透明质酸钠分子量分级及性能测试方法

3透明质酸钠分子量分级及性能测试方法本文件规定了透明质酸钠（玻璃酸钠）分子量分级及性能测试的原理、试验条件、试剂与材料、仪器设备、样品、测试方法、测试数据处理、质量保证和控制、测试报告等内容。本文件适用于食品、化妆品、生物医学等领域使用的透明质酸钠原料及制品，分子量范围在0.005kg/mol～3kg/mol之间的分子量分级、分子量测定及相关性能（黏度、保湿性、生物相容性）测试。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T622化学试剂盐酸GB/T1266化学试剂氯化钠GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T11199高纯氢氧化钠HG/T2953气相色谱分析法标准格式JJG119实验室pH（酸度）计检定规程JJG376电导率仪检定规程JJG1036电子天平检定规程YY/T0308医用透明质酸钠凝胶YY/T1571组织工程医疗器械产品透明质酸钠3术语和定义YY/T0308、YY/T1571界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1透明质酸钠sodiumhyaluronate由D-葡萄糖醛酸和N－乙酰-D-葡萄糖胺通过β-1,3和β-1,4糖苷键交替连接形成的线性高分子多糖的钠盐。3.2分子量分级molecularweightgrading根据透明质酸钠分子量差异，采用特定分离技术将其划分为不同分子量区间组分的过程。3.3特性黏数intrinsicviscosity[η]表示单位质量的高分子在溶液中所占体积的大小，是表征高分子分子量和分子链形态的重要参数。3.4数均分子量number-averagemolecularweight（Mn）按分子数目统计的平均分子量，反映高分子样品中低分子量组分的贡献。3.54重均分子量weight-averagemolecularweight（Mw）按分子质量统计的平均分子量，反映高分子样品中高分子量组分的贡献。注：本文件中黏度法所得分子量记为Mw（实际为黏均分子量Mv），但在透明质酸钠领域习惯称Mw。3.6分子量分布指数molecularweightdistributionindex（Mw/Mn）重均分子量与数均分子量的比值，表征高分子样品分子量的分散程度。3.7截留分子量（MWCO）molecularweightcut-off超滤膜在标准条件下能截留≥90%的某种标准溶质的最小分子量（以kg/mol表示），用于表征超滤膜的分离精度。4原理4.1分子量分级原理采用凝胶渗透色谱法（GPC）或超滤分级法实现透明质酸钠的分子量分级：a）凝胶渗透色谱法：利用多孔凝胶固定相，不同分子量分子渗透孔隙程度不同，按分子量从大到小洗脱分级；b）超滤分级法：基于超滤膜的截留分子量（MWCO）特性，通过选择不同截留分子量的超滤膜，在压力驱动下实现不同分子量区间分离。4.2分子量测定原理采用黏度法结合马克-豪温克（Mark-Houwink）方程计算透明质酸钠的分子量。透明质酸钠在稀溶液中呈现特定的黏度行为，通过测定其特性黏数，代入Mark-Houwink方程，即可计算得到重均分子量Mw。4.3性能测试原理性能测试原理如下：a）黏度测试：采用旋转黏度计测定透明质酸钠溶液在特定剪切速率下的黏度值，反映其黏弹性；b）保湿性测试：通过测定透明质酸钠样品在一定湿度环境下的吸水量及保水率，评价其保湿性能；c）生物相容性测试：采用体外细胞毒性试验（MTT法通过检测细胞存活率，评估透明质酸钠对细胞的毒性作用，判断其生物相容性。