二轮复习生物工程学案（江苏版）

专题十生物工程

•课标内容，

(1)植物组织培养和植物体细胞杂交技术。(8)DNA的粗提取和鉴定。

⑵动物细胞培养及干细胞的应用。(9)DNA片段的扩增及电泳鉴

定。

(3)动物细胞融合技术和单克隆抗体的制备。(10)基因工程的应用。

(4)动物体细胞核移植技术。⑴)蛋白质工程。

(5)胚胎工程的理论基础及应用。(12)转基因产品的安全性。

(6)重组DNA技术的基本工具。(13)关注生殖性克隆与治疗性克隆。

⑺基因工程的基本操作程序。(14)生物武器及其对人类的危

害。

梳理核心知识

建网络

宠还卜①细胞的全能性、细胞膜的流动性

技术卜也物组空埴养、植物体细胞杂交技术

⑥F期胚胎在相同生理环境条件麻

下空间位置的转移也幽7胎卜为it分化”再分化

充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力电区)画动物细匕随卜②鲤则

胞嫁求卜丽工获得新细胞.不形成个体

发育良好、形态正常的⑦题届团胚

胚或囊胚----胎动物体细|z际丽卜③动物细胞核的全能性

分

7动

加快繁殖速度逞囚割阳电移植卜丽卜侬垣陵型吐他

物

细

胞动物细卜做财④细胞腴的流动性

原理与方法步骤】DNA的提取和鉴定工胞低占卜历阶物理法、化学法、生物法

程

n力京4*的，汐备上件

限制前、⑧DNA连接梅、我住T操作工具［首要步骤卜给小鼠注射抗原

.一.府的筛选与获取学克隆抗C7-T—7-已免岐的B淋巴细

体的制备1所制细胞

胞和骨髓瘤加胞

p。过银,.⑨川因点达轨体的构建'獭q

丁•将且政里里心△卷掩+幽⑤产生专一抗体的

川人的挑收和筌文杂交糊细胞

一原理与方注方獴

IH的基因的检测与鉴定’工两次用送的8的与R法

双百序及感基五加超升

⑩胭4^^时叫

行花L转基因食品的安全性问题、

改造现行蛋白质或制造一问膻生物武器

生物技术的

种新的蛋白质

'斐全性与伦

理问题伦理克降人、设计试管婴儿、

问题生物武器

》扫易错

1.判断有关细胞工程和胚胎工程说法的正误

(1)在脱分化过程中，增大细胞分裂素与生长素含量的比值，可利于根的分化生

长。(X)

(2)利用物理法或化学法可以直接将两个植物细胞进行诱导融合。(X)

(3)再生出细胞壁是原生质体融合成功的标志。(V)

(4)制备肝细胞悬液时先用剪刀剪碎肝组织，再用胃蛋白酶处理。(X)

(5)杂交瘤细胞制备过程中，可用灭活的病毒诱导细胞融合。(J)

(6)植物体细胞杂交过程中，需先脱分化再诱导融合。(X)

(7)重构胚是指人工重新构建的胚胎，具有发育成完整个体的能力。(V)

(8)使用免疫抑制剂以避免代孕牛对植入胚胎产生免疫排斥反应。(X)

(9)牛胚胎移植时可用囊胚期滋养层细胞进行性别鉴定。(J)

(1())胚胎移植中，供体和受体相当于双亲中的父本和母本。(X)

2.判断有关基因工程和蛋白质工程说法的正误

(1)DNA连接酶能将两减基间通过氢键连接起来。(X)

(2)£co〃DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。(X)

(3)质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体。(J)

(4)将胰岛素基因表达载体导入受体细胞借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因

的受体细胞筛选出来。(J)

(5)转基因抗虫棉植株的抗虫效果必须通过分子检测进行鉴定。(X)

(6)PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。(J)

(7)蛋白质工程被广泛用于改进酶的性能或开发新的工业用陶。(V)

(8)用PCR技术扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。3)

》练表达

1.体外进行动物细胞培养时，培养液要定期更换，其目的是.................

O

提示以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害

2.胚胎细胞的核移植获得克降动物的难度小于体细胞核移植，其原因是

提示胚胎细胞分化程度低，表现全能性相对容易

3.制备的单克隆抗体在临床上不能直接用于人体，还需要对抗体进行人源化，即

对鼠源单克隆抗体进行改造，使其大部分氨基酸序列为人源序列所替代，该过程

的意义是...............................................................

