CN116144600B 一种表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡及其制备方法和应用 （中山大学·深圳）

ProgrammableCatalysisMediate段.LiposomalVesicleforEffecdeliverytowardSynergisticFeApoptosisTherapyofHepatocellu一种表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡本发明公开了一种表达转铁蛋白的细胞膜可结合肿瘤细胞中转铁蛋白受体TFRC靶向肿瘤2ProgrammableCatalysisMediate3过电转实现药物包载，从而制备成载药纳米囊泡，再与Fe3+在36～38℃条件下共孵育25~4.根据权利要求1～3任一所述肿瘤靶向药物制剂，其特S1.在分泌型转铁蛋白基因序列N端插入一段跨膜蛋白基因序列，并带上绿色荧光标S2.提取步骤S1膜上稳定过表达转铁蛋白的细胞系的细胞膜，通过挤压出泡的方式制5.权利要求1～3任一所述肿瘤靶向药物制剂在4节机制不断在丰富，但经典的两条分子机制还是谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathion5培养基中添加铁结合的转铁蛋白或生物可利用铁(如柠檬酸铁铵)，而不添加其他二价金[0007]本发明的第二个目的在于提供所述表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡的制备[0009]本发明的第四个目的在于提供所述表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡或载铁治疗的安全性和有效性而受到越来越多的关注。细胞外囊泡是由活细胞产生的异质膜囊[0014]而本申请通过基因工程改造，提供了一种膜表面高表达转铁蛋白的纳米囊泡(TF6[0023]S2.提取步骤S1膜上稳定过表达转铁蛋[0028]本发明还提供一种载铁纳米囊泡(TF_Fe3+NVs)，的细胞膜仿生纳米囊泡及负载在其表面的Fe3+。所述TF_Fe3+NVs能够显著抑制肿瘤细胞的[0029]所述TF_Fe3+NVs的制备方法为将TFNVs与Fe3+在36～38℃条件下共孵育25~[0030]本发明还提供上述任一所述表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡或载铁纳米囊纳米囊泡(TFNVs)或载铁纳米囊泡(TF_Fe3+NVs)作为药物载体及包载在纳米囊泡内的抗肿瘤药物。即载药纳米囊泡(药物@TFNVs)或载铁与载药联合给药纳米囊泡(药物@TF_Fe3+[0033]所述载铁与载药联合给药纳米囊泡(药物@TF_Fe3+NVs)的制备方法为将载药纳米7通过纳米囊泡具有的诱导肿瘤细胞铁死亡功能配合其它的诱导肿瘤细胞发生铁死亡的肿[0038]本发明提供了表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡及一系列衍生化的表达转铁内成像仪检测了Cy5.5标记的TFNVs和293TNVs在小鼠体内分布情况，可以看到TFNVs能resistancecells；说明TF_Fe3+NVs、SOR@TF_Fe3+NVs能够显著抑制肿瘤细胞的增殖和生8(NM_001063.4)N端插入一段跨膜蛋白基因序列(FIBCD1)，采用pLV_puro_GFPSpark载体使毒感染方式成功构建出膜上稳定过表达TF的HEK_293T细胞(293T_TF_GFP)，并在荧光显微[0050]ATGAGGCTCGCCGTGGGAGCCCTGCTGGTCTGCGCCGTCCTGGGGCTGTGTCTGGCTGTCCCTGATAAAACTGTGAGATGGTGTGCAGTGTCGGAGCATGAGGCCACTAAGTGCCAGAGTTTCCGCGACCATATGAAAAGCGTCATTCCATCCGATGGTCCCAGTGTTGCTTGTGTGAAGAAAGCCTCCTACCTTGATTGCATCAGGGCCATTGCGGCAAACGAAGCGGATGCTGTGACACTGGATGCAGGTTTGGTGTATGATGCTTACCTGGCTCCCAATAACCTGAAGCCTGTGGTGGCAGAGTTCTATGGGTCAAAAGAGGATCCACAGACTTTCTATTATGCTGTTGCTGTGGTGAAGAAGGATAGTGGCTTCCAGATGAACCAGCTTCGAGGCAAGAAGTCCTGCCACACGGGTCTAGGCAGGTCCGCTGGGTGGAACATCCCCATAG9[0052]GCCAATTTCT[0053]CCCCAGCTGTG[0054]TACTTCGGCT[0055]GTGGCCTTTG[0057]AGATGAATAC[0059]AGGCCCAGGAA[0060]GCTCTCCTCA[0062]TCACTGCCAT[0064]CAAGTGTGAT[0066]ATGCCATGAG[0067]TGGTGCCTGTC[0070]GGCAGAACCG[0071]AACCACTGCA[0076]GAAAAAGACT[0077]GGAGTATGCG[0079]CACCTATTTG[0080]CGGTCGGAAA[0081]AAACTTCATG[0082]AAGGCTGTTG[0085]ATGGTCCACGAGCGGTGGAAGACCGTGGGCAGCGCGTCCCAACTTGAGGACCGACCGCGCGACAAACCGCAGCGAGCAAGCTGCAGTTATGTCCTGTGCACGGTGCTCCTGTCCCTTGCGGTGCTGCTGGCGGTGGCTGTCACC们利用透射电子显微镜(TEM)对纳米囊泡的形态进行了观察，发现大多数纳米囊泡颗粒呈(DLS)分析纳米囊泡的粒径分布范围，从粒径分布图(图1通过Westernblot分析了293T细胞、293T纳米囊泡、293T_GFP细胞、293T_GFP纳米囊泡、们提取了293T细胞(NC)及293T_TFRC_OFP细胞的RNA进行qPCR检测，结果显示293T_TFRC_OFP细胞的TFRCmRNA的水平是正常HEK293T细胞的200流式细胞仪检测了的TFNVs在TFRC受体过表达、敲低表达和正常表达的人肝癌细胞HepG2中的内吞情况，结果显示TFRC过表达的HepG2细胞在6h时TFNVs内吞率达88正常HepG2细胞为55均远高于敲低TFRC表达HepG2细胞的43说明TFRC的表达量越高，TFNVs的(图3A)，①TFNVs与Fe3+在37℃条件下共孵育30min制备成载铁纳米囊泡TF_Fe3+NVs；制备成载药纳米囊泡SOR@TFNVs；③载药纳米囊泡SOR@TFNVs与Fe3+在37℃条件下共孵育果显示TFNVs与铁离子的结合率能够达到90％左右(图3B)。同时，我们将载药纳米囊泡SOR@TFNVs进行超声破碎，离心后取药物上清检测到药物的包封率在35优于其他纳米囊泡10％_25％的药物包封率(图3C)。为了验证衍生化的TFNVs是否会对纳米囊泡的结构的粒径主要分布在160nm左右(图3D)，说明无论是载铁还是包载药物均不会对囊泡的大小TFRC受体并被受体内吞进入细胞(图3F)。随后，我们利用流式细胞仪检测了的衍生的TF胞系HepG2_SR(HepG2sorafenib_resistantcells)也表现出优良的肿瘤抑制效果(图肝癌一线用药索拉菲尼SOR也被证实能够诱导肿瘤细胞发生铁死亡。为了进一步验证TFNVs发挥肿瘤抑制作用是通过诱导肿瘤细胞铁死亡(图4A)，我们通过qPCR分析了肝癌细胞果显示TF_Fe3+NVs、SOR@TFNVs均能显著诱导ACSL4的差异表达，而且SOR@TF_Fe3+NVs组ACSL4mRNA的表达水平是最高的(图4B)。我们进一步通过流式细胞术检测了肝癌细胞系、显示仅铁死亡抑制剂能够挽救SOR@TF_Fe3+NVs导致的肿瘤细胞生长抑制(图4E)，说明SOR@[0097]在中山大学动物实验中心平台上购买6_8周龄的SPF级BALB/c_nu小鼠，于中山大学东校区动物实验中心无菌环境中饲养。首先将皮下移植瘤(HepG2)模型小鼠随机分为73+组(3mg/kg)、TF_Fe3+观察囊泡对正常脏器的影响，切片结果显示TFNVs等一系列衍生纳米囊泡对小鼠心、肝、纳米囊泡SOR@TF_Fe3+NVs。本发明研究显示TFNVs及衍生化的TFNVs可结合肿瘤细胞中转TFN