动物细胞培养高二下学期生物人教版选择性必修3

DNA是主要遗传物质

第二章细胞工程第2节动物细胞工程第1课时

动物细胞培养选必三RENJIAOBANGAOZHONGSHENGWUXUANBISAN科技探索之路：动物细胞工程（含胚胎工程）的发展历程首例胚胎移植成功首创动物组织体外培养法发现哺乳动物精子获能现象体细胞核移植成功试管家兔诞生创立单克隆抗体技术胚胎分割移植成功分离和培养小鼠胚胎干细胞克隆羊多莉诞生获得诱导多能干细胞单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿诞生我国科学家首次培育了体细胞克隆猴。1890年1907年1951年1958年1959年1975年1978年1981年1996年2006年2014年2017年P33动物细胞工程动物细胞工程动物细胞培养动物细胞核移植动物细胞融合和单克隆抗体动物细胞工程的基础克隆猴：中中和华华单克隆抗体人造皮肤小面积烧伤：1）自身健康皮肤？非常有限免疫排斥反应2）使用他人皮肤？患者通过切除+植皮(自身)后恢复可从病人身上取少量正常、健康皮肤在体外进行培养、扩增。大面积烧伤？——动物细胞培养人造皮肤：人体再生术的秘密通过细胞培养构建的人造皮肤大面积烧伤的病人,需要移植健康皮肤

在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。怎样获得大量的自体健康皮肤？能不能用自体皮肤的单个细胞培养可供的移植皮肤？可以从病人身上取少量正常、健康的皮肤在体外进行培养、扩增；目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获得适合临床上使用的人造皮肤，既解决了来源不足，又不会产生排斥反应。

烧伤病人图片动物细胞培养1.概念：2.原理：3.地位：动物细胞工程的基础从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。细胞增殖（分裂）【思考】：动物组织的选择：

