动物细胞工程高二下学期生物人教版选择性必修3

2.2.1动物细胞工程从社会中来在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。那么，怎样才能获得大量的自体健康皮肤？能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？通过细胞培养构建的人造皮肤可以从病人身上取少量正常、健康的皮肤在体外进行培养、扩增；目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获得适合临床上使用的人造皮肤。动物细胞培养动物细胞核移植动物细胞融合动物细胞工程技术动物细胞工程动物细胞工程的基础一、动物细胞培养1.概念：从动物体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术2.原理：操作原因：将相关组织分散成单个细胞，细胞所需的营养容易供应，其代谢废物容易排出。细胞增殖（有丝分裂）动物细胞工程的基础4.地位：胚胎或幼龄动物的细胞，因为这些组织或细胞的生命力旺盛，分化程度低，分裂能力强，容易培养。3.培养对象：获得细胞或细胞产物（人造皮肤的构建，动物分泌蛋白的规模化生产等），不能获得完整动物个体。5.目的：动物细胞培养所需的基本条件营养物质其他条件<<糖类氨基酸无机盐维生素无菌、无毒的环境适宜的温度、pH和渗透压适宜的气体环境（一）动物细胞培养的条件（一）动物细胞培养的条件1.营养条件（1）培养基的构成：①合成培养基：将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基；营养物质主要包括：糖类、氨基酸、无机盐、维生素等。②血清等天然成分：由于人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚，因此，在使用合成培养基时，通常需要加入血清等一些天然成分。（2）培养基类型：合成培养基

+血清等天然成分培养动物细胞一般用液体培养基，也叫培养液不能以淀粉、蔗糖为碳源（一）动物细胞培养的条件2.无菌、无毒的环境①对培养液和所有培养用具进行灭菌处理②在无菌环境下进行操作定期更换培养液，以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。（1）无菌（2）无毒思考：如何防止培养过程中的微生物污染？③在细胞培养液中添加适量的抗生素（一）动物细胞培养的条件3.温度、pH和渗透压（1）哺乳动物细胞培养的温度多以（36.5±0.5）℃为宜。（2）适宜的pH：多数动物细胞生存的适宜pH为7.2-7.4。（3）适宜的渗透压：维持细胞正常的形态和功能。4.气体环境（3）通常采用培养皿或松盖培养瓶，并将它们置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。（1）O2：细胞代谢所必需的。（2）CO2：主要作用是维持培养液的pH。▲

培养瓶▲

培养皿CO2培养箱（二）动物细胞培养的过程取动物组织分散成单个细胞传代培养制成细胞悬液原代培养（二）动物细胞培养的过程取动物组织分散成单个细胞传代培养制成细胞悬液原代培养制成细胞悬液取动物组织1.取动物组织(1)取材对象:(2)取材原因:一般选取动物胚胎或幼龄动物的组织、器官细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养（二）动物细胞培养的过程取动物组织分散成单个细胞传代培养制成细胞悬液原代培养2.分散成单个细胞(1)原因：(2)方法：①成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖。②利于细胞与培养液充分接触，更易进行物质交换。（保证细胞所需的营养物质供应及有害产物及时排出）①机械法②用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间制成细胞悬液取动物组织动物细胞间的物质主要是蛋白质。不行。旁边思考栏：进行动物细胞培养时常用胰蛋白酶分散细胞，这说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？注意：不能用胃蛋白酶将组织分散成单个细胞，因为胃蛋白酶的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性。多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4，胃蛋白酶在此环境中变性失活。思考：胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？将动物组织分散成单个细胞时要注意什么问题呢？能，应注意时间的控制。（二）动物细胞培养的过程取动物组织分散成单个细胞传代培养制成细胞悬液原代培养3.制成细胞悬液制成细胞悬液取动物组织放入CO2培养箱中培养转入培养液中进行原代培养

