CN119193789B 一种同片无偏方式结合空间转录组与crispr筛选的方法及其在基因功能验证中的应用 （北京大学）

WO2024123127A1,2024.06一种同片无偏方式结合空间转录组与CRISPR筛选的方法及其在基因功能验证中的应用本发明公开了一种同片无偏方式结合空间转录组与CRISPR筛选的方法及其在基因功能验出阳性感染的目标细胞并培养至敲除发生后一对普通转录组文库和CRISPRsgRNA文库进行测录组测序数据和CRISPRsgRNA文库测序2S3：将S2步骤得到的目标细胞注入实验动物体内，空间坐标的普通转录组测序数据和CRISP引物扩增即可得到较高纯度的CRISPRsg2.根据权利要求1所述的同片无偏方式结合空间转录组与CRISPR筛选的方法，其特征3.根据权利要求2所述的同片无偏方式结合空间转录组与CRISPR筛选的方法，其特征4.根据权利要求1所述的同片无偏方式结合空间转录组与CRISPR筛选的方法，其特征5.根据权利要求1所述的同片无偏方式结合空间转录组与CRISPR筛选的方法，其特征6.根据权利要求1所述的同片无偏方式结合空间转录组与CRISPR筛选的方法，其特征7.权利要求1_6任一所述方法得到的携带空间坐标的普通转录组测序数据和CRISPR3[0002]CRISPR筛选是一种利用CRISPR敲除或激活的基因编辑系统和核酸条形码进行特定表型的技术，为2013年MIT的张锋团队开发(Genome_ScaleCRISPR_Cas9Knockout了记录细胞在不同空间位置的同时测定不同RNA的表达。可行的技术主要分为探针原位杂同位置的转录水平基因表达。其中原位测序技术通过对一套已知的目标兴趣基因设计探Vsium技术和华大集团的Stereo_seq技术单细胞转录组研究细胞之间的异质性，而空间转[0004]2022年Brown实验室开发了在肿瘤相邻切片分别进行空间CRISPRscreen以及10X公司的Visium空间转录组测序的技术(SpatialCRISPRgenomicsidentifies胞转录状态。这种技术的原理是将sgRNA与预先编码的一段膜蛋白序列同时连接在同一个间蛋白质组的技术可以读出每一个细胞的膜蛋白信息并复原对应的sgRNA文库。该技术成空间蛋白质组的方法标记不同的sgRNA位置以及免疫细胞种类，邻片空间转录组测序的方4一[0005]针对现有技术问题本发明所要解决的技术问题在于提供种同片无偏方式结合一携带空间坐标的普通转录组测序数据和CRISPRsg[0019]所述的同片无偏方式结合空间转录组与CRISPR筛选的方法中，所述利用Total[0020]所述的同片无偏方式结合空间转录组与CRISPR筛选的方法中，所述利用Total[0022]以上任一所述方法得到的携带空间坐标的普通转录组测序数据和CRISPRsgRNA5关键特征；根据CRISPRsgRNA文库测序数据，对sgRNA在不同聚类中的表达量进行差异分现了Piezo1基因的敲除使得T细胞显著富集在纤维化程度低的肿瘤内部区域，反映了敲除膜蛋白Piezo1基因的表达可以使T细胞更好地穿越纤维化区域从而浸润到肿瘤实质内部，该结果验证了Piezo1靶点对于高度纤维化和免疫排斥的肿瘤的成药的6[0041]CRISPRsgRNA敲除文库：对设计好的sgRNA序列通过金唯智公司合成的sgRNA文[0048]以在免疫细胞中敲除后能显著导致免疫细胞在肿瘤中富集的若干种基因作为目标基因，针对每个目标基因设计4_6个sgRNA，共设计了包含2条对照sgRNA在内的共68条[0051]使分选出的CD8+T细胞经过体外激活诱导培养成为效应T细胞，再与所有sgRNA文携带有的GFP基因表达为荧光蛋白而未感染的则不能，采用流式分选的方法分选出阳性感染的T细胞，由于阳性感染的T细胞中病毒转录出sgRNA与T细胞内的Cas9蛋白结合后形成疫细胞之间相互作用等肿瘤空间特征方面有所不同，对于不同的免疫细胞的影响也就不[0054]将阳性感染的T细胞培养至敲除发生6天后，通过微静脉注射打入提前7天种植有7得被敲除了不同基因的T细胞，分别在招募中按照被敲除不同基因后的产生的偏好性自由在Read1序列后有另一段用于扩增的TSO序列，对应的另一端则为Read2和TSO序列。