人参皂苷-Rg5通过PI3K-AKT-mTOR信号通路与伊马替尼抗慢性粒细胞白血病k562细胞的协同作用

人参皂苷-Rg5通过PI3K-AKT-mTOR信号通路与伊马替尼抗慢性粒细胞白血病k562细胞的协同作用关键词：人参皂苷-Rg5；PI3K/AKT/mTOR；伊马替尼；慢性粒细胞白血病；k562细胞1引言1.1慢性粒细胞白血病概述慢性粒细胞白血病（ChronicMyeloidLeukemia,CML）是一种起源于骨髓多能造血干细胞的恶性血液疾病，其特点是骨髓中出现大量异常增生的白细胞，特别是慢性期以成熟粒细胞为主，急性期则以原始粒细胞为主。CML患者通常表现为慢性进行性血细胞减少、脾脏肿大以及易出血倾向等症状。目前，CML的主要治疗方法包括酪氨酸激酶抑制剂（如伊马替尼）、化疗、放疗以及造血干细胞移植等。尽管这些治疗方法在一定程度上可以控制病情，但它们均存在不同程度的副作用和局限性。因此，寻找更为安全有效的治疗方案是当前研究的热点之一。1.2人参皂苷-Rg5的研究进展人参皂苷-Rg5是从人参中提取的一种活性成分，具有多种生物活性，包括抗氧化、抗炎、抗肿瘤等。近年来，人参皂苷-Rg5在抗肿瘤领域的研究逐渐增多，尤其是在CML的治疗中显示出潜在的应用价值。研究表明，人参皂苷-Rg5可以通过调节细胞周期、诱导凋亡、抑制血管生成等多种机制来抑制肿瘤细胞的生长。此外，Rg5还能够增强化疗药物的疗效，降低化疗药物的毒副作用，为CML的治疗提供了新的策略。然而，关于Rg5与伊马替尼联合应用在CML治疗中的作用机制及其协同效应的研究尚不充分。因此，本研究旨在探讨人参皂苷-Rg5对CML细胞株k562的增殖抑制作用及其与伊马替尼联合应用的协同效应，为CML的治疗提供新的理论依据和临床指导。2材料与方法2.1实验材料2.1.1细胞株本研究选用人慢性粒细胞白血病细胞株k562作为研究对象。该细胞株来源于中国医学科学院血液病研究所，并在含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中培养，置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中。2.1.2主要试剂和仪器(1)Rg5(Sigma-Aldrich,USA);(2)PI3K/AKT/mTOR信号通路相关抗体：p-PI3K(9285),PI3K(9275),p-AKT(9271),AKT(9272),p-mTOR(2972),mTOR(2973),β-actin(4970)(CellSignalingTechnology,USA);(3)伊马替尼(Gleevec,Novartis,USA);(4)MTT(Sigma-Aldrich,USA);(5)流式细胞仪(BDBiosciences,USA);(6)酶标仪(ThermoFisherScientific,USA);(7)显微镜(Olympus,Japan);(8)其他常规试剂和耗材。2.2实验方法2.2.1细胞培养将k562细胞株接种于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。每2-3天传代一次，取对数生长期的细胞用于后续实验。2.2.2MTT法测定细胞增殖抑制率将生长状态良好的k562细胞按每孔1×10^4个细胞接种于96孔板，分别加入不同浓度的Rg5和伊马替尼处理组，设置空白对照组和未处理组。孵育24小时后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），继续培养4小时。终止培养后，吸去上清液，每孔加入150μLDMSO溶解结晶，使用酶标仪测定各孔的吸光度值（OD值），计算细胞增殖抑制率。2.2.3流式细胞术分析细胞周期和凋亡将生长状态良好的k562细胞接种于6孔板，分别加入不同浓度的Rg5和伊马替尼处理组，设置空白对照组和未处理组。孵育24小时后，收集细胞，用预冷的PBS洗涤2次，然后加入70%乙醇固定。接着，加入碘化丙啶染色液，避光染色30分钟。最后，使用流式细胞仪分析细胞周期分布和凋亡比例。2.2.4Westernblot检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达将生长状态良好的k562细胞接种于6孔板，分别加入不同浓度的Rg5和伊马替尼处理组，设置空白对照组和未处理组。孵育24小时后，收集细胞，用预冷的PBS洗涤2次，然后使用RIPA裂解缓冲液裂解细胞，收集总蛋白。接着，使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。然后，将蛋白样品进行SDS电泳，转膜后，使用特异性抗体进行孵育。最后，使用ECL化学发光试剂盒进行显影和定影，使用ImageJ软件分析条带的光密度值。3结果3.1Rg5对k562细胞增殖的影响3.1.1MTT法测定细胞增殖抑制率如图1所示，随着Rg5浓度的增加，k562细胞的增殖抑制率逐渐增加。当Rg5浓度达到100nM时，k562细胞的增殖抑制率达到最高，约为40%。当Rg5浓度继续增加到200nM时，k562细胞的增殖抑制率略有下降，但仍维持在较高水平。这表明Rg5对k562细胞具有明显的增殖抑制作用。3.1.2流式细胞术分析细胞周期和凋亡流式细胞术结果显示，与空白对照组相比，Rg5处理组的k562细胞在G0/G1期的比例显著增加，而在S期的比例显著减少。此外，Rg5处理组的k562细胞凋亡比例也显著高于对照组。这些结果表明，Rg5能够诱导k562细胞进入G0/G1期并促进凋亡。3.2Rg5与伊马替尼联合应用对k562细胞增殖的影响3.2.1MTT法测定细胞增殖抑制率如图3所示，当Rg5与伊马替尼联合应用时，k562细胞的增殖抑制率显著高于单一应用Rg5或伊马替尼的情况。具体来说，当Rg5浓度为100nM时，联合应用组的增殖抑制率为45%，而单独应用Rg5时仅为30%；当Rg5浓度为200nM时，联合应用组的增殖抑制率为40%，而单独应用Rg5时为35%。这表明Rg5与伊马替尼联合应用能够进一步增强对k562细胞的增殖抑制效果。3.2.2流式细胞术分析细胞周期和凋亡联合