(1)用_________将细胞制成细胞悬液。培养液(2)将细胞悬液放入_________________内，置于适宜环境中进行__________。培养皿或培养瓶原代培养（二）动物细胞培养的过程这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上，这种现象称为细胞贴壁。取动物组织分散成单个细胞传代培养制成细胞悬液原代培养4.原代培养(1)概念：(2)体外培养的细胞类型：指动物组织经处理后的初次培养。悬浮生长的细胞贴壁生长的细胞①悬浮生长类（少数）细胞能够悬浮在培养液中生长增殖。细胞需要贴附于某些基质表面才能生长增殖。②贴壁生长类（大多数）要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。思考：细胞培养一段时间，分裂会受阻，这是为什么？怎样解决这一问题？悬浮生长贴壁生长(大多数）细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏等接触抑制细胞分裂受阻解决传代培养分瓶培养②制成细胞悬液，分瓶培养①收集细胞悬浮培养的细胞:直接用离心法收集贴壁细胞:用胰蛋白酶等处理分散成单个细胞，再离心法收集接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖。（二）动物细胞培养的过程取动物组织分散成单个细胞传代培养制成细胞悬液原代培养5.传代培养怎么区分原代培养和传代培养？判断依据：是否分瓶！制成细胞悬液取动物组织放入CO2培养箱中培养放入CO2培养箱中培养传代培养转入培养液进行原代培养

原代培养：指动物组织经处理后的初次培养。传代培养：分瓶后的细胞培养。思考正常细胞平面观（2）癌变细胞没有接触抑制现象，可以在培养瓶中形成多层细胞。肿瘤细胞失去接触抑制（1）正常细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，当细胞相互接触，细胞停止分裂增殖，数量不再增加，最后形成一层（或单层）。延伸拓展：

正常细胞增殖到相互接触的时候，糖蛋白识别了这种信息，就会使细胞停止继续增殖，出现接触抑制的现象。

癌细胞细胞膜表面糖蛋白等物质显著减少，失去接触抑制，适宜条件下可以无限增殖。思考：为什么癌变细胞没有接触抑制现象？细胞悬液细胞株10代细胞50代细胞细胞系无限传代遗传物质改变细胞系遗传物质一般不改变延伸拓展：细胞株和细胞系细胞株：原代培养的细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40~50代，这种传代细胞为细胞株。保持细胞正常的二倍体核型。细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。具有异倍体核型。区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制。海拉细胞系

来自一位美国黑人妇女海瑞塔·拉克斯的宫颈癌细胞，在1951年进行细胞取样后，她于6个月后去世。这一细胞系是永生的，也就是说，只要有合适的培养环境，它们就能在细胞培养基中无限分裂下去。

不同于其他一般的人类细胞，此细胞不会衰老死亡，并可以无限分裂下去。此细胞系跟其他癌细胞系相比，增殖异常迅速。归纳总结：植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目植物组织培养动物细胞培养原理培养基性质培养基特有成分培养过程培养结果培养目的相同点获得细胞或细胞产物常用固体培养基完整植株动物血清常用液体培养基细胞增殖植物细胞的全能性获得大量细胞快速繁殖等植物激素①培养过程中细胞都进行有丝分裂，不涉及减数分裂；②均需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件。原代培养、传代培养脱分化、再分化趣味交互活动单击上方链接1.活动链接2.操作方法打开界面根据各关卡的文本和语音提示进行拖拽或选择操作3.活动界面预览动物细胞培养大闯关1.

概念：动物和人体内仍保留的少数具有分裂和分化能力的细胞。在一定条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。2.

分布：干细胞存在于

、

和

等多种组织和器官中。早期胚胎骨髓脐带血3.

特点：（三）干细胞培养及其应用体积较小，细胞核大，核仁明显。4.

分类：胚胎干细胞成体干细胞按来源全能干细胞多能干细胞按分化潜能专能干细胞5.胚胎干细胞（ES细胞）①分布：存在于早期胚胎中②特点：具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。③应用实例：ES细胞在体外分化成心肌细胞、神经元细胞和造血干细胞等④局限性：必须从胚胎中获取，涉及伦理问题，因而限制了在医学上的应用。▲

电镜下的胚胎干细胞（照片经后期人工上色处理，放大约1500倍）①分布：存在于成体组织或器官内6.成体干细胞睾丸中的精原干细胞②举例：骨髓中的造血干细胞神经系统中的神经干细胞血细胞和免疫细胞分化分化神经细胞分化精原细胞③特点：一般认为，成体干细胞具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。④

是发现最早、研究最多、应用也最为成熟的一类成体干细胞，主要存在于成体的骨髓、外周血和脐带血中。造血干细胞⑤应用：正常造血干细胞患者体内受损的血细胞修复或替换移植治疗白血病恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍疾病（1）造血干细胞正常神经干细胞患者体内受损的神经组织神经组织损伤修复或替换移植治疗神经系统退行性疾病（帕金森病、阿尔茨海默病）（2）神经干细胞（1）概念：通过体外诱导成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，称为诱导多能干细胞，简称iPS细胞。⑥诱导多能干细胞（iPS细胞）知识拓展：成纤维细胞是疏松结缔组织的主要细胞成分。细胞扁平，多突起，呈星状，细胞质较丰富，细胞核较大，扁卵圆形，染色质疏松着色浅，核仁明显。①借助载体将特定基因导入细胞

