CN119147768B 一种磷酸化Tau蛋白p-tau217的光激化学发光检测试剂盒及其使用方法和应用 （科美博阳诊断技术(上海)有限公司）

司一种磷酸化Tau蛋白p-tau217的光激化学发本申请涉及一种磷酸化Tau蛋白p_tau217的光激化学发光检测试剂盒及其使用方法和应剂包含发光微球以及包被于所述发光微球的带第一标签分子的能够与p_tau217特异性结合的能够与p_tau217的不同表位特异性结合，一个所述第一配对分子能够结合至少两个第一标签满足血浆中p_tau217的光激化学发光检测需2R1试剂，其包含发光微球，所述发光微球包被能够与p_tau217特异性结合的第一抗R2试剂，其包含带第二标签分子的第二抗体；所述第一抗体、第二抗体能够与p_tauR4试剂，其包含感光微球以及包被于所述感光微球的能够与所述第一标签分子和第一配对分子组成的特异性标签系统选自Tag_Catcher系统，所述第一配对分子选自Catcher的多聚体蛋白，一个所述第一配对分子能够结合至少两个第3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第7.如权利要求1至4任一项所述的试剂盒在检测血液样本3[0001]本申请涉及免疫检测技术领域，尤其涉及一种磷酸化Tau蛋白p_tau217的光激化获抗体_待测抗原_生物素化检测抗体_亲和素偶联的酶复合物，在结合荧光底物后将磁珠落入阵列化的微孔中进行反应后检测，其检测灵敏度相较于ELISA和常规化学发光检测法用。217的光激化学发光检测试剂盒及其使用方法和应用，能够提高发光微球接收感光微球产值样本血浆中磷酸化Tau蛋白p_tau217的光激化学发[0006]本申请第一方面提供一种磷酸化Tau蛋白p_tau217的光4对分子分别组成的两组特异性标签系统相互不[0020]本申请第三方面提供一种试剂盒或其使用方法在检测血液样本中p_tau217的应[0021]值得注意的是，所述在检测血液样本中p_tau217的应用为非疾病诊断目的的应中p_tau217的光激化学发光检测对于灵敏度的检测需求。而且整个检测过程不改变常规5在使用前根据需要利用稀释液或缓冲溶液对可能含有被分析物的样本进行稀释后的溶液。抗原发生特异性结合免疫反应的位置即互补决定区(complementaritydetermining[0030]本文所述抗原是指能够引起抗体生成的物质，可以分为完全抗原和不完全抗原[0033]本文所述Tag_Catcher系统是一种蛋白质共价连接技术，其包括多个氨基酸残基6蛋白质。其中的链霉亲和素分子由4条相同的肽链组成，其中每条肽链都能结合一个生物1O2[0037]本文所述感光微球是指填充有光敏剂的高分子微粒，在光激发下能够产生活性7通过两微球之间的活性氧传递产生的光信号实现待测抗原/抗体的定性或读数时感光微球产生的大量1O2仅有少部分被相邻发光微球接收并产生光信号，未被接收p_tau217的不同表位特异性结合，且一个第一配对分子能够结合至少两个第一标签分子，[0044]通过R1试剂和R2试剂中的第一抗体和第二抗体能够与p_tau217发生免疫反应形效发光微球粒径和比表面积的效果，使得感光微球产生的1O2的利用率提高，猝灭的1O2降别和结合能力能够促使R1试剂和R3试剂的发光微球可以选自Tag_Catcher系统，且可以从该系统的组合中选择任一组合作为R1试剂中的第一8第一标签分子摩尔量的1~2.5倍时对于发光微球的光信号强度提升效果显著，过量则易导一抗体的非特异性结合区域，形成带有第一标签分子的第一抗体。所述共表达连接的方式可以是通过将第一标签分子通过pClick技术(具体参考文献“Synthesisofprecision体的非特异性结合区域，也可以是将第一标签分子的序列插入至第一抗体的非特异性结合区域来实现。9[0059]R2试剂和R4试剂中的第二标签分子和第二配对分子可以选自生物素_亲和素系[0068]本申请通过先将发光微球以及其包被的能够特异性识别和结合p_tau217的第一签分子与感光微球包被的第二配对分子的特异性结合将目标发光微球固定于感光微球得特异性识别和结合能力使游离的发光微球结合至目标发光的1O2能够分别被多聚发光微球中的多个发光微球共同接收并同时产生光信号，有效提高测要求。而且，该方案中所使用的特异性标签系统即第一标签分子和第一配对分子采用[0070]在本申请的一些实施例中，加入R1试剂、R2试剂后反应时间≥45min，优选≥[0072]在本申请的一些实施例中，各检测试剂使用时，R1试剂中的发光微球浓度为75~[0074]该检测方法具体包括：将待测样本与包含能够特异性识别p_tau217的第一抗体强度确定待测样本中是否包含p_tau217或确定待测样本中p_对于p_tau217的光激化学发光检测性能的提ofprecisionantibodyconjugatesusingproximity_inducedchemistry”蛋白的部分进行电泳检测，选取符合Tag_抗体分子量大小的收集，透析至后续偶联反应所Tag。[0088]②取(p_tau21[0089]③将处理后的发光微粒FG与(p_tau217)Ab1_SpyTag按照质量比10:0.5充分混[0090]④向反应体系中加入80μL甘氨酸(75mg/mL，0.05MCB)与10μLNaBH4(8mg/mL，+1%葡聚糖）清洗1次，再加入复溶液超声复溶，得到终浓度为83.3[0094]②向透析后的(p_tau217)Ab2溶液中加入30倍摩尔量的Biotin_PEG12_NHs，混[0098]①Catcher质粒表达载体构建：根据SpyCatcher的序列（GenBank登录号：[0099]②Catcher大肠杆菌诱导表达：大肠杆菌表达载体通过诱导表达SpyCatcher蛋[0123]②如表2_7所示，SpyCatcher与R1试剂中SpyTag摩尔数比例为1:(16~1)时均在[0126]因此，采用特异性标签系统例如SpyCatcher_Tag将游离的发光微球聚集至复合满足低值样本例如血液样本中p_tau[0129]1.1将SpyCatcher八聚体用复溶液稀释到与R1试剂中Tag摩尔数比例为1:4的R3[0138]因此，采用特异性标签系统例如SpyCatcher_Tag将游离的发光微球聚集至复合[0141