5试验条件5.1环境条件测试环境应符合下列条件：a）温度25±2）℃;b）相对湿度：（50±10）%；c）大气压：86kPa～106kPa；d）无明显振动（振动加速度≤0.05g）、电磁干扰及灰尘污染的实验环境。5.2分离与测试条件5.2.1凝胶渗透色谱法分级条件凝胶渗透色谱法分级应符合下列条件：a）流动相：0.15mol/LNaCl溶液，经0.22μm滤膜过滤并脱气处理；b）流速：0.5mL/min～1.0mL/min，保持恒定；5c）柱温25±0.5）℃;d）进样量：20μL～100μL，根据色谱柱容量调整。5.2.2超滤分级条件超滤分级应符合下列条件：a）超滤膜：截留分子量（MWCO）分别为0.01kg/mol、0.05kg/mol、0.1kg/mol、0.5kg/mol、1kg/mol、2kg/mol，膜材质为再生纤维素或聚醚砜，截留率≥90%；b）操作压力：0.1MPa～0.3MPa；c）搅拌速度：100r/min～300r/min。5.2.3黏度测试条件黏度测试应符合下列条件：a）溶液浓度：1.0mg/mL（用0.15mol/LNaCl溶液配制）；b）剪切速率：10s-1～100s-1，根据样品黏度特性选择合适范围；c）测试时间：每个剪切速率下稳定30s后读数。5.2.4保湿性测试条件保湿性测试应符合下列条件：a）恒温恒湿箱：温度（25±1）℃,相对湿度分别为30%±5%（吸湿性测试）和80%±5%（保水性测试）；b）样品用量：0.5g±0.01g（固体样品）或1.0mL±0.01mL（液体样品）；c）测试时间：吸湿性测试24h，保水性测试48h。5.2.5生物相容性测试条件生物相容性测试应符合下列条件：a）细胞株：L929小鼠成纤维细胞或HUVEC人脐静脉内皮细胞；b）培养环境：37℃、5%CO2、饱和湿度；c）样品浓度：0.1mg/mL、1.0mg/mL、10mg/mL；d）培养时间：24h、48h、72h。6试剂与材料透明质酸钠分子量分级及性能测试的试剂与材料应符合表1要求。表1试剂与材料要求）：填料为羟丙基甲基纤维素凝胶或葡聚糖凝胶，分离范围0.00截留分子量（MWCO）10kDa，长度10cm～20cm，耐DMEM或RPMI1640培养基，含10%胎牛血清、100U/m），67仪器设备透明质酸钠分子量分级及性能测试的仪器设备应符合表2规定。表2仪器设备技术要求）；度≤1×10RIU；多角度激光光散射检测器：激光波长632.8nm，散射角检测范围15°~165°,分子量测量范围1×10³~压力范围：0～0.5MPa，压力精度±0.01MPa；搅拌速度范围：0～500r/min，调速精度±1控温范围：5℃~50℃,控温精度±0.1℃控温范围：10℃~50℃,控温精度±0.5℃；控湿范围：20%～95%RH，控湿精度±3%RH；工作室容积≥100L，波长范围：200nm～800nm，波长精度±0.5nm；吸光度测量范围：0～4.0AU，精度±配备10mm石英比色皿架，支持多波长量程：0～100g，分度值0.01mg；功率：100W～300W，功率可调；频率：40kHz；超声槽容积≥1L，具备转速范围：0～15000r/min，转速精度±50r/min；控温范围：-20℃~40℃,控温精度±1℃；最大离心力≥21000g，控温范围：35℃~39℃,控温精度±0.1℃；CO浓度范围：0～20%，控制精度±0.1%；湿度：饱和湿度，检测波长范围：400nm～750nm，波长精度±2nm；吸光度测量范围：0～4.0AU，分辨率0.001A测量范围：0～14.00pH，精度±0.01pH；温度补偿范围：0℃~60℃,自动测量范围：0～100mS/cm，精度±0.5%FS；温度补偿范围：0℃~50℃,自8样品8.1样品要求样品应符合下列要求：a）外观：固体样品为白色或类白色粉末，无臭、无味，无肉眼可见杂质；液体样品为无色或淡黄色透明黏稠液体，无分层、沉淀及悬浮物；b）纯度：透明质酸钠含量≥90.0%，蛋白质含量≤0.1%，重金属含量≤10μg/g；c）稳定性：样品在实验条件下应稳定，固体样品密封保存后无吸潮、结块现象，液体样品无浑浊、分层及分子量明显变化；d）预处理：固体样品使用前需在60℃真空干燥箱中干燥至恒重，液体样品需经0.22μm滤膜过滤去除杂质。