O

提示鼠源单克隆抗体对人而言可能是异种抗原，经人源化后能保留抗体的特异

性，降低其异源性

4.实践中常用某些病毒载体作为基因工程工具，除具备普通“质粒载体”的条件

外，还应具有的条件是...................................................

（答出两点即可）.

提示对靶细胞具有较高的转化效率；在宿主细胞中不会引起免疫排斥反应

5.［2021.全国甲卷，38⑵（4）］⑵PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、

三步，其中复性的结果是........................................o

（4）PCR（聚合酶链式反应）技术是指.................................o该技术

目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。

提示（2）延伸两种引物通过碱基互补配对分别与两条单链DNA结合（4）一

种在生物体外快速扩增特定DNA片段的技术

6」2019•全国卷I,38（3）］目前在PCR反应中使用耐高温的DNA聚合酶，而不使

用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是.....................................

O

提示耐高温的DNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会

失活

7.PCR反应需提供分别与DNA两条链结合的两种引物，引物的作用

是.....................................................................。

提示使DNA聚合酶能够从引物的3,端开始连接脱氧核甘酸

根的分化、抑制芽的形成，因此提高培养基中生长素和细胞分裂素的比值，有利

于诱导生根，c正确；用同一植株体细胞离体培养获得的再生苗会出现变异，如

在愈伤组织的培养过程中可能发生基因突变等变异，D错误。

2.（2021.江苏卷，11）下列关于哺乳动物胚胎工程和细胞工程的叙述，错误的是

（）

A.细胞培养和早期胚胎培养的培养液中通常需要添加血清等物质

B.早期胚胎需移植到经同期发情处理的同种雌性动物体内发育成个体

C.猴的核移植细胞通过胚胎工程已成功地培育出了克隆猴

D.将骨髓瘤细胞和B淋巴细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞

答案D

解析细胞培养和早期胚胎培养的培养液中通常需添加血清等物质，A正确；早

期胚胎需移植到经同期发情处理的同种雌性动物体内发育成个体，R正确；我国

利用核移植技术成功培养出克隆猴“中中”和“华华”，C正确；将骨髓瘤细胞

和B淋巴细胞混合，经诱导融合后的细胞不都是杂交瘤细胞，还有B细胞自身

融合的细胞、骨髓瘤细胞自身融合的细胞等，D错误。

3.（多选）（2020・江苏卷，23）小鼠胚胎干细胞经定向诱导可获得多种功能细胞，制

备流程如图所示。下列叙述错误的是（）

A.为获得更多的囊胚，采用激素注射促进雄鼠产生更多的精子

B.细胞a和细胞b内含有的核基因不同，所以全能性高低不同

C.用胰蛋白酶将细胞a的膜蛋白消化后可获得分散的胚胎干细胞

D.胚胎干细胞和诱导出的各种细胞都需在CO2培养箱中进行培养

答案ABC

解析限制获得更多早期胚胎的最大的问题是没有足够的卵母细胞，所以应该通

过注射促性腺激素促进雌鼠超数排卵，A错误；细胞a和细胞b是由同一个受精

卵分裂分化形成的，所以两细胞的核基因应该是相同的，由于基因的选择性表达,

囊胚期细胞b已经分化形成了滋养层细胞，所以全能性降低，B错误；用胰蛋白

酶或胶原蛋白酶处理组织一段时间，消化了细胞间的蛋白质，从而获得分散的胚

胎干细胞，C错误；动物细胞培养所需气体主要有氧气和二氧化碳，一般将动物

细胞置于含95%空气加5%二氧化碳的混合气体的培养箱中进行培养，D正确。

4.(2021・江苏卷，23)某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M

和tag标签的质粒，请结合实验流程回答下列问题:

上步时源序列卜加同源序列

s，।…*….

