有其他杂菌的菌落,

能否肯定该大肠杆菌的品系被污染了？为什么

【解析】实险步骤：(2)若要对大肠杆菌进行计数，常用稀释涂布平板法

接种样品。

结果分析：(1)在选取样品时，应选取多个菌落数相差不大的平板计数，取

其平均值。

平均菌落数,

(2)每亳升样品中菌株数=种释液体积X稀释倍数即23.4^0.2X106=

1.17X108。

(3)由于菌落可能由1个或多个细菌连在一起生长而成的，所以实际活菌数

量比测得数量多。

(4)污染的原因可能是培养基灭菌不彻底或接种过程操作不当。

【答案】实验步骤：(2)稀释涂布平板

结果分析：(1)D(2)1.I7X1O8(3)多当两个或多个细胞连在一起时，平

板上观察的是一个菌落(4)不能。因为不能排除杂菌来自培养基或培养过程

实验设计及操作提示

1.实验设计

(1)

①取样原因：土壤有“微生物的天然培

养基”之称。同其他生物环境相匕，土壤

中的微生物,数量最大,种类最多

②土壤要求:富含TT机质,DH接近中性

且潮湿

③取样部位：距地表约3〜8cm的土壤层

准备选择培养基，以尿素为唯

氮源制备9个平板培养基

⑶

①稀释原因：样品的稀释程度直接影响

平板上生长的菌落数目

②稀释标准：选用一定稀释范围的样品

液进行培养，保证获得菌落数在30〜30()

之间，便于计数

③稀释倍数：测定土壤中细菌的数量，一般

选用10\HA和HA倍的稀释液进行平板

培养；测定放线菌的数量，一般选用103、

和1()5倍稀释；测定真菌的数量,一般

选用102、103和］()4倍稀释

(4)

在上述培养基的9个平板底面，每三个一组

分别用记号笔写上104、1()5、1()6倍的三种稀

释液，然后用三支1mL无菌吸管分别从104、

1。5、1()6倍的三管土壤稀释液中吸取0.1mL

对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌涂

布器在培养基表面轻轻地涂布均匀

(5)

①培养：不同种类的微生物，往往需要

▲不同的培养温度和培养时间

/口一②观察：每隔24h统计一次菌落数目，最

后选取菌落数目稳定时的记录作为结果

(6)

当菌落数目稳定时，取同一稀释度下的3个

平板进行计数，求出平均值,并根据所对应

的稀释度计算出样品中细菌的数目

2.操作提示

(1)无菌操作

①取土样的用具在使用前都需要灭菌。

②应在火焰旁称取土壤,并在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉

塞。

③在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。

(2)做好标记：本实验使用的平板和试管比较多。为避免混淆，最好使用前

就做好标记。

(3)制定计划：对于耗时较长的生物实验，要事先制定计划,以便提高工作

效率。

3.菌种鉴定

(1)原理：分解尿素的细菌合成的喔酶将尿素分解为氨，使培养基的碱性增

强。

(2)方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指

示剂变组，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。

［合作探讨］

探讨1：为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？当测定时为什么要

将稀释的范围放宽一些？

提示：这是因为土壤中各类微生物的数量(单位：株/kg)是不同的；为确保能

从中选择出菌落数在30〜300之间的平板进行计数o

探讨2：在稀释涂布平板法中，为何需涂布3个平板？

提示：作为重复实验，统计时取平均值，以减少偶然因素对实脸结果的影响，

增强实验结果的说服力。

探讨3：统计菌落数目的理论依据是什么？

提示：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品

稀释液中的一个活菌。

探讨4：为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？

提示：尽量缩小统计的菌落数与实际活菌数的差值，因为繁殖慢的菌体开始

看不由明星的菌落。

［思维升华］

1.分离尿素分解菌操作中的注意事项

(1)在实验操作中，每个步骤都要注意无菌操作，以防培养基被污染，影响

实验效果。

(2)样品稀释液的最佳浓度为获得每个平板上有30〜300个菌落，细菌一般

为10八105、106倍的稀释液，放线菌一般为103、［04、105倍的稀释液，真菌一

般为IO?、1()3、1()4倍的稀释液。

(3)为排除非测试因素(培养基)的干扰，实验需设置牛肉膏蛋白陈培养基进行

空白对照。

(4)每一稀释倍数的菌液都至少要涂布3个平板，作为实验重复，求其平均

值，若其中有菌落数与其他实验差距悬殊的，需要对该平板重新制作。

(5)注意培养时间和温度，获取准确的菌落数。细菌：30〜37C,培养1〜2

d；放线菌：25〜28℃,培养5〜7d；霉菌(真菌)：一般在25~28℃,培养3〜

4do

(6)微生物的菌落特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面，仔

细观察分离到的菌落，记录它们的特征。

(7)做好标记

本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，最好在使用前就做好标记。

(8)规划时间

对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提高工作效率，在操作时

更加有条不紊。

2.结果分析与评价

内容结果分析

对照的培养皿中无菌落生长一未被杂菌污染

培养基中菌落数偏高一被杂菌污染

有无杂菌污染的判断

菌落形态多样，菌落数偏高一培养物中混入其他

杂菌

牛肉膏蛋白腺培养基的菌落数目大于选择培养基

选择培养基的筛选作用

的数目一选择培养基具有筛选作用

得到2个或2个以上菌落数目在30〜300的平

样品的稀释操作

板•操作成功

重复组的结果若选取同一种.土样，统计结果应接近

i.下列是关于“检测d:壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是

()

