CN118068012B 人膜性肾病相关指标检测试剂盒及其方法和应用 （杭州赛基生物科技股份有限公司）

道龙潭路7号未来研创园第3幢5层人膜性肾病相关指标检测试剂盒及其方法本发明提供了一种人膜性肾病相关指标检测试剂盒及其方法和应用，针对PLA2R抗原和THSD7A抗原的编码核苷酸序列进行多次突变筛并优化了PLA2R抗原和THSD7A抗原制备纯化过程中的透析液配方，以及PLA2R抗原和THSD7A抗原的保存液配方，制备得到高纯度的PLA2R抗原和THSD7A抗原，并最大程度解决了PLA2R抗原和能显著提高检测的准确性和灵敏度，控制批间2的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示；所述人膜性肾病相关指标包括PLA2R抗体和THSD7A抗2.如权利要求1所述的人膜性肾病相关指标检测试剂的编码核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，THSD7A抗原的编码核苷酸序列如SEQIDNO:4所3.如权利要求2所述的人膜性肾病相关指标检测试剂盒，其特征在于，还包括检测抗4.如权利要求3所述的人膜性肾病相关指标检测试剂盒，其特征和THSD7A抗原分别与微球偶联，制备成偶联微球的PLA2R抗原溶液和偶联微球的THSD7A抗步骤(1)、分别制备PLA2R抗原和THSD7A抗原；所述PLA2R步骤(2)、所述PLA2R抗原用第一抗原透析液进行透析，制得PLA2R抗原溶液；所述采用含有第二抗原保存液的THSD7A抗原溶液制备偶联微球的THSD78.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述分别制备PLA2R抗原和原的核苷酸序列的重组载体，经真核表达系统表达，制备重组PLA2R抗原和重组THSD7A抗3步骤(b)、将稀释后的样品、偶联微球的PLA2R抗原溶液和偶4成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的抗磷脂酶A2抗体MN可分为特发性膜性肾病(idiopathicmembranousnephropathy，IMN)与继发性膜性肾病(secondarymembranousnephr多数学者认为PMN是一种抗体介导的自身免疫性肾小球疾病，位于足细胞的靶抗原被自身急性肾损伤致病过程。2009年，Beck等在特发性膜性肾病(idiopathicmembranous[0006]1型血小板反应蛋白7A域(Thrombospondintype_1domain_containing7A，5筛查呈阴性的患者进行抗THSD7A抗体检测中发现，有2.5％_5％的患者血清中存在抗[0008]检测PLA2R和THSD7A需要用到PLA2R抗原和THSD7A抗原，但是PLA2R抗原和THSD7A后的核酸分子插入真核表达载体分别制得重组获得PLA2R抗原和THSD7A抗原，筛选最优的PLA2R抗原和THSD7A抗原的信号肽的氨基酸序列，能显著改善非特异性反应导致的交叉影[0015]进一步地，所述PLA2R抗原和THSD7A抗原分别与微球偶联，制备成偶联微球的6[0019]步骤(3)、采用含有第一抗原保存液的PLA2R抗原溶液制备偶联微球的PLA2R抗原[0022]通过优化PLA2R抗原和THSD7A抗原的抗原透析液和抗原保存液，能更好地解决偶联微球的PLA2R抗原溶液和偶联微球的THSD7A抗原溶液都能够长期稳定保存，并有助于[0023]进一步地，步骤(1)所述分别制备PLA2R抗原和THSD7A抗原：分别构建含有编码存液包括第一抗原保存液和第二抗原保存液，所述第一抗原保存液用于保存偶联微球的7析液包括第一抗原透析液和第二抗原透析液，所述第一抗原透析液用于透析制备PLA2R抗[0032]本发明提供的基于流式细胞仪检测人膜性肾病相关指标的试剂盒及其方法和应限达到4RU/mL，空白限不高于0.4RU/mL；THSD7A的检测下限达到3ng/mL，空白限不高于[0036]3、优化PLA2R抗原和THSD7A抗原的抗原透析液配方和抗原保存液配方，解决了偶联微球的PLA2R抗原溶液和偶联微球的THSD7A抗原溶液都能够长期稳定保存，可稳定保8[0053]PLA2R抗原和THSD7A抗原的重组蛋白N端包含高效的信号肽序列和由10个组氨酸构成的His_tag纯化标签，均使用pcDNA3.4载体和Expi293F细胞表达系统进行瞬时转染表[0054]瞬时转染表达：转染当天将处于对数生长期的Expi293F细胞密度调整到2.5×106/