KTAM；vi，hHnH：MX-jMhxiKN；yQrcrniA5rzMA、4;naA(rnA《

战*m

、、於I削他

PCR扩增

LRA3Ampr

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I所处理

URA3州u的选标记基火.及失该基

因就用无法合成献味发

Amp，:大扬杼倒《1途标记.编码氨茉科

URA30泰抗性从闪

t”序列依附咛定氨解触序例.可被特

A-m皓合体井性植体识别

1导入大将汗苗

O“入睥母母

URA3Amp,a介际线

改播H的侬株的SfitlM

(1)目的基因的扩增

①提取真菌细胞_______,经逆转录获得cDNA,进一步获得基因m片段。

②为了获得融合lag标签的蛋白M,设计引物P2时，不能包含基因m终止密码

子的编码序列，否则将导致，

(2)重组质粒的构建

①将S〃也I切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成

黏性末端，然后降温以促进________,形成A—m结合体。将A—m结合体导入

大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及酶等，完成质粒的环化。

②若正确构建的重组质粒A—m仍能被S〃7al切开，则SMI的酶切位点可能

在

(3)融合蛋白的表达

①用含有尿嗑唾的培养基培养URA3基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入

质粒A-m,然后涂布于无尿嚏呢的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是

②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，说明

,后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。

答案⑴①RNA②蛋白M上不含tag标签

（2）①黏性末端碱基互补配对DNA连接

②基因m的连接处、基因m的内部

（3）①受体菌在无尿嘴咤的培养基上无法生长，导入重组质粒的受体菌含有URA3

基因可以长成菌落②融合基因表达（或融合基因正确解码）

解析（1）①以逆转录获得cDNA的方式，要先从真菌细胞中提取基因m转录出

来的mRNA。②从构建好的重组质粒上看，tag序列位于目的基因下游，若m基

因的转录产物mRNA上有终止密码子，核糖体移动到终止密码子多肽链就断开，

则不会对tag序列的转录产物继续进行翻译，蛋白M上就不含tag标签。

（2）①从图上看，载体A只有一个I的酶切优点，故被I切开后，载体

由环状变为链状DNA,将SMI切开的载体A与添加同源序列的m混合，用

特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进载体A与添加同源序列的m

的黏性末端碱基互补配对。将A—m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的

DNA聚合酶及DNA连接酶等，完成质粒的环化。②重组质粒中，载体A被Sma

I切开的位置已经与基因m相连，原来的酶切位点已不存在，若正确构建的重

组质粒Am仍能被SmaI切开，则Stna1的酶切位点可能在基因m的连接处、

基因m内部。（3）①筛选目的菌株的机理是：导入了质粒A—m的目的菌株由于

含有URA3基因，能在无尿啼唆的培养基上存活，而URA3基因缺失型酵母则

不能存活。②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，位于tag

标签上游的基因m应该正常表达，说明融合基因表达（或融合基因正确解码）。

微专题1细胞工程与胚胎工程

讲-核心要点

1.植物组织培养的过程原理：植物细胞的全能性

：条件：无菌、离体、一定的营养物质、

・激素•（生长素、细胞分裂素等）

...»田林舟乐基

脑盘脱空的再空（■,自移二

栽

器器愈?飞胚弋体试管苗

而施排列统初、走规则.生产细胞江物利用愈伤

=是一种高度液泡化的品组织，制作人工种子利

:无定形状态的薄壁细胞用胚状体

提醒①植物组织培养中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。

②脱分化阶段不需光，再分化阶段需光。

③生长素/细胞分裂素的比值高时，促进根的分化、抑制芽的形成；比值低时，

促进芽的分化、抑制根的形成。

④体内细胞未表现全能性的原因：在特定的时间和空间条件下，基因的表达具有

选择性。

2.植物体细胞杂交技术

原理：植物细胞的全能性、细胞膜的流动性

:纤维素酶和：：诱导物理法：电融介法、离心法

：果敢悔处理：：.人，化学法：PEG融合法、高Ca，•-高pH

:去除细胞壁：：融融合合法法

1

；/充服了这律菜女不辛和性

040、［叫一牛

马铃用马铃再、*X再生G脱分化

细胞原生质号/3丽醺u

@正在融杂种

M眼合的原细胞愈伤再生出杂种

细胞原生质体生康体J\组织小植株植株

;而:屈疝而/海合南而“藤;:

提醒①与再生细胞壁密切相关的细胞器是高尔基体。

②原生质体融合后有多种结果需要筛选。

③从变异角度看，植物体细胞杂交技术属于染色体数目变异，杂种植株的基因型、

染色体和染色体组数目均为原两植物直接相加。

3.动物细胞培养原理：细胞增殖

血学分化短及做、建姓筋五而正或EK'：

能力遥、更&孑培泉（和接触抑制的特点:

动物坯ffl胰走门碑处理传

代

胎或幼用机械的方法*胞或离心法处

胰蛋门酶后蔽后分瓶焙访・培

龄动物悬养

蛆织块原蛋白酶）处理液

提醒①动物细胞培养中两次使用胰蛋白酶的作用不同:

第一次：处理组织，使其分散成单个细胞。

第二次：使贴壁生长的细胞从瓶壁上脱落下来。

②避免杂菌污染的措施：培养液及培养用具灭菌处理，加入一定量的抗生素，定

期更换培养液。

③区分原代培养和传代培养的关键是是否分瓶培养。

4.单克隆抗体的制备原理：细胞膜的流动性、细胞的增殖

,,湫免度生如产生更多的比林巴佃胞

给小晟注射特曲丽［提取骨髓盘细胞）

扩大，培养

丛腔史会舱lit幽细胞

大号卢姓上

:灭活病毒0、能分泌扰林

▲金分泌特文执诱导融合

/不柒大噂塞琉

:动物细胞融合突破r有'

j性杂交方法的后限.使

?远缘杂交成为可能

未融合细胞,B-B细胞

【痛一瘤细与嚏罚细胞j国遍百

咚;殖宓前丽"-蜜粤瞥/_

________克隆化培养▼和抗体检测胃髓耙擀

产生所需特定抗体的杂交瘤细胞I:杂交法筛选

［体内培养（小反腹腔内川体外培系（培养液中）］

触航珈H别扰原的

遢瓯产嚣然;4黑

令,并且可大号制备

提醒2次筛选目的不同：①第1次：获得杂交瘤细胞。②第2次：获得能分

泌所需特异性抗体的杂交瘤细胞。

5.动物体细胞（核移慎技术）克隆技术原理:动物细胞核的全能性

提醒（1）核移植获得的克隆动物与提供细胞核的亲本性状可能不同的三个原

因：①克隆动物遗传物质来自两个亲本。②发育过程中可能发生基因突变或染色

体变异。③外界环境可能引起表型改变。

（2）克隆动物的产生是无性繁殖，而试管动物则是在体外受精形成受精卵，由受

精卵发育成的个体，因此属于有性繁殖。

6.准确记忆哺乳动物的早期胚胎发育过程

（受精卵L-----------------------------------------------

------^分裂方式：有丝分裂

卵」分裂特点：只分裂、不生长.每个细胞体

裂飞、积逐渐变小，总体积基本不变

住而L而教成应用3万西施云君布标：商不如‘

胞都属于全能细胞、，发3成胎膜我肺长

j玩正「而而施而I逊艮殛二速就施一

港豺'，特点：细胞已分化［丽丽的将来发育为

♦\：胎儿的各种组织

原肠胚后丽1丙:・印「开三不施宜而芬花-

（幼体］.&快H期鼠生好化过短

7.胚胎移植的操作流程

遗传性状优良和生产能力强的

画卜供体、有健康的体质和正常繁

对供、受

殖能力的受体

体的选择

和处理同期发情处理和对供体母留进

囱涉行超数排卵处理促性腺激步

酣种或进行人工授精不&原陟必附战杪根，⑨为此

（-----）舟分化我•鹿嬴移植瓜功率很

♦|收集卜冲卵俏另外不能立土也极纤

对胚胎的'后不L对胚胎进行质量检查）这时胚

乎枭:替-皿T胎应发育到桑优胚或囊胚阶段

查、处理,--------------

仿卜ppL宜接向受体移植或放入-196f

些逑尸的液包中保存

胚胎移植

胚胎移植后的检查-检查受体是否妊娠

8.胚胎分割无性繁殖或克隆

迓»发育良好、形态正常的桑―胚或囊胚

焉、胚胎分割可增加动物后代的数量,其实质

叱多片是动物的无性繁殖或克隆

/C\对囊胚分割时.注意将内细胞团均等分割.

否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发

\育，对未知性别的胚胎可以取遨卷星细胞.

