人工细胞工厂设计构建 课件 第7章-谷氨酸棒杆菌 课件

第七章人工谷氨酸棒杆菌细胞工厂6.1概述6.2常用元件与构建工具6.3L-谷氨酸族细胞工厂6.4L-天冬氨酸族细胞工厂6.5支链氨基酸的细胞工厂构建人工谷氨酸棒杆菌细胞工厂6.1概述概述第七章人工谷氨酸棒杆菌细胞工厂6.1.1细胞结构与功能布局6.1.2基因组与遗传特点6.1.3生理与代谢特点6.1.4应用与进展细胞结构与功能布局谷氨酸棒杆菌（1）分类与细胞形态谷氨酸棒杆菌的扫描电镜图属于细菌界、放线菌门、放线菌纲、分支杆菌目、棒状杆菌科、棒状杆菌属、谷氨酸棒杆菌种，革兰氏阳性菌。在工业生产中广泛应用的主要有

C.glutamicum

ATCC13032、C.glutamicum

ATCC14067等。菌落表面湿润，圆形，稍凸起，边缘整齐，有光泽，半透明。显微镜下观察主要特征为细胞呈短杆或小棒状，有时微弯曲，两端钝圆，不分支，单个、成对或“八”字形排列，该菌不产芽孢，不运动，无荚膜，兼性厌氧，生物素营养缺陷型，G+C的含量为53.55%。细胞结构与功能布局谷氨酸棒杆菌（2）细胞结构谷氨酸棒杆菌无荚膜，没有鞭毛和菌毛。细胞结构由细胞核、细胞质、细胞膜和细胞壁组成。谷氨酸棒杆菌具有独特的细胞壁特性，具体的细胞壁结构由内向外为：（1）细胞膜（称为内膜）：磷脂双分子层（2）细胞膜外侧：狭窄的空间，内含多种蛋白质（3）细胞壁：含肽聚糖和脂质，细胞壁的骨架是由肽聚糖网组成的霉酰阿拉伯半乳聚糖肽聚糖（mAGP）（4）外膜：分枝菌酸——棒状杆菌的标志（5）外层：多糖和蛋白基因组与遗传特点谷氨酸棒杆菌（1）基因组C.glutamicumATCC13032的基因组由一条环形染色体组成，全长3282708bp，平均G+C含量为53.8%。含3002个潜在基因，其中只有263个基因是C.glutamicumATCC13032所特有的。基因组胞浆蛋白1518个（占51%）膜蛋白660个（占33%）分泌蛋白311个（占10%）6个rRNA操纵子60个tRNAs263个产物未知基因组与遗传特点谷氨酸棒杆菌（2）密码子使用偏好性（3）编码蛋白质特点蛋白的质量大小分布广泛，2.4kDa到316.7kDa；等电点范围为3.3至13.12；2363种蛋白质（77%）在酸性pH范围内表现出pI值低于7.0，695种蛋白质（23%）pI值高于7.0；氨基酸密码子使用频率%丙氨酸GCA30.66GCC27.18GCG23.15GCU24.96半胱氨酸UGC4.87UGU2.66天冬氨酸GAC26.11GAU32.89谷氨酸GAA35.50GAU27.41苯丙氨酸UUC22.87UUU13.78起始密码子AUG、GUG、UUG的使用频率分别为66.5%、23.1%、10.3%；终止密码子UAA、UAG、UGA的使用频率分别为23.4%、20.9%、55.7%；部分氨基酸密码子使用频率%分布生理与代谢特点谷氨酸棒杆菌（1）