对于Unnamed_2等源于pMYs病毒载体的共有已知序列(Unnamed_1和Unnamed_2表示没有固定名称的两段病毒感染元件序列，也可称为VirusRelatedSequence)不同的sgRNA是由于有20bp的基因可变序列不同，但不同sgRNA都有76bp的共同的、不可变的序列scaffold。[0059]将totalcDNA文库分为两份，一份用于普通转录组文库建库测序，一份用于[0061]按照Stereo_seq商业化的方法将1/10左右的totalcDNA文库打断成合适的长度后进行华大MGI二代测序建库和上机，从而得到普通转录组测序文件(其中含有的极少量[0063]以totalcDNA总文库构建CRISPRsgRNA文库需要富集CRISPRsgRNA文库以达到位于文库最末端的扩增细胞或空间ID，PCR的两个引物中其中一端必须采用所有基因的微量模版为起始的富集方法成功构建了用于测序的CRISPRsgRN8特异性引物扩增即可得到较高纯度的目标片段文库。对目标片段文库通过PCR的方式加二92295℃2.变性98℃4.延伸7.保存4℃2295℃2.变性98℃65℃4.延伸7.保存4℃2295℃2.变性98℃64℃4.延伸7.保存4℃2295℃2.变性98℃4.延伸7.保存4℃[0120](5)检测浓度和片段大小，产率20_30％左右，即得到浓度为20_30ng/μL0.22.保存4℃2.保存4℃2295℃2.变性98℃4.延伸7.保存4℃222295℃2.变性98℃4.延伸7.保存4℃录组同片的CRISPRsgRNA的序列及其每一条具体[0179]六、对CRISPRsgRNA文库和普通转录组文[0181]对于普通转录组的测序结果，使用华大空间转录组的分析软件SAW(Stereo_seqAnalysisWorkflow)，将测序结果中不同reads的gene序列比对至参考基因组以确定基因列前25和后10碱基作为坐标标识符(coordinateidentity)和分子标识符(molecularidentifiers)；对相应的*fq2.gz文件，寻找sgRNAscaffold固定序列前21位碱基(依据序列，第二、三列为gRNA位置坐标，第四、五列为该位置下该类sgRNA测到的数量；将该[0195]对上述含有空间坐标的sgRNA与RNA表达的文件中数据使用ScanpyV1.10.3进行不靶向基因组上任何基因序列的sgRNA)，基因敲除的sgRNA所呈现的富集或缺失的分布特征，渐变至蓝色代表该sgRNA的敲除使得T细胞更多缺失在某个区域，而渐变红色代表该[0201]f.2022年一篇发表在Cell的文献(Osr2functionsasabiomechanicalcheckpointtoaggravateCD8+Tcellexhaustionintumor,Cell,2024)报道了情况的筛选，首先，从文献报道中选取若干肿瘤纤维化标志基因(GO基因注释Term：ID图7B展示了敲除了不同基因的T细胞在成纤维细胞高区域与成纤维细胞低区域的富集情况胞富集量的比值排名，纵轴值越高则说明敲除某个基因的T细胞越富集在成纤维细胞低区对照组sgNTC(图中为sgnon_targeting_2_gene)则显著富集在纤维化高的区域，这与发表区域集中在肿瘤实质。这说明敲除Piezo1基因(sgPiezo1)使得T细胞更多富集在纤维化程度低的肿瘤内部区域，反映了敲除膜蛋白Piezo1基因的表达可以使T细胞更好地穿越纤维