A.用蒸僧水配制牛肉膏蛋白腺培养基，经高温、高压灭菌后倒平板

B.取10,105、106倍的土壤稀释液和无菌水各01mL,分别涂布于各组

平板H

C.将实验组和对照组平板倒置，37℃恒温培养24〜48h

D.确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数

【解析】检测细菌总数，用蒸储水配制培养基，常用高压蒸汽灭菌法灭菌

后，取10\[05、106倍的土壤稀释液和无菌水各0]mL,分别涂布于各组平板

上，将实验组和对照组放置在适宜条件下培养，在确定对照组无菌后，选择菌落

在30〜300的平板为代表进行计数，D错误。A是培养基的灭菌方法，B设置了

一系列对照实验，C是细菌的培养方法，A、B、C三个选项均是正确的。故选D。

【答案】D

2.关于土壤中细菌的分离，下列正确的操作步骤是（）【导学号：

05520014]

①土壤取样②称取10g土壤，加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中③吸

取0.1mL进行平板涂布④依次稀释至IO1、IO?、103、104、105、吐6、故倍

A.①一一一

B.①一一一

C.①一"②一->③

D.①一一一

【解析】在分离土壤中某种细菌时，应先选取土样（1（）g）,然后加无菌水

获得士康浸出液，并进行不同倍数稀释，最后将稀释液涂布到培养基表面进行培

养，并分离和计数。故选C。

【答案】C

3.可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是（）

A.以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂

B.以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂

C.以尿素为唯一氮源的培养基中加入苏丹川试剂

D.以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩胭试剂

【解析】在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌

后，如果pH升高，指示剂将变红，则我们可确定该种细菌能够分解尿素。故正

确答案为Ao

【答案】A

1.土壤中的细菌能分解尿素，是因为它们能合成一种（）

A.尿素酶B.胭酶

C.蛋白酶D.肽酶

【解析】能够分解利用尿素的细菌，其细胞内含有腺酶，可以把尿素分解

成氨，然后进一步利用。

【答案】B

2.为了从土壤中分高出尿素分解菌，某同学按照下列配方配制培养基，下

列叙述中，错误的是()

培养基成分质量

KH2Po41.4g

Na2HPO42.lg

MgSO4-7H2O0.2g

葡萄糖10.0g

尿素1.0g

水定容到1000mL

A.该培养基缺少琼脂

B.该培养基中，尿素是唯一的氮源

C.该培养基属于选择培养基

D.需要用刚果红染色法对分离的细菌进行鉴定

【解析】该培养基的目的是分离尿素分解菌，所以应为固体培养基，配方

中应该有琼脂成分，A正确：由于该培养基用于分离尿素分解菌，所以尿素应为

唯一的氮源，且培养基的种类为选择培养基，B、C正确；刚果红染色法可用于

鉴定纤维素分解菌，以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂可对分离的细

菌进行鉴定，故D错误。

【答案】D

3.在做分离分解尿素的细菌实验时，A同学从对应1()6倍稀释培养基上筛

选出大约15()个菌落，而其他同学只选择出大约5()个菌落。A同学的结果产生

原因不可能有()

A.由于土样不同B.由于培养基污染

C.由于操作失误D.没有设置对照

【解析】实验结论是否正确与是否设置对照有直接关系，但实验结果与是

否设置对照无关。

【答案】D

4.饲养动物常用的植物饲料中含有难溶的植酸钙等物质，很难被动物吸收

利用，还影响对其他营养物质的利用。若在饲料中添加植酸酶，则能催化其水解

成为可以吸收利用的磷酸盐等。下图是学生们从作物根部土壤中分离产植酸悔的

菌株的过程。

（1）分离产植酸酶的菌株，需先配制合适的培养基。配制培养基时，在各成

分都溶化后和分装前，要进行的是__________和灭菌。对培养基进行灭菌的常用

方法是____________o倒平板时，一般需冷却至50℃左右，在酒精灯火焰附近

操作。据物理性质，该培养基属于培养基。依功能看，该培养基属于

________培养基。

（2）接种以前进行的一系列稀释操作，目的是在培养皿表面形成,

这种接种方法是o根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，

统计平板上的菌落数就能大致推测出样品中的活菌数。如果一培养基上有3个菌

落，则1g土壤中大致的活菌数量是________个。

（3）由于植酸钙的不溶解性，可使培养基形成白色浑浊。产植酸酶的菌株会

水解植酸钙，菌落的周围将形成透明的区域，根据透明区域的有无，可初步判断

该菌是否产植酸酶。实验结果显示A〜E五种菌株中，是产植酸酶的理

想菌株。

【解析】（1）配制培养基时，在各成分都溶化后和分装前，要进行的是调

整pH和灭菌；对培养基灭菌的常用方法是高压蒸汽灭菌法；根据