碳代谢和氮代谢磷酸烯醇丙酮酸盐依赖性葡萄糖磷酸转移酶系统（PTSGlc）肌醇渗透酶和葡萄糖激酶偶联系统β-葡萄糖苷PTS渗透酶和葡萄糖激酶的偶联系统糖酵解途径、磷酸戊糖途径、三羧酸循环基础碳代谢葡萄糖摄取途径氮源吸收铵转运蛋白AmtB谷氨酸脱氢酶/谷氨酸合成酶/谷氨酰胺合成酶的同化作用PII信号转导调节蛋白GlnK的尿苷酰化/去尿苷酰化调节生理与代谢特点谷氨酸棒杆菌（2）生长条件最佳生长pH值在7.0-8.5；最适温度为30℃，超过40℃时生长停止；高底物或产物浓度下会造成渗透胁迫（高渗透压下，滞后期延长，对葡萄糖和氮源的摄取率降低，发酵时间相应增加）；（3）细胞周期繁殖速度相对较慢生长速率=0.34h-1应用与进展谷氨酸棒杆菌菌株优良特征使谷氨酸棒杆菌成为优秀的底盘细胞，利用新一代碱基编辑技术和合成生物学技术延长和优化代谢途径，使其在生物产业上的应用潜力不断被挖掘，产物谱已经从传统氨基酸转向生产高值化学物质。谷氨酸棒杆菌发酵生产氨基酸及其衍生物6.2常用元件与构建工具谷氨酸棒杆菌细胞工厂6.2.1常用元件6.2.2常用质粒6.2.3遗传转化方法6.2.4构建工具谷氨酸棒杆菌具有的常用元件包括质粒载体、表达元件等。质粒表达系统的元件包括启动子、复制起点、抗性选择标记、5'-非翻译区、表达框以及终止子。常用元件谷氨酸棒杆菌常用质粒中大多数为自主复制型载体质粒大多数以滚环模式进行复制，这也是大多数棒状杆菌的天然质粒所具有的复制方式。谷氨酸棒杆菌中常用的质粒载体注：以下均为大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭质粒质粒复制子拷贝数启动子终止子筛选标记大小pWLQ2pSR1中Ptac／KanR8.30pEKEx1pBL1中PtacrrnBKanR8.20pXMJ19pBL1中PtacrrnBChlR6.60pVWEx1pCG1中PtacrrnBKanR8.50pDXW-10pBR322中Ptac-MrrnBKanR8.35pK18mobsacBpBR322中Plac／KanR5.72pEC-XK99EpGA1高PtrcrrnBKanR7.02pCHpMB1中HCErrnBKanR6.92pGEX-6p-1pMB1中Ptac／AmpR4.98常用质粒谷氨酸棒杆菌谷氨酸棒杆菌的遗传转化方法通常采用的是电击转化法原理是利用脉冲电场使细胞膜形成暂时性的孔洞，通过这些孔洞将外源DNA引入到细胞内。谷氨酸棒杆菌遗传转化方法谷氨酸棒杆菌常用的构建工具：同源重组工具：依赖于自杀质粒介导的同源重组②CRISPR/Cas系统：CRISPR基因编辑系统对基因组精确修饰谷氨酸棒杆菌构建工具6.3L-谷氨酸族细胞工厂谷氨酸棒杆菌细胞工厂6.3.1L-精氨酸理化性质及应用6.3.2L-精氨酸细胞工厂设计6.3.3L-精氨酸细胞工厂的构建6.3.4发酵工艺优化理化性质及应用L-谷氨酸族细胞工厂L-精氨酸分子结构式L-精氨酸的理化性质及应用半必需氨基酸，分子式为C6H14N4O2，分子量为174.2；常态下是白色晶体粉末，微溶于乙醇，易溶于水；能与α-萘酚在碱性溶液中发生红色坂口反应；在医药、食品、化妆品、饲料等行业中有广泛应用；L-谷氨酸族氨基酸及其衍生物包括：L-精氨酸、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺、L-鸟氨酸、γ-氨基丁酸、反式-4-羟基-L-脯氨酸等。以L-精氨酸为例介绍L-谷氨酸族细胞工厂的设计与构建L-谷氨酸族细胞工厂细胞工厂的设计L-精氨酸生产菌株的构建前体供应模块：主要是L-谷氨酸合成模块；L-精氨酸模块：包括从L-谷氨酸到L-精氨酸的途径，包含8步酶催化反应；氮代谢模块：L-精氨酸是天然氨基酸中N:C比最高的氨基酸，因此胞内氮代谢调控十分重要；辅因子模块：辅因子NADPH和能量ATP是L-精氨酸合成的重要限制因素；L-精氨酸细胞工厂包括以下几个模块：L-谷氨酸族细胞工厂细胞工厂的构建解除关键酶Nagk的反馈调控（E19Y，F91H和K234T等突变）强化合成基因簇表达（敲除阻遏蛋白ArgR和FarR）强化前体供给（主要是L-谷氨酸的供应）强化辅因子供应（NADPH）调控氮代谢（加强氮源吸收和铵同化作用）强化胞外转运（强化运输蛋白lysE表达）生物传感器的构建与应用（ARG-ON）高通量筛选的生物传感器的构建L-精氨酸合成的氮代谢调控L-精氨酸合成具有代谢路径长、调控节点多、氨氮水平高等特点，可通过对代谢网络调节重构实现L-精氨酸的高效合成。L-谷氨酸族细胞工厂发酵工艺优化由于质粒具有不稳定性，将过表达的基因整合至基因组上，构建无质粒菌株用于生产发酵；对生产菌株进行发酵工艺优化是实现高产酸、高转化率等不可缺少的步骤，可从以下几个方面进行优化：氮调控：发酵培养基中同时添加有机氮源和无机氮源；pH控制：通过流加氨水维持培养基的pH=7.0；溶氧控制：发酵前期进行高供氧，发酵中后期进行中供氧；胞内渗透压稳态调节：添加K+和PO43-调节胞内离子浓度和渗透压稳态等；6.4L-天冬氨酸族细胞工厂谷氨酸棒杆菌细胞工厂6.4.1L-赖氨酸理化性质及应用6.4.2L-赖氨酸细胞工厂设计6.4.3L-赖氨酸细胞工厂的构建6.4.4发酵工艺优化L-天冬氨酸族细胞工厂理化性质及应用L-赖氨酸的理化性质及应用分子式：C6H14N2O2，分子量：146.19；常温下呈无色无臭的片状晶体；具有调节体内代谢平衡、促进机体生长发育等功能，因此被应用于饲料、医药及食品工业中。L-天冬氨酸族氨基酸包括：L-天冬氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸等。L-赖氨酸分子结构式以L-赖氨酸为例介绍L-天冬氨酸族细胞工厂的设计与构建L-天冬氨酸族细胞工厂细胞工厂的设计L-赖氨酸细胞工厂包括以下几个模块：前体供应模块：