mL，使用的培养基为Expi293TM表达培养基(赛默飞世尔科技(中国)有限公司，[0056]使用Ni_NTA亲和层析介质(金斯瑞公司，货号L00250)纯化，使用平衡液(300mM11001303)阴离子交换层析柱，用缓冲液A平衡，用缓冲液B(1MNaCl,20mMTris_HCl,pH述的方法表达和纯化重组蛋白PLA2R，在第一透析液中透析19[0063]第二透析液的配制：将5.882g柠檬酸钠二水，1g牛血清白蛋白，10mL甘露醇，[0064]第二保存液的配制：将5.882g柠檬酸钠二水，1g牛血清白蛋白，10mL甘露醇，液清洗2次，在清洗后的第一荧光微球中加入10PLA2R抗原溶液室温旋转反应5小时，清洗第一荧光微球去除多余抗原后加入质量分数为[0067]按照同样方法，采用荧光微球(厂家Biolegend，型号740170)配制偶联微球的体与藻红蛋白的质量比为1:1，抗人IgG抗体购买自迈迪安生物科技有限公司，货号100ng/mL、190ng/mL)的PLA2R抗体(厂家CREATIVEDIAGNOSTICS，型号CABT_B2145)及[0082](b)向样本管中分别加入20μL所述偶联微球的抗原溶液和20μL稀释后的待测样在室温下避光孵育0.5h；将避光孵育后得到的待检测复[0084](d)用100μL洗涤缓冲液(1×)重悬所得沉淀，在贝克曼公司生产的DxFLEX流式细[0086]图1为人膜性肾病相关指标检测试剂盒的检测原理示意图，其中1为微球，2为抗合体结合形成免疫复合体，流式细胞仪发射的两束不同波长激发光照射所述免疫复合体，(forwardscatter,FSC)通道荧光信号值为纵坐标，THSD7A抗原的聚苯乙烯微球的前向角散射光通道荧光信号值和别藻蓝蛋白通道荧光信号图3为本实施例的流式荧光检测抗PLA2R抗体的校准曲线，图4为本实施例的流式荧光检测[0092]线性选取线性范围上限的高浓度样本稀释成至少7个不同浓度的样本，每个浓度6为本实施例THSD7A线性评价结果。参照图5、图6，PLA2R线性回归方程为y＝1.0838x+[0093]采用本发明的人膜性肾病相关指标检测试剂盒，可以检测到的PLA2R线性区间不空白限为M+2SD。表4为本实施例空白限结果。参照表4，PLA2R、THSD7A空白限分别为：[0107]使用本实施例中的试剂盒检测健康人样本50例与PLA2R阳性样本39例、THSD7A阳20.565[0114]PLA2R抗原(Uniprot编号Q13018)的胞外区全长序列由10个结构域组成，如表5所[0117]根据已知文献资料来选取部分结构域：RicinB_typelectin、Fibronectintypelectin7、C_typelectin8。其中大部分血清样本本专利首次以两段GS连接子和一段α螺旋结构多肽(GGGSAEAAAKEAAAKASGGG)来连接那些在NO:1)可表示为：信号肽序列+His_tag+RicinB_typelectin+(GGGSAEAAAKEAAAKASGGG)+C_typelectin1+(GGGSAEAAAKEAAAKASGGG)+C_typelectin7+C_typelectin8。使用(GGGSAEAAAKEAAAKASGGG)+C_typelectin1+(GGGSAEAAAKEAAAKASGGG)+C_typelectin7(GGGSAEAAAKEAAAKASGGG)+C_typelectin1+C_typelectin2+(GGGSAEAAAKEAAAKASGGG)+C_typelectin4+C_typelectin5+(GGGSAEAAAKEAAAKASGGG)+C_typelectin7+C_type(GGGSAEAAAKEAAAKASGGG)+C_typelectin1+(GGGSAEAAAKEAAAKASGGG)+C_typelectin7+(GGGSAEAAAKEAAAKASGGG)+C_typelectin8(氨基酸序列SEQIDNO:10，核苷酸序列SEQ[0124]分别检测健康人样本50例与PLA2R阳性样本39例，比较5种不同PLA2R抗原重组蛋PLA2R抗体检测SEQIDNO:3SEQIDNO:7SEQIDNO:9SEQIDNO:11SEQIDNO:13灵敏度84.6%76.9%82.05%特异性准确度93.3%88.76%92.13%86.52%%76.4%[0130]比较第1～3种可以看出，RicinB_typelectin、C_typelectin1、C_typelectin7、C_typelectin8这四个结构域足够使重组