幼龄动物or老龄动物幼龄个体的细胞分化程度低、分裂能力强，易培养。动物体组织单个细胞细胞生长和增殖取出分散适宜条件培育的终点：细胞动物细胞培养1.概念：2.原理：3.地位：动物细胞工程的基础从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。细胞增殖（分裂）因为这些组织或细胞的生命力旺盛，分化程度低、分裂能力强，易培养。4.培养对象：胚胎或幼龄动物的细胞5.目的：获得细胞或者细胞产物（不能获得完整动物个体）动物细胞培养的条件营养物质稳定的内环境<<糖类氨基酸无机盐维生素无菌、无毒的环境适宜的温度、pH和渗透压适宜的气体环境那么，动物细胞的培养需要哪些条件呢？1.营养：①合成培养基----已知成分将细胞所需的__________（糖类、氨基酸、无机盐、维生素等）按_____和______严格配制而成的培养基，称为_________。营养物质种类所需量合成培养基②天然成分--未知成分由于人们对细胞所需的营养物质还没有完全搞清楚，因此在使用合成培养基时，通常需加入____等一些天然成分。血清培养动物细胞一般使用__________，也称为______。液体培养基培养液血清中不仅含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等多种营养物质，还有激素及多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，能促进细胞的生长、增殖和贴附。即天然培养基。（1）培养基的构成：合成培养基+血清等天然成分（2）培养基的物理性质不包括淀粉、蔗糖等为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？1、血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，2、氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本成分，其中有些氨基酸动物细胞本身不能合成（称为必需氨基酸），必须由培养液提供。3、血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生长因子；血清还含有多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，这是细胞生长和增殖所必需的，能促进细胞的生长、增殖和贴附。4、因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需添加10%～20%的血清。①对______和____________进行_____处理；②在________下进行操作；③还需要______________。培养液所有培养用具灭菌无菌环境定期更换培养液在细胞培养液中添加一定量的抗生素2.无菌、无毒的环境目的：以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害如何防止培养过程中的微生物污染？思考？①适宜的温度哺乳动物细胞培养的温度多以_______________为宜；②适宜的pH多数动物细胞生存的适宜pH为__________③适宜的渗透压维持适宜渗透压的目的_________________________36.5±0.5℃7.2-7.4维持细胞正常的形态和功能3.温度、pH和渗透压4.气体环境：(1)动物细胞培养所需气体主要有____和_____。①O2：_______________________②CO2：_____________________________(2)容器：通常采用_______或_____________。(3)仪器：置于含有_______和______的混合气体的_____________。O2CO2O2是细胞代谢所必需的CO2的主要作用维持培养液的pH培养皿松盖培养瓶95%空气5%CO2CO2培养箱微生物培养中的作用不同（为自养型微生物提供碳源）带着以下问题阅读教材：1.为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞呢？可用什么方法？2.体外培养动物细胞有哪些类型？3.什么是细胞贴壁？什么是接触抑制？4.什么是原代培养和传代培养？5.为什么要进行分瓶培养？怎么处理？6.动物细胞培养与植物组织培养有什么相同之处与不同之处？取动物组织制成细胞悬液转入培养液原代培养分瓶进行传代培养取动物组织制成细胞悬液转入培养液进行原代培养放入CO2培养箱中培养传代培养放入CO2培养箱中培养细胞贴壁接触抑制培养过程中出现了几个概念：要求：培养瓶（皿）内表面光滑、无毒、易于贴附(1)细胞贴壁:大多数体外培养的细胞需要________________才能生长增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的_____上。贴附于某些基质表面瓶壁培养过程中出现了几个概念：(2)接触抑制:当_____细胞生长到____________时，细胞通常会__________。贴壁表面相互接触停止分裂增殖接触抑制贴壁生长与接触抑制形成一层细胞可形成多层细胞圆球形细胞刚开始铺展贴壁生长（100×）培养的动物细胞贴壁生长并进行有丝分裂（100×）细胞单层贴壁生长铺满瓶壁后出现接触抑制（100×）思考：“细胞增殖到互相接触的时候，糖蛋白识别了这种信息，就会使细胞停止继续繁殖，出现接触抑制的现象”试结合上述解释，阐述癌细胞无接触抑制现象的原因。癌细胞的细胞膜上糖蛋白等物质减少肿瘤细胞失去接触抑制，条件适宜在培养液可以无限增殖下去。培养过程中出现了几个概念：要求：培养瓶（皿）内表面光滑、无毒、易于贴附(1)细胞贴壁:大多数体外培养的细胞需要_________________才能生长增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的_____上。贴附于某些基质表面瓶壁(2)接触抑制:当_____细胞生长到____________时，细胞通常会__________。贴壁表面相互接触停止分裂增殖通常将_______的细胞培养，即动物组织经____后的________称为原代培养；(3)原代培养：(4)传代培养：将_______的细胞培养称为传代培养。分瓶之前处理初次培养分瓶后10代以内的细胞10-50代的细胞

动物组织分散成单个细胞培养（1）培养前，为什么要将动物组织分散成单个细胞？①分散不会限制彼此的生长和增殖；②使细胞与培养液充分接触，一方面保证细胞所需氧气和营养的供应，另一方面保证细胞内代谢产物的及时排出，利于继续培养。根据动物细胞培养的概念，初步构建动物细胞培养的流程：

动物组织分散成单个细胞培养（2）怎样将动物组织分散成单个细胞？机械的方法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间。①说明动物细胞间的物质主要是什么成分？蛋白质机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理根据动物细胞培养的概念，初步构建动物细胞培养的流程：

动物组织分散成单个细胞培养（2）怎样将动物组织分散成单个细胞？机械的方法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间。②用胃蛋白酶可以吗？

不可以，因为多数动物细胞培养的适宜pH为7.2~7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，胃蛋白酶的最适PH为1.5左右。机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理根据动物细胞培养的概念，初步构建动物细胞培养的流程：

动物组织分散成单个细胞培养阅读教材P44“动物细胞培养的过程”，思考、回答下列问题：（2）怎样将动物组织分散成单个细胞？机械的方法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间。③胰蛋白酶处理时间过长，会怎样？机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理根据动物细胞培养的概念，初步构建动物细胞培养的流程：

动物组织分散成单个细胞培养阅读教材P44“动物细胞培养的过程”，思考、回答下列问题：（2）怎样将动物组织分散成单个细胞？机械的方法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间。机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理纤维蛋白、胶原蛋白等根据动物细胞培养的概念，初步构建动物细胞培养的流程：