8.2样品制备8.2.1固体样品溶解称取0.1g～1.0g样品，加0.15mol/LNaCl溶液超声分散10min～30min，定容至100mL（1mg/mL~10mg/mL），静置2h～4h，8000r/min离心10min取上清。8.2.2分级样品制备分级样品制备包括但不限于以下内容。a）凝胶渗透色谱法分级：1）将样品母液用0.22μm滤膜过滤，去除颗粒物；72）按照GPC分级条件，将过滤后的样品注入凝胶渗透色谱仪；3）根据色谱图的洗脱峰，按分子量区间收集洗脱液，得到不同分子量分级组分；4）将收集到的分级组分置于透析袋中，用去离子水透析24h，脱除NaCl，然后冷冻干燥，得到固体分级样品。b）超滤分级：1）取20mL样品母液加入超滤系统的料液槽中；2）选择合适截留分子量的超滤膜组件，设定操作压力0.2MPa，搅拌速度200r/min，进行超滤；3）收集截留液和透过液，将透过液再用1000kDa超滤膜进行超滤，依次按截留分子量从大到小的顺序进行分级，收集各区间截留液；4）将各分级截留液分别透析脱盐、冷冻干燥，得到固体分级样品。8.3样品保存样品保存应符合下列条件：a）固体样品：密封后置于干燥器中，在（25±2）℃、相对湿度≤60%的环境下保存，保存期限不超过6个月；b）液体样品：密封后置于4℃冰箱中冷藏保存，避免冷冻，保存期限不超过1个月，使用前需恢复至室温并摇匀；c）所有样品应标注清晰信息：样品名称、编号、原始分子量（预估）、分级方法、分级区间、制备日期、保存条件。9测试方法9.1分子量测定（黏度法）9.1.1标准曲线绘制标准曲线绘制应符合下列要求：4.0mg/mL、5.0mg/mL的标准溶液；b）采用乌氏黏度计，在（25±0.1）℃恒温水浴中，分别测定各标准溶液的流经时间t及纯溶剂的流经时间t0；c）计算相对黏度ηr、增比黏度ηsp、比浓黏度ηsp/c、比浓对数黏度lnηr/c；d）以浓度c为横坐标，分别以ηsp/c和lnηr/c为纵坐标绘制曲线，外推至c=0，得到特性黏数[η]；e）以标准品的重均分子量Mw的对数为横坐标，特性黏数[η]为纵坐标，绘制标准曲线，得到Mark-Houwink方程的K和α值，K和α值应基于本实验室条件使用标准品校准，不应直接引用文献值。9.1.2样品分子量测定样品分子量测定应符合下列要求：a）制备样品溶液，并稀释为3个不同浓度梯度；b）测定各浓度样品溶液的流经时间t，计算ηr、ηsp、ηsp/c、lnηr/c；c）外推至c=0，得到样品的特性黏数[η]；d）将特性黏数[η]代入Mark-Houwink方程，计算样品的重均分子量Mw；e）重复测试3次，取平均值作为最终分子量结果。9.2分子量分布测定（GPC法）分子量分布测定（GPC法）应符合下列要求：a）将透明质酸钠标准品制备成浓度为2.0mg/mL的标准溶液，经0.22μm滤膜过滤；b）按照GPC测试条件，对标准溶液进行测试，记录洗脱曲线，以标准品的Mw为横坐标，洗脱体积Ve为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程；c）将样品溶液按相同条件进行GPC测试，记录洗脱曲线；d）根据标准曲线回归方程，计算样品的数均分子量Mn、重均分子量Mw及分子量分布指数Mw/Mn；8e）重复测试3次，取平均值。