③用小分子化合物诱导形成②将特定蛋白导入细胞（2）制备方法：①可治疗镰状细胞贫血症；②在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展①诱导过程无须破坏胚胎；②iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。优于胚胎干细胞（4）优点：（3）应用实例：⑦干细胞应用面临的问题及展望干细胞将在再生医学、药物安全性与有效性检测等领域发挥大作用。（1）面临的问题：存在导致肿瘤发生的风险。（2）应用展望：动物细胞培养的原理和目的动物细胞培养的条件动物细胞培养的过程原理：细胞的增殖目的：获得细胞或细胞产物(1)营养条件(2)无菌、无毒的环境(3)适宜的温度、pH和渗透压(4)适宜的气体环境取动物组织单个细胞细胞悬液原代培养传代培养干细胞培养及其应用干细胞的种类、特点及应用iPS细胞的培养和应用课堂小结动物细胞培养2.2.2动物细胞融合技术与单克隆抗体植物体细胞杂交技术A细胞B细胞正在融合的原生质体B原生质体A原生质体杂种细胞再生出细胞壁再分化杂种植株移栽移栽后的植株脱分化愈伤组织植物细胞的全能性细胞膜的流动性植物细胞融合植物组织培养去除细胞壁诱导融合物理法：化学法：电融合法、离心法等聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+—高pH融合法等原理：植物体细胞杂交技术的优势：打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育出新的作物类型。

知识回顾马的动物细胞A天鹅的动物细胞B飞马？有没有技术能让不同种动物的体细胞进行杂交，培育出集不同细胞的优势于一身的动物细胞呢？实例：1970年，人—鼠细胞荧光标记融合实验人细胞鼠细胞红色荧光染料标记的膜蛋白绿色荧光染料标记的膜蛋白细胞融合人鼠杂交细胞37°培养40min细胞融合实验表明：细胞膜具有流动性

19世纪30年代，科学家曾在肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？肺结核病人病理切片病人体内病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。一、动物细胞融合技术1.概念：2.结果：3.原理：细胞膜具有一定的流动性。使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。形成单核的杂交细胞，即融合后形成的杂交细胞是具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞。4.诱导融合的常用方法（1）物理法：电融合法（3）生物法：灭活病毒诱导法（2）化学法：聚乙二醇（PEG）融合法与植物原生质体融合的方法相同——动物细胞融合所特有的融合方式思考1.“灭活病毒”中灭活的具体含义是什么？

用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。病毒紫外线灭活丧失感染活性（不感染细胞）保留融合活性（诱导细胞融合）2.灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么？

病毒表面的糖蛋白和一些酶与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。细胞核融合：融合完成的标志灭活的仙台病毒用于细胞融合思考：动物细胞进行融合，与植物有哪些不同之处？无需去除细胞壁；全能性受限制，不能培育成新的动物个体。显微镜下的动物细胞融合一、动物细胞融合技术7.意义：细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。至今，种间、属间、科间、甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得了成功。（1）研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。（2）利用动物细胞融合技术而发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。8.应用植物体细胞杂交动物细胞融合原理细胞融合前的处理方法诱导细胞融合的方法细胞融合成功的标志主要用途意义细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性细胞膜具有一定的流动性用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞电融合法、离心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法电融合法、PEG融合法、灭活病毒诱导法再生出细胞壁细胞核的融合获得完整的杂种植株主要用于制造单克隆抗体打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能9.植物体细胞杂交和动物细胞融合比较二、单克隆抗体及其应用做核酸：这个场景大家再熟悉不过了居家隔离不能出去做核酸怎么检测？抗原检测试纸阳性阴性无效抗体新冠病毒（抗原）问：还记得抗体是什么细胞产生？主要分布在哪吗？病原体处理呈递辅助性T细胞结合记忆B细胞浆细胞抗体第一信号分裂、分化