动物组织分散成单个细胞培养阅读教材P44“动物细胞培养的过程”，思考、回答下列问题：（2）怎样将动物组织分散成单个细胞？机械的方法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间。③胰蛋白酶处理时间过长，会怎样？细胞膜的成分中含有蛋白质，时间长了会破坏细胞结构，对细胞造成损伤机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理根据动物细胞培养的概念，初步构建动物细胞培养的流程：

动物组织分散成单个细胞培养（3）分散成的单个细胞，如何培养？用培养液将细胞制成细胞悬液，放入培养皿或培养瓶内，置于适宜环境中培养。机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理加培养液细胞悬液培养放入培养瓶在适宜条件中根据动物细胞培养的概念，初步构建动物细胞培养的流程：动物组织分散成单个细胞细胞悬液机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理加培养液★体外培养动物细胞分为两类:①悬浮生长细胞细胞能够悬浮在培养液中生长増殖;②贴壁生长细胞（主要类型）细胞需要贴附于某些基质表面才能生长增殖悬浮培养瓶培养放入培养瓶在适宜条件中细胞贴壁接触抑制动物组织分散成单个细胞细胞悬液机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理加培养液培养放入培养瓶在适宜条件中（4）培养一段时间后，细胞分裂会受阻，为什么？接触抑制悬浮生长贴壁生长(大多数）细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏等细胞分裂受阻解决？动物组织分散成单个细胞细胞悬液机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理加培养液培养放入培养瓶在适宜条件中传代培养在适宜条件中分瓶培养

原代培养（5）什么是原代培养和传代培养？判断依据：胰蛋白酶处理的对象和是否分瓶！①原代培养：指动物组织经处理后的初次培养。②传代培养：分瓶后的细胞培养。区分原代培养和传代培养的方法

区分两种培养的关键是看用胰蛋白酶处理的对象和是否分瓶。①分瓶前，第一次用胰蛋白酶对动物组织进行处理后的培养是原代培养。②第二次用胰蛋白酶处理，使细胞从瓶壁上脱离下来，分瓶后的细胞培养为传代培养。思考：用胰蛋白酶两次处理的目的？第一次处理的目的是使组织细胞分散开；第二次处理的目的是使细胞从瓶壁上脱离下来，便于分瓶后继续培养。动物组织分散成单个细胞细胞悬液机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理加培养液培养放入培养瓶在适宜条件中传代培养在适宜条件中分瓶培养

原代培养（6）进行传代培养（分瓶培养）时，如何处理？悬浮细胞:离心法收集贴壁细胞:胰蛋白酶处理，再离心法收集②制成细胞悬液，分瓶培养①收集细胞取动物组织用机械法或用胰蛋白酶或胶原蛋白酶等处理，避免限制生长增值分散成单个细胞解决悬浮生长贴壁生长(大多数）细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏等接触抑制传代培养细胞悬液原代培养分瓶培养①细胞贴壁：某些细胞需要贴附于某些基质表