\y做DNA分析进行性别鉴定

》经典再现

1.下列有关细胞工程的叙述正确的有簸。

①将骨髓瘤细胞和B淋巴细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞。

（2021•江苏卷,11D）

②植物组织培养过程中，用同一植株体细胞离体培养获得的再生苗不会出现变

异。（2021•江苏卷，5D）

③经灭活或减毒处理的病毒可用于免疫预防。（2021•辽宁卷，3D）

④动物细胞培养过程中用盐酸溶解细胞间物质使细胞分离。（2021•浙江1月，18B）

⑤胚胎干细胞和诱导出的各种细胞都需在CO2培养箱中进行培养。（2020•江苏卷，

23D）

2.下列有关胚胎工程的叙述正确的有①②。

①早期胚胎需移植到经同期发情处理的同种雌性动物体内发育成个体。（2021•江

苏卷,11B）

②体外受精前要对小鼠的精子进行获能处理.。（2020•山东卷，14B）

③胚胎移植前要检查胚胎质量并在囊胚或原肠胚阶段移植。（2020•山东卷，14C）

④胚胎移植时需使用免疫抑制剂以避免代孕牛对植入胚胎的排斥反应。（2018.江

苏卷，10C）

⑤利用胚胎分割技术，同卵多胎较同卵双胎成功率更高。（2018•江苏卷，10D）

练-高考重点

1.（2021•福建卷，II）科研人员利用植物体细胞杂交技术培育矮牵牛新品种，技术

流程示意图如下。

矮牵牛品种甲

杂

幼嫩叶片种

植

矮牵牛品种乙株

幼嫩叶片

下列叙述正确的是（）

A.愈伤组织是幼嫩叶片通过细胞分化形成的

B.获得的杂种植株都能表现双亲的优良性状

C.可用聚乙二醇诱导原生质体甲和乙的融合和细胞壁再生

D.用纤维素酶和果胶酶处理愈伤组织以获得原生质体

答案D

解析愈伤组织是幼嫩叶片通过细胞脱分化形成的，A错误；由于基因的选择性

表达和基因间的互作效应，获得的杂种植株不一定能够表现双亲的优良性状，B

错误；可用聚乙二醇诱导原生质体甲和乙的融合，但不能诱导细胞壁的再生，C

错误；由于植物细胞壁的成分主要是纤维素和果胶，故可以用纤维素酶和果胶酶

处理愈伤组织以获得原生质体，D正确。

2.（2019・江苏卷，20）为探究矮牵牛原生质体的培养条件和植株再生能力，某研究

小组的实验过程如图。下列叙述正确的是（）

悬浮原生质体愈伤组织丛生芽

A.过程①获得的原生质体需悬浮在30%蔗糖溶液中

B.过程②需提高生长素的比例以促进芽的分化

C.过程③需用秋水仙素处理诱导细胞壁再生

D.原生质体虽无细胞壁但仍保持细胞的全能性

答案D

解析过程①获得的原生质体不能悬浮在3（）%的蔗糖溶液中，30%的蔗糖溶液可

导致原生质体失水皱缩甚至死亡，A错误；过程②为再分化过程，需提高细胞分

裂素的比例以促进芽的分化，B错误；③可以表示诱导根的分化形成幼苗，此时

细胞壁已经形成，秋水仙素的主要作用是抑制纺锤体的形成，使细胞中的染色体

数目加倍，C错误；原生质体虽无细胞壁，但含有细胞核等结构，即含有全部的

遗传信息，原生质体仍保持细胞的全能性，D正确。

3.（2022•江苏扬州月考）2019年1月24日，我国科学家宣布世界首批疾病克隆猴

——5只生物节律紊乱体细胞克隆猴在中国诞生，开启了克隆猴模型应用于生命

科学研究的“春天”。科学家采集了一只一岁半的、睡眠紊乱最明显的BMAL1（生

物节律基因）敲除猴A6的体细胞，通过体细胞核移植技术,获得了5只克隆猴——

这是国际上首次成功构建的一批遗传背景一致的生物节律紊乱掰猴模型。下列相

关叙述错误的是（）

A.体细胞核移植技术的基础是动物细胞培养

B.5只克隆猴细胞的核基因型与核供体细胞的完全一致

C.取自新鲜卵巢的卵母细胞可以直接作为受体细胞使用

D.该研究可以弥补实验狒猴繁殖周期长、单胎数量少的不足

答案C

解析动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础，A正确；克隆猴细胞