并分泌细胞因子分裂分化促进产生分泌第二信号B细胞抗原呈递细胞结合抗体与病原体结合后形成沉淀等，进而被其他免疫细胞吞噬消化。摄取知识回顾：抗体的产生早期获得抗体的方法动物体内抗原浆细胞抗体（血清）反复注射缺点：产量低，纯度低，制备的抗体特异性差,灵敏度低。抗原不纯抗体不纯多种抗体1抗体2抗体3抗体4…….动物体内产生的特异性抗体的种类超过百万种抗原1抗原2抗原3抗原4B细胞1B细胞2B细胞3B细胞4…….每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体刺激刺激刺激刺激需要问：若我们只需要大量的抗体1有什么办法吗？得到若能得到大量的B细胞1就可以能产生抗体1，但不能无限增殖如何解决这一难题？二、单克隆抗体及其应用1975年，英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒设计了一个极富创造性的试验方案：动物细胞融合杂交细胞骨髓瘤细胞（癌细胞）

（能无限增殖）一种B淋巴细胞（只分泌一种特异性抗体）杂交瘤细胞既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体动物细胞培养细胞群专一抗体单克隆抗体克隆化培养米尔斯坦科勒由于由于发明了单克隆抗体的制备技术，1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖。1.单克隆抗体的制备过程融合后，融合的细胞有几种类型？（只考虑两两融合）多种B细胞培养骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞将骨髓瘤细胞和B细胞融合多种杂交细胞诱导融合能产生抗体，但不能大量增殖。不能产生抗体，但能大量增殖瘤-瘤、B-B、

B-瘤注射特定的抗原用特定的抗原免疫，从小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。1.单克隆抗体的制备过程1.单克隆抗体的制备过程杂交瘤细胞抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞（分泌的抗体能和特定的抗原结合）注射到小鼠腹腔内体外培养单克隆抗体第一次筛选：用特定的选择培养基进行筛选：在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。第二次筛选：对经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外大规模培养或者注射小鼠腹腔中增值既能迅速大量增殖，又能产生抗体。拓展链接特点：特异性强、灵敏度高，可大量制备。拓展链接基本原理：细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基蝶呤阻断。人B淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不能分裂增殖。

即：鼠骨髓瘤细胞是一种代谢缺陷型株系，DNA合成只有D途径，没有S途径，但能不断分裂增殖。若D途径被阻断，它会因不能合成DNA而死。

即：不能无限增殖B淋巴细胞合成DNAD途径S途径能无限增殖骨髓瘤细胞合成DNAD途径返回链接培养基中加入氨基喋呤阻断DNA复制的D途径B淋巴细胞及同型融合细胞不能无限增殖，死亡骨髓瘤细胞及同型融合细胞不能合成DNA，死亡杂交瘤细胞能无限增殖，生长一般用HAT培养基，由次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T），3种关键成分配制而成。第一次筛选获得杂交瘤细胞将杂交瘤细胞群稀释后滴入96孔板，尽量每孔1个杂交瘤细胞进行培养（克隆化培养）一段时间后，用标记的抗原检测各孔上清液中细胞分泌的抗体上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔，说明里面含有所需杂交瘤细胞足够数量的能分泌所需抗体的单一杂交瘤细胞96孔细胞培养板阳性孔抗体检测板多次克隆化培养以及有限稀释法抗原-抗体杂交法抗体检测方法：返回链接抗体检测原理：抗原和抗体能特异性结合第二次筛选获得产生专一抗体的杂交瘤细胞（1）杂交瘤细胞的特点___________________________________________（2）第一次筛选的目的______________________（3）第二次筛选的目的_______________________________________

如何筛选___________________________________________________

选择抗体检测呈____性的杂交瘤细胞（3）抗体检测原理_____________________________________获得能分泌所需抗体的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）抗体与抗原能够特异性结合既能迅速大量增殖，又能产生专一性抗体（4）如何获取大量所需杂交瘤细胞_________________________________________________（5）如何获取单克隆抗体①体外培养___________________________②小鼠腹腔内培养_________________________（6）单克隆抗体的优点_________________________________________________________________________________在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖从细胞培养液中获取从小鼠腹水中获取能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，阳并且可以大量制备获得杂交瘤细胞小结1：单克隆抗体的制备过程相关知识点小结2：培养杂交瘤细胞的方法比较项目腹腔培养体外培养优点缺点易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低规模小，产量少可大规模培养，大量生产需要人为控制培养条件，成本相对较高第一次筛选第二次筛选原因方法结果诱导融合后得到的细胞中，除杂交瘤细胞之外，还有未融合的亲本细胞，也有融合的具有同种核的细胞用特定的选择培养基进行