面才能增殖，这类细胞往往贴附

在培养瓶的瓶壁上②接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接

触时，细胞停止分裂增殖的现象。③原代培养：分瓶前的细胞培养，指动物组织

经处理后的初次培养④传代培养：分瓶后的细胞培养。加培养液放入培养皿或培养瓶内悬浮培养的细胞:直接用离心法收集贴壁细胞:用胰蛋白酶处理分散成单个细胞，用离心法收集细胞分裂受阻②制成细胞悬液，分瓶培养①收集细胞注意：相关酶可使细胞裂解，应注意用量和时间细胞悬浮液10代细胞50代细胞无限增殖保持细胞正常二倍体核型增长缓慢，部分细胞核型改变突破细胞寿限，遗传物质一定改变原代培养传代培养（遗传物质没改变）（遗传物质有的改变）使用或保存的细胞通常为10代以内，以保持细胞正常的二倍体核型(即遗传物质不改变)；少数细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性，这些细胞已经发生了突变，正朝癌细胞发展遗传物质有的改变细胞株细胞系遗传物质改变传代培养一般培养有限代次后，细胞就会死亡，如果细胞不死，就意味着细胞的遗传物质发生了改变，即具有异倍体核型。目前用于冷冻保存的正常细胞通常为10代以内的细胞，以保持细胞正常的二倍体核型。细胞株从原代培养细胞群中筛选出进行传代培养的细胞，能传到10-50代，有部分细胞遗传物质发生了变化。细胞系传到50代后，细胞遗传物质发生了变化，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，可能在培养条件下无限制的传代下去。原代培养传代培养细胞株细胞系遗传物质改变遗传物质有的改变分瓶培养细胞悬浮液10代细胞50代细胞无限传代思考·讨论:不可以；细胞的传代培养一般传至10代后就不易传下去，这时细胞能保持细胞正常的二倍体核型；传至10-50代左右时，增殖会逐渐缓慢，以至于完全停止，这时部分细胞的细胞核型可能会发生变化，这一阶段的细胞称为细胞株；继续传代培养时，少部分细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性，这些细胞已经发生了突变，正在朝着等同于癌细胞的方向发展，这一阶段的细胞称为细胞系，细胞系的遗传物质一定改变了；遗传物质有的改变动物细胞培养与植物组织培养有什么相同和不同之处？动物胚胎或幼龄动物的组织、器官细胞悬浮液胰蛋白酶原代培养传代培养大量细胞单个细胞加培养液离体的植物器官、组织或细胞愈伤组织根、芽植物体脱分化再分化接种至培养基动物细胞培养植物组织培养植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目植物组织培养动物细胞培养原理培养基性质培养基特有成分培养结果培养目的相同点获得细胞或细胞产物常用固体培养基植物体葡萄糖、动物血清常用液体培养基细胞增殖细胞的全能性许多细胞快速繁殖等蔗糖、植物激素1.培养过程中细胞都进行有丝分裂，不涉及减数分裂；2.均需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件随堂检测(1)动物细胞培养体现了动物细胞的全能性(

)(2)培养保留接触抑制的细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞(

)(3)悬浮培养的细胞直接用离心法收集，贴壁细胞需要用胰蛋白酶等处理后再用离心法收集(

)(4)动物细胞培养时，O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH(

)×√1.判断正误×√随堂检测2.一般来说，动物细胞体外培养需要满足以下条件()①无毒的环境②无菌的环境③只使用合成培养基④温度与动物的体温相近⑤因在CO2培养箱中培养，故不需要O2

⑥多数动物细胞培养在7.2～7.4的pH环境A.①②④⑤⑥ B.①②③④C.①②③⑤⑥ D.①②④⑥D随堂检测3.在将动物组织块分散成单个细胞时，可以使用胰蛋白酶。由此判断以下推测不合理的是()A.动物细胞之间可能依靠蛋白质相互联系B.处理时一定要注意处理时间、加酶量C.胰蛋白酶一定不会对动物细胞造成损伤D.动物细胞培养液的pH应与胰蛋白酶作用的适宜pH基本一致C1.干细胞的概念：2.干细胞的分布：

动物和人体内保留的具有分裂和分化能力的细胞。在一定的条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中。3.干细胞的分类：3.干细胞的分类：早期胚胎中具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能体积小，细胞核大、核仁明显。也叫全能干细胞。。胚胎干细胞分布特点应用实例