9.3黏度测试黏度测试应符合下列要求：a）制备样品溶液，置于旋转黏度计的样品池，平衡温度至（25±0.1）℃;b）选择合适的转子，设定剪切速率从10s-1递增至100s-1，每个剪切速率下稳定30s后记录黏度值；c）绘制黏度－剪切速率曲线，读取剪切速率50s-1时的黏度值作为样品的特征黏度；d）重复测试3次，取平均值，允许相对偏差≤5%。9.4保湿性测试9.4.1吸湿性测试吸湿性测试应符合下列要求：a）准确称取0.5g±0.01g干燥的样品（固体样品）或移取1.0mL±0.01mL样品溶液（液体样品置于已恒重的称量瓶中，记录初始质量m0；b）将称量瓶放入恒温恒湿箱中，设定温度（25±1）℃、相对湿度30%±5%，放置24h；c）取出称量瓶，迅速加盖，置于干燥器中冷却至室温后称量，记录质量m1；d）按公式（1）计算吸湿性：wh式中：wh——吸湿性，%；m0——样品初始质量，单位为克（gm1——吸湿后样品质量，单位为克（g）9.4.2保水性测试保水性测试应符合下列要求：a）按步骤称取样品，记录初始质量m0；b）将样品在相对湿度80%±5%、温度（25±1）℃的恒温恒湿箱中放置24h，使其充分吸湿，称量质量m2；c）将吸湿后的样品转移至相对湿度30%±5%、温度（25±1）℃的恒温恒湿箱中，放置48h；d）取出冷却至室温后称量，记录质量m3；e）按公式（2）计算保水性，平行测试3次，取平均值：wr式中：wr——保水性，%；m0——样品初始质量，单位为克（gm2——吸湿后样品质量，单位为克（gm3——保水后样品质量，单位为克（g）9.5生物相容性测试（MTT法）生物相容性测试（MTT法）应符合下列要求：a）将L929细胞或HUVEC细胞接种于96孔板中，每孔接种1×104个细胞，加入100μL细胞培养基，在37℃、5%CO2培养箱中培养24h；b）弃去旧培养基，分别加入不同浓度的样品溶液，每孔100μL，设置空白对照组和阴性对照组，每组设置6个平行孔；c）分别培养24h、48h、72h后，弃去孔内液体，每孔加入5mg/mLMTT溶液20μL，继续培养4h；d）弃去MTT溶液，每孔加入150μl二甲基亚砜（DMSO），振荡10min，使甲臜结晶完全溶解；e）用酶标仪在490nm波长下测定各孔的吸光度值（OD）；f）根据细胞存活率评价生物相容性：细胞存活率≥80%为合格，表明样品无明显细胞毒性。按公式（3）计算细胞存活率：9式中：Vc——细胞存活率，%；As——样品组吸光度值；An——阴性对照组吸光度值；Ab——空白对照组吸光度值10测试数据处理10.1数据处理方法数据处理方法应符合下列要求：a）分子量及分布：计算特性黏数[η]、Mn、Mw、Mw/Mn，结果保留3位有效数字；b）黏度：取3次测试结果的平均值，保留2位有效数字，单位为mPa・s；c）保湿性：吸湿性和保水性结果保留1位小数，以百分比表示；d）生物相容性：细胞存活率结果保留1位小数，以百分比表示，同时计算标准差（SD）。10.2重复性与再现性评估10.2.1重复性同一实验室、同一操作员、使用同一台仪器，对同一样品在相同实验条件下进行6次独立测试，计算Mw、特征黏度、吸湿性的相对标准偏差（RSD），要求RSD≤5%；细胞存活率RSD≤8%。10.2.2再现性不同实验室、不同操作员、使用同类型仪器，对同一样品进行多次独立测试，计算实验室间Mw、特征黏度、吸湿性的平均相对偏差，要求相对偏差≤10%；细胞存活率相对偏差≤15%。10.3异常数据处理异常数据处理应符合下列要求：a）当单次测试结果与其他测试结果的相对偏差超过重复性要求的2倍时，判定为异常数据；b）检查异常数据产生的原因，包括样品污染、仪器故障、操作失误、环境