即L-天冬氨酸合成模块；L-赖氨酸模块：包括从L-天冬氨酸到L-赖氨酸的10步酶催化反应；辅因子模块：辅因子NADPH和能量ATP是L-赖氨酸合成的重要限速因素；细胞工厂的构建L-天冬氨酸族细胞工厂解除关键酶AK的反馈抑制（C923T，T311I突变）强化关键基因的表达（lysC、dapA等）增强前体物质的供应（主要是草酰乙酸的供应）强化L-赖氨酸胞外转运能力（强化运输蛋白lysE表达）强化辅因子NADPH的供给（减少TCA途径通量，增加PPP途径通量）L-赖氨酸细胞工厂的构建策略：发酵工艺优化L-天冬氨酸族细胞工厂氮源：以硫酸铵作为无机氮源；pH控制：通过流加氨水维持培养基的pH=7.0。溶氧控制：使溶氧控制在30%左右；流加糖发酵法：防止造成菌体生长适应期延长和糖酸转化率下降；胞内渗透压稳态调节：添加有机渗透调节剂；用于发酵生产L-赖氨酸的菌株为基因组整合型工程菌株；根据L-赖氨酸合成特点，发酵工艺可以从以下几个方面进行优化：6.5支链氨基酸的细胞工厂构建谷氨酸棒杆菌细胞工厂6.5.1L-缬氨酸理化性质及应用6.5.2L-缬氨酸细胞工厂设计6.5.3L-缬氨酸细胞工厂的构建6.5.4发酵工艺优化支链氨基酸的细胞工厂构建理化性质及应用L-缬氨酸的理化性质及应用必需氨基酸，分子式：C5H11NO2，分子量：117.46；常温下为白色结晶粉末，需干燥状态下避光保存；广泛应用于医药、农业和动物饲料添加剂等行业；支链氨基酸即缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的统称，是蛋白质中常见的三种氨基酸。L-缬氨酸的化学结构以L-缬氨酸为例介绍支链氨基酸细胞工厂的设计与构建支链氨基酸的细胞工厂构建细胞工厂的设计L-缬氨酸细胞工厂包括以下几个模块：前体供应模块：主要是丙酮酸合成模块；L-缬氨酸合成模块：从丙酮酸到L-缬氨酸的途径，包括4步酶催化反应；辅因子模块：辅因子NADPH的水平是影响L-缬氨酸合成的重要因素；支链氨基酸的细胞工厂构建细胞工厂的构建解除关键酶AHAS反馈抑制（S41V