核基因型与核供体细胞完全一致，细胞质基因来源于受体细胞，B正确；体细胞

核移植需用取自新鲜卵巢的卵母细胞培养到减数第二次分裂的中期，再做受体细

胞，C错误；克隆动物可大量繁殖，可弥补实验猾猴繁殖周期长、单胎数量少的

不足，D正确c

4.（2022•河北衡水金卷）胚胎干细胞在揭示人与动物的发育机制、药学研究、细胞

替代治疗及基因治疗中有着广阔的应用前景。不同物种、不同胚胎之间存在较大

的差异，不同物种胚胎干细胞的建系方法和培养条件也各不相同，研究人员对阿

尔巴斯白绒绵羊胚胎干细胞的培养条件开展了相关研究。回答下列问题：

⑴通过体内受精获得胚胎干细胞的过程中，应对处于发情期的阿尔巴斯白绒母

绵羊注射促性腺激素，目的是。

选用优质公羊与其交配48〜80h后，从母绵羊的（部位）冲卵回收得到早

期胚胎。

（2）培养羊早期胚胎前先取小鼠的成纤维细胞制备饲养层细胞，在小鼠的成纤维

细胞培养液中加入可将其从培养瓶的瓶壁上分离下来形成单细胞悬液。

将羊早期胚胎置于饲养层细胞上培养的R的是

羊胚胎干细胞在形态上表现为

⑶研究人员配制A、B两种胚胎干细胞的培养液时，均添加了1（）0RJ/mL青霉素

和0.05mg/mL链霉素，加入青霉素和链霉素的目的是

（4）若探究机械法（用口吸管将内细胞团切割成小块）、酶消化法、培养液A、培养

液B对胚胎干细胞传代培养的影响，请补充完整实验组的处理：实验组1：机械

法获取胚胎干细胞+培养液A,实验组2：

实验组3：机械法获取胚胎干细胞+培养液B；实验组4：

答案（1）促进母绵羊排出更多卵细胞（超数排卵），以便获得多枚胚胎输卵管

⑵胰蛋白酶（或胶原蛋白酶）维持胚胎干细胞处于不分化状态体积小、细胞核

大、核仁明显(3)抑制微生物的生长繁殖，避免培养过程中出现杂菌污染

(4)酶消化法获取胚胎干细胞+培养液A酶消化法获取胚胎干细胞+培养液B

微专题2基因工程(含PCR技术)

讲•核心要点

1.基因工程的基本工具

识别双链DNA分广的特定核甘酸

心铀木画卜序列,并切开特定部位两个核件

内切核K酸之间的磷酸二酯键

丽＞产生黏性末端或平末端

f7T7j?L能将双链DNA片段“缝合”起来,

匹史厂恢复被限制的切开的磷酸二酯健

^DNAV

连接我1阿/E.co/iDNA连接醵：连接黏性末端

国fT4DNA连接酶：既能连接黏性末端

也能连接平末端

叵奥卜质:粒、噬菌体、动植物病毒等

幽或［前其］能自我攵制；有一个至多个限制

备的卜酶切割位点：有特殊的标记基因：

条件对受体细胞无毒害

提醒①基因工程中的载体与细胞膜上的载体不同。

②若用两种不同的限制酶同时切割目的基因和同时切割载体，则可使基因和载体

定向连接，避免自身环化和反向连接，提高连接的有效性。

2.基因工程的四个操作步骤

(1)目的基因的筛选与获取

询矶/通过构建基因文库来获取

因获扇卜利H1PCR获取和扩增目的基因

提醒①目的基因主要是指编码蛋白质的基因。

②在已有mRNA前提下，可通过逆转录法获取目的基因。

③当基因较小且序列已知时，可采用化学合成法进行人工合成。

（2）基因表达载体的构建——重组质粒的构建

提醒I①启动子、终止子

a.启动子（DNA片段）W起始密码子（位于mRNA上）0

b.终止子（DNA片段）W终止密码子（位于mRNA上）。

②目的基因插入位置：启动子与终止子之间。

③利用乳腺生物反应器生产药物时，应将目的基因与孔腺中特异表达的基因的启

动子连接到一起，再通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中。

（3）将目的基因导入受体细胞

细胞类型植物细胞动物细胞微生物细胞

农杆菌转化法、花粉

常用方法显微注射技术Ca2+处理法（感受态细胞法）

管通道法

原核细胞

受体细胞受精卵、体细胞受精卵

使用最广泛的是大肠杆菌

提醒辨析农杆菌转化法中的“两个两次”