蛋白能够被几乎所有血清样本中的[0131]比较第1种和第4种可以看出，虽然都采用同样的四个结构域，但是在结构域C_typelectin7和C_typelectin8之间不用GS连接子和[0136]使用以上除Coiledcoil外21个单独的结构域(Coiledcoil人体中常见，无法形[0139]根据不同结构域单独检测阳性样本结果，TSPtype_11/TSPtype_12/TSPTSPtype_114/TSPtype_115/TSPtype_118/TSPtype_119/TSPtype_120/TSPtype_121这14个结构域中的一个或多个能被现有的阳性血清样本识别(测得阳性样本的列(SEQIDNO:14)和由10个组氨酸构成的His_tag纯化标签。例如构建的重组蛋白氨基酸序列(SEQIDNO:2)可表示为：信号肽序列+His_tag+TSPtype_11+TSPtype_12+(GGGSAEAAAKEAAAKASGGG)+TSPtype_19+TSPtype_110。使用https://[0141]1、4个结构域：信号肽序列+His_tag+TSPtype_11+TSPtype_12+(GGGSAEAAAKEAAAKASGGG)+TSPtype_19+TSPtype_110(氨基酸序列SEQIDN[0142]2、10个结构域：信号肽序列+His_tag+TSPtype_11+TSPtype_12+(GGGSAEAAAKEAAAKASGGG)+TSPtype_15+(GGGSAEAAAKEAAAKASGGG)+TSPtype_17+(GGGSAEAAAKEAAAKASGGG)+TSPtype_19+TSPtype_110+(GGGSAEAAAKEAAAKASGGG)+TSPtype_114+TSPtype_13+Coiledcoil+(GGGSAEAAAKEAAAKASGGG)+TSPtype_16+TSPtype_17++(GGGSAEAAAKEAAAKASGGG)+TSPtype_118+TSPtype_119+TSPtype_120+TSPtype_1[0144]4、4个结构域：信号肽序列+His_tag+TSPtype_11+(GGGSAEAAAKEAAATSPtype_12+(GGGSAEAAAKEAAAKASGGG)+TSPtype_19+(GGGSAEAAAKEAAAKASGGG)+TSP[0146]分别检测健康人样本50例与THSD7A阳性样本30例，比较5种不同THSD7A抗原重组THSD7A抗体检测SEQIDNO:4SEQIDNO:16SEQIDNO:18SEQIDNO:20SEQIDNO:22灵敏度93.3%83.3%83.3%73.3%特异性准确度96.3%83.6%[0150]根据表9可以看出，采用不同序列的THSD7A重组蛋白之间的实验结果具有显著性准确度，其原因可能是天然序列中的连接肽比人工连接肽更利于蛋白形成正确的折叠结[0153]本实施例按照实施例1提供的方法制备人膜性肾病相关指标检测试剂盒，其中在PLA2R抗原的制备过程中，分别采用如表10_1所示的6种不同抗原透析液以及实施例1中采指标检测试剂盒，用于PLA2R的检测，待测样品为阳性血清(经质谱检测PLA2R浓度为进一步筛选，才能达到更好的检测灵敏度，而且采用不同第一抗原透析液制备的PLA2R抗[0160]对比采用不同抗原透析液制备的PLA2R抗原，其用于PLA2R检测的灵敏度存在不配制的：三羟甲基氨基甲烷+牛血清白蛋白+甘露醇+L_组氨酸+氯化钠+乙二胺四乙酸二钠[0162]本实施例按照实施例1提供的方法制备人膜性肾病相关指标检测试剂盒，其中在施例1提供的方法制备成微球偶联的抗原溶液，制备成相应的人膜性肾病相关指标检测试清白蛋白+甘露醇+L_甘氨酸+氯化钠+乙二胺四乙酸二钠盐二水+二硫苏糖醇+4_(2_氨乙抗原和THSD7A抗原在制备完成后需保存在抗原保存液中，在研究初期，对PLA2R抗原和校准品(10ng/mL)检测THSD7A抗原的活性检测结果如表[0179]根据表12可以看出，第一组/第二组的PLA2R抗原和THSD7[0181]由于PLA2R抗原和THSD7A抗原存在稳定性问题，因此本实施例还尝试在制备获得PLA2R抗原和THSD7A抗原的当天立即进行偶联微球的PLA2R抗原溶液和偶联微球的THSD7A完成制备后立即添加抗原保存液来提高PLA2R抗原和THSD7A抗原的稳定性，从而也能提高[0190]本实施例经研究证明，PLA2R抗原和THSD7A抗原需要分别采用不同的抗原保存液[0192]本实施例按照实施例1提供的方法制备