在体外分化成心肌细胞、神经元细胞和造血干细胞等局限性必须从胚胎中获取，涉及伦理问题；因而限制了在医学上的应用。ES细胞胚胎干细胞简称ES细胞心肌细胞神经细胞造血干细胞分化分化分化体外培养全能干细胞成体组织或器官内造血干细胞（骨髓、外周血和脐带血中）神经干细胞（神经系统中）精原干细胞（睾丸中）具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力成体干细胞分布举例特点应用实例治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病造血干细胞→神经干细胞→治疗细胞损伤造成的疾病发现最早、研究最多的、应用最成熟的实例成体干细胞造血干细胞血细胞和各种免疫细胞神经系统中神经干细胞精原干细胞神经细胞精原细胞骨髓、外周血和脐带血中睾丸中分化分化分化多能干细胞专能干细胞干细胞有着自我更新能力及分化的潜能，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关，因而在医学上有着广泛的应用正常干细胞患者体内受损的器官或组织治愈疾病修复或替换移植4.干细胞的应用：正常造血干细胞患者体内受损的血细胞白血病修复或替换移植造血系统、免疫系统功能障碍疾病正常神经干细胞患者体内受损的神经组织修复或替换移植治疗治疗神经组织损伤和神经退行性疾病（帕金森病/阿尔茨海默）实例：干细胞可以治疗某些顽症的原理:干细胞可以被诱导分化形成新的组织细胞，经移植可使坏死或退化部位得以修复并恢复正常功能面临的问题：存在导致肿瘤发生的风险【学生活动】科学家是怎样获得iPS细胞的？iPS细胞是如何应用于治疗人类疾病？这种细胞与胚胎干细胞相比，有哪些应用优势？胚胎干细胞必须从胚胎中获取，这涉及伦理问题，因而限制了它在医学上的应用。5.诱导多能干细胞【资料】2006年，科学家通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，将它称为诱导多能干细胞（简称iPS细胞），并用iPS细胞治疗了小鼠的镰状细胞贫血。5.诱导多能干细胞通过体外诱导小鼠成纤维细胞得到的类似胚胎干细胞的一种细胞①将特定基因或特定蛋白导入细胞

（成纤维细胞、已分化的T细胞、B细胞）诱导多能干细胞概念制备方法应用优点②用小分子化合物诱导形成。①诱导过程无须破坏胚胎；②iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。iPS细胞可治疗镰状细胞贫血症；在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展因此，普遍认为iPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞iPS细胞的诱导及其流程病人各种类型的细胞导入特定基因导入特定蛋白小分子化合物成纤维细胞T细胞B细胞iPS细胞分化取出移植移植取成纤维细胞等iPS细胞转入相关因子细胞发生转化(类似脱分化的过程)分化胰岛细胞神经元血细胞肠上皮细胞心肌细胞肝细胞病人iPS细胞用于治疗人类疾病示意图诱导多能干细胞的应用：取成纤维细胞转入相关因子细胞转化为iPS细胞诱导iPS细胞定向分化为多种组织细胞移植回病人体内定向诱导分化你如何看待干细胞在临床上的应用所产生的效益与风险？干细胞的研究正在如火如荼地开展。虽然干细胞用于临床治疗还面临一些问题，如存在导致肿瘤发生的风险，但是我们相信，随之理论和技术的不断完善，干细胞将在再生医学、药物安全性与有效性检测等领域发挥大作用。

来源或存在功能、特点局限性胚胎干细胞(ES细胞)成体干细胞诱导多能干细胞(iPS细胞)早期胚胎能够分化成为动物体内的任何细胞，并进一步形成组织、器官甚至生物个体成体组织或器官，如造血干细胞、神经干细胞和精原干细胞等体外诱导体细胞产生能分化成为具有特定功能的细胞来治疗疾病。无须破坏胚胎，且避免免疫排斥反应。具有组织特异性，能分化成特定的细胞或组织不具有发育成完整个体的能力需从胚胎中获取，涉及伦理问题，限制了它在医学上的应用技术不成熟。细胞类型胚胎干细胞(ES细胞)成体干细胞造血干细胞神经干细胞精原干细胞来源早期胚胎骨髓、外周血和脐带血神经系统睾丸作用分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，具有进一步形成机体、所有组织和器官甚至个体的潜能只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力特异性不具有组织特异性具有组织特异性应用有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关，因而在医学上有着广泛的应用将正常的造血干细胞移植到病人体内，恢复病人的造血和免疫功能，已成为治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病的一种重要手段神经干细胞在治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病(如帕金森病、阿尔茨海默病等)方面有重要的应用价值无菌、无毒营养温度、pH和渗透压气体环境制备细胞悬液原代培养传代培养动物细胞培养动物细胞培养的条件动物细胞培养的过程干细胞的培养和应用干细胞的种类、特点及应用iPS细胞的培养和应用小结(1)干细胞都是来源于早期胚胎

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）(2)iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，可以避免免疫排斥反应

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