①两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA的中间部位；第

二次拼接指被插入目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞染色体的DNA上。

②两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；第二次导

入是指将含目的基因的T-DNA导入受体细胞。

(4)目的基因的检测与鉴定

检测日的基因是否插入

/受体细胞染色体DNA上、方法(。♦鼠取

石？g检测口的基因是否转录拷专一」

出玖^出mRNA

\检测目的基因是否翻译睨加二江

出蛋白质体杂交

手外互切抗虫或抗病接种实验等

3.PCR技术及应用

(l)PCR技术原理与条件

k7V聚合而链式反应的缩写,是一种体

慢凶一外迅速扩增DNA片段的技术

区理卜DNA半保留复制

；模板DNA、引物、四种脱辄核甘酸、

'［条件小缓冲液(含Mg2+)、耐高温的DNA

PC聚合晦(TaqDNA聚合幅)

技JR

术

原

理仔词—有一段已知目的甚因的核苛酸序列.

与也也「根据这一序列合成引物

条

J［扩增］_DNA的合成方向总是从子链的5'端

|方向向3,端延伸

西而—是一小段RNA或单链DNA.它能与

但广DNA母链的一段碱基序列互补配对

।叵圆-短时间内大量扩增目的基因

，--中负电先向正执力何抄引

［产物鉴定小常亲用卿斤然凝眩电泳达

(2)PCR技术的过程

当温度上升到90七以上时.双链DNA解

碉）聚为单链

勘！Idlllllllllll耳

|力口热至90~95t

!3,।i।Hi।।।11—5，5r।।।।।।।।।।।-3r

温度卜.降到5。t左右时,两种引物通过碱

基互补配对与两条单链DNA结合

vJJJllL'J1"5,"".MLLLLLv

引物I'引物0

I:当温度上升到72七左右时,耐高温的DNA

他J聚佥通从引物开始进行互补链的合成（从5'

明;端向北端延伸）

5'5'

ILLLIJ-3'

5^UJJILLULL3'3'-5'

引物I引物n

提醒可通过引物控制PCR扩增的基因片段，并在基因两侧引入限制酶识别序

列。

4.蛋白质工程

(

操从预期的蛋白质功能出发

段I

蛋设计预期的蛋白质结构

一

设

白I

计

质推测应有的氨基酸序列

一

万

_■­--流

工

_蛋

现

造

程

改

或I

程

制

_成找到并改变相对应的服

白

，

新

的

种

_一氧核苜酸序列（基因）

_造

白

质

蛋或合成新的基因

一

一

、

一

一I

获得所需要的蛋白质

练-高考重点

1.（2021・辽宁卷，4）下列有关细胞内的DNA及其复制过程的叙述，正确的是（）

A.子链延伸时游离的脱氧核甘酸添加到3,端

B.子链的告成过程不需要引物参与

C.DNA每条链的5,端是羟基末端

D.DNA聚合酶的作用是打开DNA双链

答案A

解析细胞内DNA复制时，子链延伸方向为故游离的脱氧核昔酸添加

到3,端，A正确；子链的合成过程需要引物参与，B错误；DNA每条链的夕端

是磷酸基团末端，3,端是羟基末端，C错误；解旋酶的作用是打开DNA双链，D

错误。

2.（2021•湖北卷，16）某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的

基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配

对）。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是（）

A.增加模板DNA的量B.延长热变性的时间

C.延长延伸的时间D.提高复性的温度

答案D

解析PCR过程中，引物和模板不完全配对会形成非特异条带，增加模板DNA

的量不会减少反应中非特异条带的产生，A错误；延长热变性的时间，有利于双

链DNA解聚为单链，不能减少反应中非特异条带的产生，B错误；延长延伸的

时间，有利于合成新的DNA链，但不能减少反应中非特异条带的产生，C错误：

在一定温度范围内，选择较高的复性温度可减少引物和模板间的非特异性结合，

D正确。

3.（2021.江苏卷，13）下图是剔除转基因植物中标记基因的一种策略，下列相关叙

述错误的是（）

目的无筛选标记

基因农杆菌1

标记